1、神經(jīng)元胞外基質(zhì)網(wǎng)絡在脊髓損傷修復作用中的研究進展脊髓損傷（SCI）會導致?lián)p傷水平以下自主神經(jīng)元損傷，運動和感覺的障礙，腸、膀胱等功能的喪失，交通事故和外傷是導致該病發(fā)生的主要原因，隨著老齡化社會的發(fā)展，椎管狹窄、自發(fā)性壓迫性脊髓損傷患病率不斷增加，也會導致脊髓損傷發(fā)病率進一步上升。一般來說，脊髓損傷后可出現(xiàn)神經(jīng)元死亡，脫髓鞘，軸突變性，炎癥，神經(jīng)膠質(zhì)瘢痕形成和囊性空化等病理現(xiàn)象，并能引起神經(jīng)網(wǎng)絡破壞、重組等一系列可塑性變化，從而導致神經(jīng)信號傳導中斷和神經(jīng)功能喪失。Holmes最新研究認為：隨著對中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）損傷部位微環(huán)境作用的理解逐步加深，有可能找到改善中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)再生的方法：一

2、方面，可以通過干擾受損神經(jīng)元的內(nèi)部調(diào)節(jié)途徑，重新啟動神經(jīng)元固有的再生途徑；另一方面，改善脊髓損傷神經(jīng)局部微環(huán)境，從而消除抑制神經(jīng)軸突再生的分子因素，減少炎性浸潤，促進損傷后神經(jīng)功能的恢復。以往研究主要側(cè)重于神經(jīng)元固有抑制因子對脊髓損傷后功能恢復的影響，而忽略了神經(jīng)元外環(huán)境在脊髓損傷后功能恢復中的作用。目前越來越多的學者研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)元外環(huán)境對脊髓損傷的功能恢復同樣重要。神經(jīng)元胞外基質(zhì)網(wǎng)絡（PNNs）是由中樞神經(jīng)系統(tǒng)細胞外基質(zhì)組成的重要神經(jīng)元外環(huán)境之一，由細胞外基質(zhì)和不同的糖胺聚糖，蛋白聚糖（PG）在某些神經(jīng)元周圍凝結(jié)形成，在穩(wěn)定細胞微環(huán)境、維持神經(jīng)元性能、保護神經(jīng)元免受有害物質(zhì)影響等方面起到了

3、重要的作用，同時也參與調(diào)節(jié)多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)病機制。在脊髓損傷模型中，PNNs高度結(jié)構(gòu)化，包裹在細胞外構(gòu)成了神經(jīng)元和細胞外之間的物理屏障，阻礙神經(jīng)恢復，而使用酶法去除PNNs可促進脊髓損傷后功能恢復。在脊髓損傷繼發(fā)性病變的產(chǎn)生和治療效應的過程中，如何促進脊髓神經(jīng)軸突的再生以及如何減弱損害神經(jīng)再生的炎性反應，一直是脊髓神經(jīng)損傷修復研究領(lǐng)域亟待解決的問題。本文論述了PNNs的組成以及它們在脊髓損傷后神經(jīng)再生與神經(jīng)炎癥中的影響及潛在治療應用。神經(jīng)元胞外基質(zhì)網(wǎng)絡的組成及特征神經(jīng)元胞外基質(zhì)網(wǎng)絡的組成PNNs被發(fā)現(xiàn)以來，近幾十年來，不斷有學者對其可視化、顯微解剖結(jié)構(gòu)、組成以及與神經(jīng)功能相關(guān)性等方面進行

4、了廣泛的研究，發(fā)現(xiàn)大腦和脊髓中的PNNs由相同的分子組成，脊髓腹角中約30的運動神經(jīng)元，中央灰質(zhì)中50的大中性神經(jīng)元和背角中20神經(jīng)元的周圍存在PNNs。目前已知的PNNs主要組成包括硫酸軟骨素蛋白聚糖（CSPG），透明質(zhì)酸（HA），連接蛋白（Crtl1）和肌糖蛋白（TN）。其中，CSPG包括Lecticans家族，即聚集蛋白聚糖（aggre-can），多功能蛋白聚糖（versican），神經(jīng)蛋白聚糖（neurocan），短小蛋白聚糖（brevican），磷酸酶蛋白聚糖（phosphacan），硫酸軟骨素蛋白聚糖2（NG2）等多種類型。聚集蛋白聚糖存在于所有的PNNs中，而神經(jīng)蛋白聚糖、多功能

