?ICS07.080

CCSA40

中華人民共和國國家標準

GB/T40170—2021

質粒抽提及檢測通則

Principleofplasmidextractionandtesting

2021-05-21發布

2021-12-01實施

GB/T40170—2021

本文件按照GB/T1.1—2020((標準化工作導則第1部分:標準化文件的結構和起草規則》的規定起草。

本文件由全國生化檢測標準化技術委員會(SAC/TC387)提出并歸口。

本文件起草單位：中國測試技術研究院生物研究所、通用生物系統(安徽)有限公司、深圳市分析測試協會、甘肅中商食品質量檢驗檢測有限公司、深圳市第二人民醫院、成都市食品藥品檢驗研究院、甘肅省商業科技研究所有限公司。

本文件主要起草人：周李華、雍金貴、王利娜、喻明軍、崔康樂、馬麗俠、駱曉文、蔣子敬、王維坤、顧大勇、葉德萍、楊杰、何海寧。

質粒抽提及檢測通則

1范圍

本文件規定了質粒抽提及檢測的術語和定義、縮略語、原則、抽提、檢測、質量控制、樣品保存、報告及廢棄物處理。

本文件適用于質粒的抽提及檢測。

2規范性引用文件

下列文件中的內容通過文中的規范性引用而構成文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件;不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB4789.3食品安全國家標準食品微生物學檢驗大腸菌群計數

GB/T19495.1轉基因產品檢測通用要求和定義

GB/T19495.2轉基因產品檢測實驗室技術要求

GB/T27403實驗室質量控制規范食品分子生物學檢測

GB/T34265Sanger法測序技術指南

GB/T34796水溶液中核酸的濃度和純度檢測紫外分光光度法

3術語和定義

下列術語和定義適用于本文件。

3.1

質粒plasmid

細菌、酵母菌和放線菌等生物中染色體（或擬核）以外的一個或多個閉合環狀的雙鏈DNA分子。注：存在于細胞質中，具有自主復制能力，能使其在子代細胞中也能保持恒定的拷貝數.并表達所攜帶的遺傳信息。

3.2

核糖核酸酶ARNaseA

一種催化水解核糖核酸的核糖部分3'和5'磷酸二酯鍵，形成具有2'，3'-環一磷酸衍生物寡聚核苷酸的核酸酶。

3.3

細菌內毒素bacterialendotoxin

由親水性的雜多糖和一個共價結合的類脂A組成的復合物。

注：該復合物位于革蘭陰性菌細胞壁上，在細菌破裂或分解時釋放，可降低細胞轉染率，導致機體發熱、低血汛、呼吸窘迫、血管內凝血及內毒素性休克綜合征。

4縮略語

下列縮略語適用于本文件。

DNA:脫氧核糖核酸（DeoxyribonucleicAcid）

1

庫七七標準下載

GB/T40170—2021

DNase：脫氧核糖核酸酶(Deoxyribonuclease)

HPLC:高效液相色譜(HighPerformanceLiquidChromatography)

RNA:核糖核酸(RibonucleicAcid)

5一般性原則

質粒作為基因工程重組技術的常用載體，質粒的質量(濃度、構型、純度、內毒素含量)是蛋白表達、細胞轉染效率的關鍵。獲得高純度的質粒，需要實驗者理解質粒提取原理，針對不同菌種、不同性質和大小的質粒，選用恰當的方法，有效地控制提取過程中的各種影響因素。

