1、第第18章章 色譜法導論色譜法導論第一節第一節 概論概論v色譜法的最早應用是用于分離植物色素，其方法是色譜法的最早應用是用于分離植物色素，其方法是這樣的：在一玻璃管中放入碳酸鈣，將含有植物色這樣的：在一玻璃管中放入碳酸鈣，將含有植物色素（植物葉的提取液）的石油醚倒入管中。素（植物葉的提取液）的石油醚倒入管中。v此時，玻璃管的上端立即出現幾種顏色的混合譜帶。此時，玻璃管的上端立即出現幾種顏色的混合譜帶。然后用純石油醚沖洗，隨著石油醚的加入，譜帶不然后用純石油醚沖洗，隨著石油醚的加入，譜帶不斷地向下移動，并逐漸分開成幾個不同顏色的譜帶，斷地向下移動，并逐漸分開成幾個不同顏色的譜帶，繼續沖洗就可分別

2、接得各種顏色的色素，并可分別繼續沖洗就可分別接得各種顏色的色素，并可分別進行鑒定。色譜法也由此而得名。進行鑒定。色譜法也由此而得名。v玻璃管為色譜柱，玻璃管為色譜柱，管內的碳酸鈣填料管內的碳酸鈣填料為固定相，石油醚為固定相，石油醚淋洗液為流動相。淋洗液為流動相。v現在的色譜法早已不局限于色素的分離，其現在的色譜法早已不局限于色素的分離，其方法也早已得到了極大的發展，但其分離的方法也早已得到了極大的發展，但其分離的原理仍然是一樣的。原理仍然是一樣的。v色譜法也叫層析法，它是一種高效能的物理色譜法也叫層析法，它是一種高效能的物理分離技術，能夠分離性質相近的多組分復雜分離技術，能夠分離性質相近的多組

3、分復雜混合物。混合物。v將色譜法用于分析化學并配合適當的檢測手將色譜法用于分析化學并配合適當的檢測手段，就成為色譜分析法。段，就成為色譜分析法。v色譜法分類色譜法分類v1.按固定相形態分類按固定相形態分類v柱色譜：固定相裝在色譜柱內。包括填充柱、柱色譜：固定相裝在色譜柱內。包括填充柱、整體柱、毛細管柱或開管柱。整體柱、毛細管柱或開管柱。v平面色譜：固定相呈平面狀。包括薄層色譜平面色譜：固定相呈平面狀。包括薄層色譜和紙色譜。和紙色譜。色譜法色譜法液相色譜法液相色譜法氣相色譜法氣相色譜法氣氣- -液色譜法液色譜法氣氣- -固色譜法固色譜法液液- -固色譜法固色譜法液液- -液色譜法液色譜法v2.按

4、兩相的物理形態、分離機理分類按兩相的物理形態、分離機理分類第二節第二節 基本概念基本概念v色譜分離體系由兩部分組成：一相是固定不動的，色譜分離體系由兩部分組成：一相是固定不動的，我們把它叫做固定相；另一相則不斷流過固定相，我們把它叫做固定相；另一相則不斷流過固定相，我們把它叫做流動相。我們把它叫做流動相。v當流動相以一定速率流經色譜柱，試樣中各個組分當流動相以一定速率流經色譜柱，試樣中各個組分在流動相和固定相之間進行連續多次分配。在流動相和固定相之間進行連續多次分配。v組分與固定相和流動相之間的作用力有差別，因而組分與固定相和流動相之間的作用力有差別，因而組分在兩相中分布常數不同。組分在兩相中

5、分布常數不同。v在固定相上吸附力大的，在固定相上吸附力大的，即分布常數大的，遷移即分布常數大的，遷移數率慢，保留時間長；數率慢，保留時間長；在固定相上吸附力小，在固定相上吸附力小，即分布常數小的，遷移即分布常數小的，遷移數率快。數率快。v試樣中各組分同時進入試樣中各組分同時進入色譜柱，但是在不同時色譜柱，但是在不同時間從色譜柱中洗出，實間從色譜柱中洗出，實現分離。現分離。024681012024681002468101202468100246810120246810混合組分的分離過程及檢測器對各組份在不同階段的響應混合組分的分離過程及檢測器對各組份在不同階段的響應v試樣組分在色譜體系中運行的特