5、蛋白聚糖、硫酸軟骨素蛋白聚糖2和磷酸酶蛋白聚糖僅存在于部分PNNs中。神經(jīng)元胞外基質(zhì)網(wǎng)絡主要組成的特征透明質(zhì)酸透明質(zhì)酸是由數(shù)百個重復的二糖亞基組成的聚合物，并且是PNNs中惟一不被硫酸化或未結(jié)合到蛋白核心的糖胺聚糖。透明質(zhì)酸由透明質(zhì)酸合酶（HAS）直接在細胞外空間形成，它存在3種透明質(zhì)酸合酶異構(gòu)體（透明質(zhì)酸合酶1、透明質(zhì)酸合酶2、透明質(zhì)酸合酶3，即分別為HAS1、HAS2、HAS3），它們合成各種長度和速度不同的透明質(zhì)酸鏈，而HAS1和HAS2快速產(chǎn)生可達2000kDa的透明質(zhì)酸長鏈，而HAS3則以慢速產(chǎn)生透明質(zhì)酸短鏈。3種透明質(zhì)酸合酶均在核周圍表達，而脊髓的神經(jīng)元則表達HAS1和HAS3，但

6、HAS3是成熟脊髓中惟一鑒定出的亞型。分解HA后導致PNNs缺失，表明HA在維持PNNs結(jié)構(gòu)完整性中發(fā)揮重要作用。硫酸軟骨素蛋白聚糖硫酸軟骨素蛋白聚糖由兩個核心蛋白域組成：C末端的全局域G3和N末端的一個或兩個全局域（G1和G2），G1結(jié)構(gòu)域包含一個免疫球蛋白和兩個重復的蛋白聚糖；G2域僅在聚集蛋白中發(fā)現(xiàn)，包含兩個重復的PG，G1結(jié)構(gòu)域中的重復蛋白聚糖可以通過連接蛋白與HA結(jié)合。有研究發(fā)現(xiàn)，脊髓損傷部位CSPG表達增加，通過軟骨素酶分解CSPG后，能有效促進軸突再生和神經(jīng)元修復。肌糖蛋白肌腱蛋白家族由4種不同的糖蛋白組成，但迄今為止，在神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞中僅觀察到肌糖蛋白R（TnR）和肌糖蛋

7、白C（TnC）兩種糖蛋白。在翻譯后加工過程中的變化和基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）的活性的影響下，肌糖蛋白高度異質(zhì)。肌糖蛋白C具有由兩個均三聚體組成的四元結(jié)構(gòu)，從而形成六聚體，TnR同時形成同二聚體和同三聚體。三聚體肌糖蛋白R和肌糖蛋白C與硫酸軟骨素蛋白核心蛋白的c端結(jié)構(gòu)域結(jié)合，形成有組織的PNNs主鏈。連接蛋白連接蛋白在透明質(zhì)酸和硫酸軟骨素蛋白聚糖的G1凝集素結(jié)構(gòu)域之間形成非共價連接，阻止了凝集素擴散到細胞外基質(zhì)中。連接蛋白家族由Crtl1、Crtl2、Crtl4、Bral2，4種不同的蛋白質(zhì)組成，其中，Crtl1和Crtl4在被PNNs包圍的神經(jīng)元中表達，而Crtl2不僅在少突膠質(zhì)細胞中表達，同