6抽提原理

利用離子去污劑、強堿等試劑裂解宿主細胞，使得質粒從細胞中釋放出來，再棄除質粒中的蛋白、基因組DNA等雜質，經異丙醇或乙醇沉淀DNA，最終得到純化質粒。

7抽提方法

7.1抽提方法的選擇

7.1.1影響因素

質粒抽提時應結合菌種以及含有的質粒的特性、實際應用等綜合選擇抽提方法和試劑，可考慮包括但不限于以下因素：

一大質粒在抽提過程中容易受損，宜用溫和裂解法，操作輕柔，最大程度緩沖高滲透壓的細菌質粒釋放時的壓力；

一小分子質量質粒可以選用相對較劇烈的方法來分離；

-一些菌株用去污劑或加熱裂解時可釋放較多的糖類，這類菌株制備質粒時，需注意裂解溫度；—具有限制性核酸內切酶A的菌株建議采用酚-氯仿進行抽提；

一在細菌繁殖的對數生長期中期加人氯霉素可以增加質粒的拷貝數。

7.1.2抽提方法分類及特點

根據抽提原理，可將質粒抽提方法分為四類，即硅膠柱法、磁珠法、酚-氯仿法和離子交換法。基本原理及特點見表1。

表1幾種質粒抽提原理及特點

方法

原理

特點

硅膠柱法

高鹽條件下，硅膠與DNA分子有高親和力，低鹽或雙蒸水洗脫DNA

適用于高通量質粒小量抽提

磁珠法

采用一種納米磁珠微珠材料，該磁珠經硅羥基修飾后，

DNA分子可與之發生特異性結合

適用于微量樣品的提取，效率高.便于自動化操作

酚-氯仿法

酚使蛋白質變性并抑制DNase活性，氯仿去除過量酚、利于有機相與液相分層，異丙醇具有強疏水作用，用于沉淀DNA

質粒:三級結構完整，適用于高質量質粒抽提

#

庫七七標準下載

GB/T40170—2021

表1（續）

方法

原理

特點

離子交換法

低鹽低pH條件下，DNA與離子交換劑結合，高鹽高pH條件下洗脫DNA

適用于大規模質粒抽提，超螺旋比例高

7.2操作步驟

7.2.1硅膠柱法

硅膠柱法抽提操作步驟按照商業吸附柱抽提試劑盒說明書進行。

7.2.2磁珠法

磁珠吸附法抽提操作步驟按照商業磁珠法抽提試劑盒說明書進行。

7.2.3酣-氯仿法

酹-氯仿法抽提操作步驟按照附錄A進行。

7.2.4離子交換法

離子交換法抽提操作步驟按照附錄B進行。

8檢測

8.1檢測項目

質粒的檢測包括液體外觀、序列驗證、濃度測定、純度檢測、超螺旋比例檢測、殘余RNA和殘余基因組DNA檢測、細菌內毒素檢測、限制酶酶切分析、細菌檢測等項目，根據不同的項目采用不同的檢測方法。

8.2檢測項目的選擇

根據試驗用途，選擇不同的檢測項目。一般用于分子克隆、測序、定點突變、印跡雜交、文庫構建、探針合成、轉染或轉化等建議對質粒濃度、純度、超螺旋程度、殘余RNA、殘余基因組DNA檢測和限制酶酶切分析。用于轉染試驗（哺乳動物細胞）、病毒傳導、CAR-T等細胞治療相關病毒載體的生產制備、基因疫苗和基因治療研究、抗體或蛋白生產、動物學研究等宜增加內毒素檢測和細菌檢測試驗。

8.3檢測方法

8.3.1液體外觀

肉眼觀察，參考結果見附錄C。

8.3.2序列驗證

按照GB/T34265執行，對質粒進行序列測定，參考結果見附錄C。

8.3.3濃度測定

按照GB/T34796執行，參考結果見附錄C。

3

8.3.4純度檢測

按照GB/T34796執行,OD2?/OD280在1.8至2.0之間,OD2W/OD230在2.0至2.5之間，瓊脂糖凝膠電泳法檢測無其他雜帶，肉眼可見，可用于后續試驗。參考結果見附錄C。

8.3.5超螺旋比例

米用高效液相色譜法檢測質粒超螺旋比例，利用超螺旋質粒和RNA，基因組DNA碎片的疏水性質的差異，將待測樣超螺旋質粒和其余DNA.RNA分離。方法、設備運行參數按照附錄D執行.根據檢測結果計算目標峰面積占所有峰面積的比值。參考結果見附錄C。