6、點：試樣組分在色譜體系中運行的特點：v1.差速遷移：混合物中不同組分的遷移速率不同差速遷移：混合物中不同組分的遷移速率不同v差速遷移差速遷移(保留值的大小保留值的大小)取決于組分與固定相、流取決于組分與固定相、流動相作用力的差異動相作用力的差異v2.分子分布離散：同種組分分子在遷移過程中分布分子分布離散：同種組分分子在遷移過程中分布空間擴展空間擴展v分子分布離散取決于同種分子運動速率的差異分子分布離散取決于同種分子運動速率的差異v色譜分離要求：差異速率色譜分離要求：差異速率(保留值大保留值大)，分子分布離，分子分布離散散(色譜區帶色譜區帶)窄。窄。v2.分布平衡分布平衡v色譜涉及溶質在兩相中的

7、分布平衡，平衡常數色譜涉及溶質在兩相中的分布平衡，平衡常數K稱稱為分布系數或分配系數為分布系數或分配系數vK=cs/cmvcs是溶質在固定相的濃度，是溶質在固定相的濃度，cm是溶質在流動相中的是溶質在流動相中的濃度，濃度，K是溶質在兩相中分布平衡性質的度量，反是溶質在兩相中分布平衡性質的度量，反映溶質與固定相、流動相作用力差別。映溶質與固定相、流動相作用力差別。vK只與固定相和溫度有關，與兩相體積、柱管特性只與固定相和溫度有關，與兩相體積、柱管特性和所用儀器無關。和所用儀器無關。v溫度、溶質一定時，溫度、溶質一定時，K 主要取決于固定相性質。主要取決于固定相性質。v每個組份在各種固定相上的分配

8、系數每個組份在各種固定相上的分配系數K不同；組分不同；組分的分配系數的分配系數 K 越小，出峰越快；組分的分配系數越小，出峰越快；組分的分配系數 K 越大，出峰越慢；某組分的越大，出峰越慢；某組分的K = 0時，即不被固定相時，即不被固定相保留，最先流出。保留，最先流出。v選擇適宜的固定相可改善分離效果；試樣中的各組選擇適宜的固定相可改善分離效果；試樣中的各組分具有不同的分具有不同的K值是分離的基礎；值是分離的基礎；v3.色譜流動相流速色譜流動相流速v穩定的流動相流速是色譜系統正常運行的基本條件。穩定的流動相流速是色譜系統正常運行的基本條件。v流動相的流速通常有兩種表達方式流動相的流速通常有兩

9、種表達方式v體積流量體積流量Fc mL/min，單位時間流過色譜柱的平均，單位時間流過色譜柱的平均體積。體積。vFc采用容器收集柱后一定時間內流出流動相的體積采用容器收集柱后一定時間內流出流動相的體積進行測定。進行測定。v線速度線速度 cm/min，mm/min，單位時間內流動相流，單位時間內流動相流經色譜柱的長度經色譜柱的長度v 由柱長由柱長L和死時間和死時間tM求出，求出， =L/tMv4.色譜圖色譜圖v分離試樣各組分依次進入分離試樣各組分依次進入柱后，由檢測器產生檢測柱后，由檢測器產生檢測信號，響應信號大小對時信號，響應信號大小對時間或流動相流出體積的關間或流動相流出體積的關系曲線為色譜

10、圖。系曲線為色譜圖。v色譜圖的橫坐標是時間或色譜圖的橫坐標是時間或流動相體積，縱坐標是組流動相體積，縱坐標是組分在流動相中濃度或檢測分在流動相中濃度或檢測器響應信號大小，器響應信號大小，v色譜圖是色譜分析的主要技術資料，色譜包含的色色譜圖是色譜分析的主要技術資料，色譜包含的色譜信息譜信息v1.說明試樣是否是單一純化和物。正常色譜條件下，說明試樣是否是單一純化和物。正常色譜條件下，如果色譜圖有一個以上色譜峰，說明試樣中有一個如果色譜圖有一個以上色譜峰，說明試樣中有一個以上組分。色譜圖能夠提供試樣中的最低組分數。以上組分。色譜圖能夠提供試樣中的最低組分數。v2.說明色譜柱效和分離情況，可定量計算出