8、時也存在于PNNs中。Kwok等研究表明，在人胚腎細胞（HEK）模型中，Crtl1在HAS3表達細胞中的過表達會形成彌散的細胞外基質(zhì)，從而形成致密的細胞外基質(zhì)網(wǎng)絡，提示Crtl1對PNNs形成具有重要作用；在對Crtl1基因敲除小鼠細胞培養(yǎng)的研究中也再次驗證了Crtl1在PNNs形成中的重要性。神經(jīng)元胞外基質(zhì)網(wǎng)絡對脊髓損傷修復的影響一項系統(tǒng)定量的研究表明PNNs結(jié)構(gòu)并非靜態(tài)的，在發(fā)育中及脊髓損傷后PNNs數(shù)量和組成會發(fā)生變化，即為了保護和維持神經(jīng)生長，也限制了損傷后神經(jīng)修復，且目前仍沒有完全有效的方法干預脊髓損傷后脊髓神經(jīng)網(wǎng)絡的重組和可塑性變化。神經(jīng)元胞外基質(zhì)網(wǎng)絡對脊髓損傷后軸突再生的影響在中

9、樞神經(jīng)系統(tǒng)中，軸突再生主要以軸突萌芽和突觸形成為特征，脊髓損傷后神經(jīng)功能障礙主要是由于損傷后引起的軸突中斷，因此保留殘余軸突并促進軸突修復和再生是脊髓損傷神經(jīng)修復的重要步驟。然而，成年哺乳動物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)軸突在損傷后難以自行再生，其中阻礙脊髓損傷后軸突再生的外源性機制包括促生長分子的相對缺乏或在損傷環(huán)境中生長抑制分子的大量表達。脊髓損傷后314d損傷部位突觸周圍細胞外基質(zhì)表達逐漸上調(diào)，神經(jīng)周圍神經(jīng)網(wǎng)絡高度聚集并遷移到病變部位，形成膠質(zhì)瘢痕阻礙軸突的再生。凋亡和壞死的細胞釋放出大量的警報蛋白啟動一系列炎癥信號傳導，對改變后的微環(huán)境迅速做出反應，在炎性環(huán)境中，CSPG、TNR等分泌增加，形成抑制

10、性化學屏障，同時，炎癥反應過程中釋放的細胞因子會損害少突膠質(zhì)細胞和神經(jīng)纖維，導致軸突的脫髓鞘，限制軸突的再生。硫酸軟骨素蛋白聚糖對脊髓損傷后軸突再生的影響硫酸軟骨素蛋白聚糖上調(diào)已在損傷后神經(jīng)膠質(zhì)瘢痕的病理學主要成分中進行了廣泛研究。研究表明：脊髓損傷后PNNs中的CSPG表達上調(diào)并逐漸向損傷部位遷移，損傷后第2周達到高峰后保持長期上調(diào)，與星形膠質(zhì)細胞、小膠質(zhì)細胞、巨噬細胞形成神經(jīng)膠質(zhì)瘢痕。CSPG可通過神經(jīng)再生抑制劑受體蛋白酪氨酸磷酸酶受體（PTP）和白細胞共同抗原相關(guān)的蛋白酪氨酸磷酸酶（LAR），調(diào)控RhoROCK通路，抑制Akt和Erk12磷酸化介導的激活GTPase受體信號通路，導致生長

11、椎塌陷，從而抑制軸突的生長。CSPGPTP相互作用還可以通過抑制自噬體溶酶體融合來調(diào)節(jié)軸突生長錐處的自噬通量，從而影響脊髓損傷后軸突的再生。并且在脊髓損傷后，抑制PTP或LAR信號后的確有助于增強脊髓損傷后軸突的再生。大量研究已經(jīng)證明抑制CSPG后可促進脊髓損傷后軸突的再生，2002年Bradbury等首次發(fā)現(xiàn)在大鼠SCI模型中通過硫酸軟骨素酶ABC（ChABC）降解CSPG可改善軸突生長。之后，這一結(jié)果也得到了其他學者驗證。有研究發(fā)現(xiàn)，在聯(lián)合治療策略中，在受損脊髓部位持續(xù)注入ChABC酶1周后接受神經(jīng)干細胞移植，移植的神經(jīng)干細胞成功整合遷移到脊髓并分化為少突膠質(zhì)細胞，骨髓基質(zhì)干細胞（BMSC