8.3.6殘余RNA、殘余基因組DNA的檢測

采用瓊脂糖凝膠電泳法對殘余RNA、殘余基因組DNA進行檢測，肉眼可見，且限制酶酶切分析后不消失。參考結果見附錄C。

8.3.7細菌內毒素檢測

采用鱟試劑檢測法檢測細菌內毒素，檢測方法見中華人民共和國藥典：2020年版.四部，細菌內毒素檢查法。參考結果見附錄C。

8.3.8限制酶酶切分析

質粒用限制性酶酶切后，進行瓊脂糖凝膠電泳分析，參考結果見附錄C。

8.3.9細菌檢測

按照GB4789.3中的大腸菌群計數-平板計數法進行，同時以涂布生理鹽水平板為對照，無菌落生長。參考結果見附錄C。

9質量控制

9.1人員

質粒抽提和檢測技術人員應由具備分子生物學、微生物學及相關教育背景的人員擔任。

涉及質粒抽提及檢測的技術人員應該完全了解菌種培養的相關工作，應掌握質粒檢測等相關理論知識和相關試驗基礎。

檢測人員應該接受適當的內部或者外部培訓，培訓的內容應該包括但是不限于：

—菌種培養技術，包括無菌實驗室操作技能；

—掌握質粒分子生物學特性；

環境控制；

定期進行人員的測量能力考核。

9.2儀器設備

檢測儀器應符合預期要求的性能參數和規格。

儀器設備的使用應嚴格按照標準操作程序進行操作。主要分析設備的操作規程應制定得詳細、清楚。

定期對儀器設備進行檢測或校準。

4

9.3試劑

質粒抽提及檢測涉及的相關試劑需從具備專業資質并經過驗證核實的供應商處采購，且具備檢驗合格證明文件。

檢測試劑應嚴格按照使用方法正確使用。

檢測試劑的使用應具有嚴格的文件記錄制度，包括試劑的標識、使用時間等信息。

9.4實驗室通用要求

應滿足生物安全一級(BSL-1)實驗室要求，遵循分區明確、單一流向、因地制宜、方便使用的原則，避免交叉污染。

實驗室DNA污染一般來源于氣溶膠。因此，質粒抽提和檢測以及實驗室工作區域的組織及良好的試驗操作應基于：

——嚴格的工作流程；

——樣品的“單向流動”原則，具體要求應符合GB/T19495.1中的規定。

10樣品保存

質粒貯存于一20°C冰箱，避免反復凍融。長期保存建議放置一80°C超低溫冰箱。

11報告

質粒抽提后應附抽提和檢測報告單或等同的指導性文件，格式見附錄E。文件內容應至少包括以下部分：

a)

名稱；

b)

總量；

c)

外觀；

d)

濃度；

e)

OD260/OD280;

f)

OD260/OD230;

g)

超螺旋比例；

h)

RNA殘留；

i)

基因組DNA殘留；

J)

細菌檢測；

k)

細菌內毒素檢測；

1)

測序；

m)

限制酶酶切分析；

n)

標簽；

o)

保存條件及期限。

12廢棄物處理

廢棄物處理按照GB/T27403和GB/T19495.2中的規定執行。

附錄A

(規范性)

酚-氯仿法

A.1試驗試劑

A.1.1葡萄糖(Glucose，C6H12O6)。

A.1.2三輕甲基氨基甲焼［Tris(hydroxymethyl)methylaminomethaneTHAM,Tris,C4HuNO3］。

A.1.3鹽酸(Hydrochloricacid,HC1)。

A.1.4乙二胺四乙酸二衲(Ethylenediaminetetraaceticaciddisodiumsalt,Na2EDTA.,Ci()H14N2Na20s)。

A.1.5核糖核酸酶A(RNaseA)o

A.1.6氫氧化衲(Sodiumhydroxide,NaOH)0

A.1.7十二焼基硫酸衲(Sodiumdodecylsulfate,SDS,Ci2H25SO4Na)。

A.1.8醋酸鐘(Potassiumacetate,CH3COOK)o

A.1.9冰醋酸(AceticAcid,CH3COOH)。

A.1.10鹽酸胍(GuanidineHydrochloride,Gu-HCl,CH6C1N3)?

A.1.11乙醇(Ethanol,C2H6O)o

A.1.12異丙醇(Isopropanol，C3H8?)。

A.1.13苯酚(Phenol，C6H5OH)。

A,1.14三氯甲垸(Trichloromethane，氯仿,CHC13)。

A.1.15異戊醇(Isoamylalcohol,3-甲基丁醇，C5H12O)a

A.1.16磁珠懸浮液(內含特異性吸附質粒的磁珠)。

A.1.17溶液l(pH8.0):50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris-Cl,10mmol/LEDTA,100pig/mLRNaseA。