11、表征色說明色譜柱效和分離情況，可定量計算出表征色譜柱效的理論塔板數、評價相鄰物質對分離優劣的譜柱效的理論塔板數、評價相鄰物質對分離優劣的分離度。分離度。v3.提供各組分保留時間等色譜定性數據。提供各組分保留時間等色譜定性數據。v4.給出個組分色譜峰高、峰面積等定量數據。給出個組分色譜峰高、峰面積等定量數據。 色色 譜譜 圖圖 v基線基線：在實驗條件下，色譜柱后僅有純流動：在實驗條件下，色譜柱后僅有純流動相進入檢測器時的流出曲線稱為基線。基線相進入檢測器時的流出曲線稱為基線。基線在穩定的條件下應是一條水平的直線。它的在穩定的條件下應是一條水平的直線。它的平直與否可反應出實驗條件的穩定情況。平直與

12、否可反應出實驗條件的穩定情況。v色譜峰高色譜峰高(h)：色譜峰頂點與基線的距離叫峰：色譜峰頂點與基線的距離叫峰高。高。v峰面積峰面積：色譜峰與峰底基線所圍成區域的面：色譜峰與峰底基線所圍成區域的面積叫峰面積。積叫峰面積。v色譜峰區域寬度色譜峰區域寬度：色譜峰的區域寬度是色譜流出曲色譜峰的區域寬度是色譜流出曲線的重要參數之一，可用于衡量色譜柱的柱效及反線的重要參數之一，可用于衡量色譜柱的柱效及反映色譜操作條件下的動力學因素。寬度越窄，其效映色譜操作條件下的動力學因素。寬度越窄，其效率越高，分離的效果也越好。率越高，分離的效果也越好。v區域寬度通常有三種表示方法：區域寬度通常有三種表示方法：v標準

13、差標準差 ：峰高：峰高0.607倍處峰寬處的一半。倍處峰寬處的一半。v半峰寬半峰寬W1/2：峰高一半處的峰寬。：峰高一半處的峰寬。W1/2=2.354 v峰底寬峰底寬W：色譜峰兩側拐點上切線與基線的交點間：色譜峰兩側拐點上切線與基線的交點間的距離。的距離。W= 4 。v5.保留值保留值v保留值是試樣各組分在色譜柱或色譜體系中保留行保留值是試樣各組分在色譜柱或色譜體系中保留行為的度量，反映溶質與色譜固定相作用力類型和大為的度量，反映溶質與色譜固定相作用力類型和大小，是色譜熱力學參數和定性依據。小，是色譜熱力學參數和定性依據。v比移值比移值Rf：溶質通過色譜柱的平均線速度：溶質通過色譜柱的平均線速

14、度u與流動與流動相平均線速度相平均線速度ux之比。之比。v溶質分子在流動相中消耗的時間分數等于溶質分子溶質分子在流動相中消耗的時間分數等于溶質分子在流動相中分布的分子分數，這樣得到：在流動相中分布的分子分數，這樣得到：vnm和和ns分別為溶質在流動相和固定相的分子數或物分別為溶質在流動相和固定相的分子數或物質的量。質的量。xmfmsunRunnv溶質在流動相中消耗的時間越多，溶質在流動相中消耗的時間越多，nm越大，越大，ux越大，越大，Rf也越大。也越大。v如果溶質在流動相中消耗時間分數為如果溶質在流動相中消耗時間分數為1，即溶質一，即溶質一直在流動相中遷移，未在固定相中停留，直在流動相中遷移

15、，未在固定相中停留，ux=u，Rf=1。v如果溶質一直停留在固定相，譜帶不隨流動相遷移，如果溶質一直停留在固定相，譜帶不隨流動相遷移，則則ux=0，Rf=0。v通常，通常，0Rf1.5, R1.5, R增加不大增加不大) ) 。 改變改變 的方法有：降低柱溫、改變流動相及固的方法有：降低柱溫、改變流動相及固定相的性質和組成。定相的性質和組成。 v3）分離度）分離度R 分配比分配比 k 的關系的關系v k 增加，分離度增加，分離度R 增加，但當增加，但當k10，則，則R的的增加不明顯。通常增加不明顯。通常k在在210之間。之間。 v 改變改變 k 的方法有：適當增加柱溫的方法有：適當增加柱溫(G