12、s）聯(lián)合ChABC酶可促進神經(jīng)纖維再生。可見，分解CSPG可以優(yōu)化脊髓損傷后神經(jīng)干細胞移植治療策略，促進軸突的完整性和可塑性。肌糖蛋白對脊髓損傷后軸突再生的影響發(fā)育中的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中肌糖蛋白TNC可促進神經(jīng)前體的增殖和遷移、軸突的延伸和生長錐的形成，成熟軸突中TNC結(jié)合特定的異二聚體整聯(lián)蛋白受體91整合素，也可促進神經(jīng)突增生和軸突再生。成年小鼠TNC基因敲除后，在脊髓損傷中較正常小鼠出現(xiàn)更嚴重的皮質(zhì)脊髓束軸突消退和死亡。而TNC同家族的TNR不同，脊髓損傷后損傷部位TNR表達上調(diào)阻礙軸突的修復和再生。研究顯示，采用局部給藥TNR多克隆抗體，透過破壞的血脊髓屏障持續(xù)滲透入損傷脊髓組織，阻斷TNR

13、所導致的RhoA信號的激活，可以促進軸突生長。Apostolova等曾通過對TNR基因敲除鼠的研究發(fā)現(xiàn)，脊髓損傷后TNR可以阻礙運動神經(jīng)元與其他神經(jīng)元重建突觸聯(lián)系，從而限制了脊髓損傷后運動功能的恢復。一項關(guān)于脊髓損傷大鼠接受TNC、TNR誘導的人骨髓源性多能祖細胞注射治療的研究顯示：TNC誘導組可顯著增強微管相關(guān)蛋白2（MAP2），III微管蛋白和神經(jīng)生長因子（NGF）的mRNA表達，而TNR誘導組沒有明顯促進作用。確切完整的機制仍不清楚，尚待進一步闡明。由上可見，TNC是脊髓損傷后神經(jīng)再生所必需的，而TNR和CSPG與脊髓損傷后神經(jīng)修復及功能恢復呈負相關(guān)。神經(jīng)元胞外基質(zhì)網(wǎng)絡對脊髓損傷后髓鞘形

14、成的影響脊髓損傷后中樞神經(jīng)系統(tǒng)的髓鞘細胞少突膠質(zhì)細胞被破壞、死亡，發(fā)生脫髓鞘現(xiàn)象。髓鞘再生主要通過少突膠質(zhì)細胞前體細胞增殖、遷移至病變部位，在損傷后分化為髓鞘少突膠質(zhì)細胞來實現(xiàn)，但是內(nèi)源性少突膠質(zhì)前體細胞分化能力有限，此外，有許多與髓磷脂相關(guān)的抑制因子被認為是促進中樞神經(jīng)系統(tǒng)再生的關(guān)鍵機制，PNNs中的CSPG、HA還抑制少突膠質(zhì)細胞前體細胞的存活、整合和遷移分化，進一步阻礙脊髓損傷后再髓鞘化。研究顯示，CSPG可激活PTP受體和下游的RhoROCK途徑，誘導神經(jīng)前體細胞和少突膠質(zhì)前體祖細胞群體的凋亡，并限制少突膠質(zhì)前體細胞向少突膠質(zhì)細胞分化、成熟和再髓鞘化。阻斷PTP信號后可有效逆轉(zhuǎn)CSPG

15、對少突膠質(zhì)前體細胞caspase3依賴性細胞死亡的抑制作用，促進內(nèi)源性前體細胞分化成少突膠質(zhì)細胞，減弱caspase3介導的成熟少突膠質(zhì)細胞死亡并保留髓磷脂。另外，RNAi介導的PTP下調(diào)能夠逆轉(zhuǎn)CSPG對少突膠質(zhì)細胞分化和髓鞘形成的抑制作用，并且體外實驗中，將少突膠質(zhì)細胞中PTP受體敲除后的培養(yǎng)物中，CSPG對髓鞘形成的抑制作用也顯著降低，增加了少突膠質(zhì)細胞分化和髓鞘形成。最近，研究者嘗試其將人胚胎干細胞衍生神經(jīng)干細胞包裹在透明質(zhì)酸基水凝膠中，發(fā)現(xiàn)可以增加細胞向少突膠質(zhì)細胞的分化，并改善其運動功能，發(fā)現(xiàn)利用透明質(zhì)酸是提高脊髓損傷大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)活力和分化的良好選擇。因此，PNNs中的HA、C