A.1.18溶液2:200mmol/LNaOH，1%SDS。

A.1.19溶液3(pH5.5)：3mol/L醋酸鉀。

A.1.20BufferW2：20mmol/LTris-Cl,75%乙醇。

A.1.21TE溶液(PH8.0)：10mmol/LTris-Cl,1mmol/LEDTA。

A.1.22 75%乙醇溶液(C,H5OH)o

A.1.23RNaseA溶液，10mg/mL，一20°C保存，避免反復凍融。

A.2操作步驟

A.2.1分步收集2mL?4mL菌液到2mL離心管中,12000r/min,離心1min，棄上清。

A.2.2向離心管中加人250溶液1(已加人RNaseA)，渦旋振蕩使細胞重懸。

A.2.3向離心管中加人250mL溶液2,溫和翻轉離心管6次?10次，使菌體充分裂解，液體變得澄清。

A.2.4向離心管中加人350yL溶液3,溫和翻轉離心管6次?10次，此時可觀察到管內出現白色絮狀物,12000r/min室溫離心10min。

A.2.5取上清于新的2.0mLEP管中，并記錄體積。

6

庫七七標準下載

GB/T40170—2021

A.2.6加等體積的苯酚/氯仿溶液，充分振蕩混勻，12000r/min離心10min。

A.2.7重復A.2.6。

A.2.8小心吸取上清于新的2.0mLEP管中，加等體積的異丙醇混勻，12000r/min離心10mino

A.2.9小心棄去上清。

A.2.10加人1mL75%乙醇清洗沉淀，12000r/min離心1min,棄去上清。

A.2.11置于超凈工作臺將殘留乙醇吹干，加50mL~100ddH2O溶解，一20°C保存。

7

庫七七標準下載

GB/T40170—2021

附錄B

（規范性）

離子交換法

B.1試驗試劑

B.1.1葡萄糖(Glucose，C6H12O6)o

B.1.2三輕甲基氨基甲焼［Tris(hydroxymethyl)methylaminomethaneTHAM，Tris，Cd NO3］o

B.1.3鹽酸(Hydrochloricacid,HC1)。

B.1.4乙二胺四乙酸二納(Ethylenediaminetetraaceticaciddisodiumsalt，Na2EDTA，Ci。H14N2Na2O8)。

B.1.5核糖核酸酶ACRNaseA)o

B.1.6氫氧化鈉(Sodiumhydroxide,NaOH)o

B.1.7十二垸基硫酸衲(Sodiumdodecylsulfate,SDS,Ci2H25SO4Na)。

B.1.8醋酸鉀(Potassiumacetate,CH3COOK)o

B.1.9冰醋酸(AceticAcid，CH3COOH)。

B.1.10鹽酸狐(GuanidineHydrochloride,Gu-HCI,CH6C1N3)。

B.1.11乙醇(Ethanol，C2H6O)o

B.1.12氯化衲(Sodiumchloride,NaCl)。

B.1.13 3-(N-嗎啉基)丙磺酸(MOPS，C7H15NO4S)。

B.1.14聚乙二醇辛基苯基醚［TritonX-100，C14H22O(C2H4O)ti］。

B.1.15異丙醇(Isopropanol,C3H8O)。

B.1.16BufferPl(pH8.0):50mmol/LTris-Cl,10mmol/LEDTA,100yg/mLRNaseAo

B.1.17BufferP2：200mmol/LNaOH，l%SDS。

B.1.18BufferP3(pH5.5)：3mol/L醋酸鉀。

B.1.19BufferQBT(pH7.0)：750mmol/LNaCl,50mmol/LMOPS,0.15%TritonX-100。

B.1.20BufferQC(pH7.0):1.0mol/LNaCl，50mmol/LMOPS,15%異丙醇。

B.1.21BufferQF(pH8.5):1.25mol/LNaCl，50mmol/LMOPS,15%異丙醇。

B.1.22TE溶液(pH8.0):10mmol/LTris-Cl,lmmol/LEDTA。

B.2操作步驟

B.2.1從轉化的細菌平板中挑取單菌落，接種到4mL液體培養基(含相應的抗生素)，37°C,220r/min培養6ho

B.2.2取100mL上述菌液接種到300mL選擇性培養基中，37°C,220r/min,培養16h。

B.2.3收集B.2.2中菌液于500mL離心杯中,4°C,8000g離心10min。

B.2.4棄上清，并倒扣在吸水紙上，加人30mL，4°C預冷的BufferPl(已加人RNaseA)，反復吹打沉淀直至完全混勻。

B.2.5加人30mL細胞裂解液BufferP2,輕柔地上下顛倒混勻4次?6次，在室溫下孵育時間不要超過5mino

B.2.6加人30mL預冷的BufferP3,立即顛倒混勻6次?8次(動作要輕柔)，在冰上孵育10min,

4°C,8000g離心20mino

B.2.7在層析柱的頂端加濾紙，沿濾紙邊緣緩慢加人20mL的BufferQBT(平衡層析柱)。

B.2.8將B.2.6中的上清小心移到層析柱中(不可將沉淀繞動)，讓液體自由流下。

8

庫七七標準下載

GB/T40170—2021

B.2.9加人20mLBufferQC清洗層析柱一次。

B.2.10加人20mLBufferQF洗脫DNA，準備對應的50mL的離心管分別收集洗脫液。

B.2.11加入0.7倍體積異丙醇，上下顛倒混勻，在冰上孵育30mm以上。

B.2.12 4°C,8000g離心20min。

B.2.13小心棄去上清。注意：不要將沉淀倒掉。

B.2.14加人2mL75%乙醇清洗沉淀，4°C,8000g離心10min，棄上清。

B.2.15重復B.2.14。

B.2.16置于超凈工作臺將殘留乙醇吹干，加人500 的TE溶液或滅菌水溶解DNA。

附錄C

（資料性）

質粒檢測參數及參考結果

質粒檢測參數及參考結果見表C.1。

表C.1質粒檢測參數及參考結果一覽表

檢測項目

參考結果

液體外觀