16、C)、改變、改變流動相性質和組成流動相性質和組成(LC)以及固定相含量。以及固定相含量。70%CH3OH+30H2O60%CH3OH+40H2O50%CH3OH+50H2O40%CH3OH+60H2O溶劑溶劑( (流動相流動相) )組成對色譜分離的影響組成對色譜分離的影響( (梯度淋洗梯度淋洗) )1 1：9,10-9,10-蒽醌；蒽醌；2 2：2-2-甲基甲基-9,10-9,10-蒽醌；蒽醌；3 3：2-2-乙基乙基-9,10-9,10-蒽醌蒽醌4 4：1,4-1,4-二甲基二甲基-9,10-9,10-蒽醌；蒽醌；5 5：2-2-特丁基甲基特丁基甲基-9,10-9,10-蒽醌；蒽醌；改變組成

17、使 k 最佳3.3.分析時間分析時間 t t 分析時間通常指最后一個組分出峰的時間。其分析時間通常指最后一個組分出峰的時間。其值為值為2322222(1)16()1RkHtRuk可見，分析時間與可見，分析時間與R R， ，k k、H/uH/u等參數有關。等參數有關。R R 增加增加1 1 倍，分析時間則是原來的倍，分析時間則是原來的 4 4 倍。倍。 實際工作中，即要能獲得有效的分離，又要實際工作中，即要能獲得有效的分離，又要在較短時間內完成分析。在較短時間內完成分析。例：兩物質例：兩物質A A和和B B在在30cm30cm長的色譜柱上的保留時間分別為長的色譜柱上的保留時間分別為16.416.

18、4和和17.63min17.63min，有一不與固定相作用的物質，其在此柱，有一不與固定相作用的物質，其在此柱上的保留時間為上的保留時間為1.30 min1.30 min。物質。物質A A和和B B的峰底寬分別為的峰底寬分別為1.111.11和和1.21min1.21min。試問：。試問：1 1）柱分辨率）柱分辨率R R；2 2）柱平均理論塔板數）柱平均理論塔板數n navav3 3）平均塔板高度）平均塔板高度H Havav4 4）若要求）若要求R R達到達到1.51.5，則柱長至少應為多少？，則柱長至少應為多少？5 5）使用上述較長的柱進行分析時，其分析時間為多長？）使用上述較長的柱進行分析

19、時，其分析時間為多長？6 6）不增加柱長，要求在原來的分析時間內）不增加柱長，要求在原來的分析時間內R R達到達到1.51.5，該柱，該柱的塔板高度應為多少？的塔板高度應為多少？1 1）柱分辨率柱分辨率R R；2(17.63 16.40)min1.06(1.11 1.21)minsR232333316.4016()3.49 101.1117.6316()3.40 101.21(3.49 103.40 10 )/23.44 10ABavnnn 2 2）柱平均理論塔板數柱平均理論塔板數n navavv3）平均塔板高度平均塔板高度Hav33308.7 103.44 10avLHcmn,:kLH 或

20、與柱長 或塔板高度 無關 因此可得到1122nRRn321.063.44 101.5n即326.9 10n 因此336.9 108.7 1060Ln Hcm4 44 4）若要求若要求R R達到達到1.51.5，則柱長至少應為多少？，則柱長至少應為多少？5 5）使用上述較長的柱進行分析時，其分析）使用上述較長的柱進行分析時，其分析時間為多長？時間為多長？221122222( )17.631.06()( )( )1.5( )35minrrrrtRtRtt23216(1)t()1,R Hkuk由式B得到 物質在兩柱上分析時間之比,本題要求在達到相同分辨率條件下 分析時間相等2r11r22(t )()