16、SPG也是構(gòu)成髓鞘形成的重要抑制因子。神經(jīng)元胞外基質(zhì)網(wǎng)絡對脊髓損傷后神經(jīng)炎癥的影響神經(jīng)炎癥不僅會加重損傷部位的疼痛感，還會造成炎癥病灶處實質(zhì)細胞的變性、壞死和代謝功能異常，減少受傷中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥可以改善神經(jīng)元的再生。所以，減少脊髓損傷后繼發(fā)性炎癥反應，改善受損脊髓局部神經(jīng)外環(huán)境，對脊髓損傷繼發(fā)性病變的治療和修復至關(guān)重要。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，神經(jīng)炎癥主要由常駐巨噬細胞（在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，為小膠質(zhì)細胞）介導，巨噬細胞有兩種表型：經(jīng)典激活的促炎（M1）表型和可選擇激活的抗炎（M2）表型，脊髓損傷后7d內(nèi)觀察到少量M2小膠質(zhì)細胞的瞬時激活和大量M1小膠質(zhì)細胞的長期激活，并且通過抑制M1表型、促進M2

17、表型的表達，或者將M2表型巨噬細胞移植至受損脊髓可促進SCI大鼠的運動恢復。因此，促進M2小膠質(zhì)細胞極化可能是一種有希望的治療策略，以促進SCI后的功能恢復，而PNNs與炎癥之間的關(guān)系可能極大地影響內(nèi)源性脊髓修復。透明質(zhì)酸對脊髓損傷后神經(jīng)炎癥的影響在健康脊髓中，高分子量透明質(zhì)酸（分子量1000kDa）是主要的透明質(zhì)酸表現(xiàn)形式，它通過星形膠質(zhì)細胞釋放到細胞外，并且可能通過阻斷細胞外配體結(jié)合先天免疫受體的能力來降低小膠質(zhì)細胞的炎癥信號傳導。研究發(fā)現(xiàn)，在組織受傷后透明質(zhì)酸分裂形成低分子量透明質(zhì)酸（分子量200kDa），通過信號轉(zhuǎn)導途徑刺激TLR2和TLR4刺激炎癥性細胞因子的產(chǎn)生，而在脊髓損傷小鼠中

18、發(fā)現(xiàn)TLR2和TLR4均增加，并在巨噬細胞小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞中表達。可見在脊髓損傷模型中低分子量透明質(zhì)酸可能具有放大某些炎癥反應的作用。另外，有學者基于上述研究進一步發(fā)現(xiàn)，在脊髓損傷治療策略中，將高分子量透明質(zhì)酸用于凝膠基質(zhì)置入損傷部位，能有效抑制炎癥反應和星型膠質(zhì)細胞活化增生，通過調(diào)節(jié)炎癥細胞因子水平，保護神經(jīng)組織，改善軸突再生促進脊髓損傷大鼠的功能恢復。硫酸軟骨素蛋白聚糖對脊髓損傷后神經(jīng)炎癥的影響CSPG最初被認定為是神經(jīng)膠質(zhì)瘢痕內(nèi)軸突生長和可塑性的抑制劑，但新發(fā)現(xiàn)它也是內(nèi)源性炎癥反應的重要調(diào)節(jié)劑，CSPG在損傷后上調(diào)可能與促炎性刺激有關(guān)。脊髓損傷后CSPG硫酸化，糖胺多糖（GAG）被釋放，通過結(jié)合免疫性受體、免疫細胞的信號分子激活免疫細胞，增強炎癥反應，限制內(nèi)源性修復。研究顯示，CSPG結(jié)合LAR、PTP下游的RhoROCK促進小膠質(zhì)細胞巨噬細胞促炎性表型M1表型的激活，并且通過阻斷LAR和PTP受體，減少與CSPG的結(jié)合，可降低促炎性細胞因子白介素1的水平，并上調(diào)神經(jīng)保護性小膠質(zhì)細胞巨噬細胞M2表型和T調(diào)節(jié)細胞的表達，增強SCI后的抗炎環(huán)境。很好地證明了在脊髓損傷中靶向CSPG受體會改善炎癥反應。可見，