21、1(t )BBRHRH代入各值得-324.3 10Hcm6 6）不增加柱長，要求在原來的分析時間內）不增加柱長，要求在原來的分析時間內R R達達到到1.51.5，該柱的塔板高度應為多少？，該柱的塔板高度應為多少？第五節第五節 色譜方法選擇色譜方法選擇v方法選擇方法選擇v根據試樣物理、化學性質和分析要求來選擇色譜方根據試樣物理、化學性質和分析要求來選擇色譜方法：法：v各種氣體、沸點各種氣體、沸點500以下具有揮發性的試樣，采以下具有揮發性的試樣，采用氣相色譜分析。用氣相色譜分析。v非揮發性試樣，包括有機物、無機物、高分子化合非揮發性試樣，包括有機物、無機物、高分子化合物、可解離化合物采用高效液相

22、色譜分析。物、可解離化合物采用高效液相色譜分析。v薄層色譜為非儀器分析方法，為高效液相色譜流動薄層色譜為非儀器分析方法，為高效液相色譜流動相、固定相選擇的輔助手段。相、固定相選擇的輔助手段。第六節第六節 色譜分析色譜分析v1.定性分析定性分析v色譜定性：鑒定試樣中各組分，即每個色譜峰是何種化色譜定性：鑒定試樣中各組分，即每個色譜峰是何種化合物。合物。v基于色譜分離的主要定性依據是保留值，包括保留時間、基于色譜分離的主要定性依據是保留值，包括保留時間、保留體積、相對保留值等。保留體積、相對保留值等。v色譜保留值色譜保留值與分子結構有關，可以用來鑒定已知物。與分子結構有關，可以用來鑒定已知物。v如

23、在同樣色譜條件下，用已知化合物與試樣中色譜峰對如在同樣色譜條件下，用已知化合物與試樣中色譜峰對照定性；將已知化合物加入試樣中，導致某色譜峰增高照定性；將已知化合物加入試樣中，導致某色譜峰增高來定性。來定性。v應用保留值確定試樣中不存在某個化合物是可靠的，而應用保留值確定試樣中不存在某個化合物是可靠的，而準確鑒定某一色譜峰是某個化合物，需要反復驗證。準確鑒定某一色譜峰是某個化合物，需要反復驗證。v保留指數保留指數也是一種相對保留值，保留指數在固定液也是一種相對保留值，保留指數在固定液上的保留行為，是目前使用最廣泛并被國際上公認上的保留行為，是目前使用最廣泛并被國際上公認的定性指標。它具有重現性好

24、、標準統一及溫度系的定性指標。它具有重現性好、標準統一及溫度系數小等優點。數小等優點。v它是把正構烷烴中某兩個組分的調整保留值的對數它是把正構烷烴中某兩個組分的調整保留值的對數作為相對的尺度。保留指數僅與固定相的性質、柱作為相對的尺度。保留指數僅與固定相的性質、柱溫有關，與其它實驗條件無關。其準確度和重現性溫有關，與其它實驗條件無關。其準確度和重現性都很好。只要柱溫與固定相相同，就可應用文獻值都很好。只要柱溫與固定相相同，就可應用文獻值進行鑒定，而不必用純物質相對照。進行鑒定，而不必用純物質相對照。v2.定量分析定量分析v定量依據是根據檢測響應信號大小，測定試樣中定量依據是根據檢測響應信號大小

25、，測定試樣中各組分的相對含量。各組分的相對含量。v定量分析的依據是每個組分的量與色譜檢測器的定量分析的依據是每個組分的量與色譜檢測器的響應值成正比，與峰高或峰面積響應成正比。響應值成正比，與峰高或峰面積響應成正比。v每個色譜峰高每個色譜峰高h可從色譜圖直接測定，色譜峰面積可從色譜圖直接測定，色譜峰面積A以峰高與半峰高寬以峰高與半峰高寬2W1/2相乘求出相乘求出: A=h 2W1/2v在試樣和標樣平行分析時，必須嚴格控制柱溫、在試樣和標樣平行分析時，必須嚴格控制柱溫、流動相流速、進樣速度等條件，才能獲得準確的流動相流速、進樣速度等條件，才能獲得準確的峰高測定結果。峰高測定結果。v標準校正法標準校正法v配制一系列組成與試樣相近的標準溶液，按標準溶配制一系列組成與試樣相近的標準溶液