1、第四章核酸的定量和純度檢測提取的總 DNA 、 RNA 或載體 DNA ，外源目的 DNA 片段，必須對其濃度、純度、構型、分子量大小等基本情況進行了解，以下幾種方法從不同角度對DNA 或 RNA 進行了鑒定。第一節紫外光譜分析法核酸的最大吸收波長為260 nm，蛋白質為280 nm，在 260nm 波長時，用標準樣品測得每毫升l 微克 DNA 鈉鹽溶液的吸光度值為0.02，即在 1 OD 值相當于雙鏈 DNA 濃度為 50 ug/ml ，單鏈 DNA 或 RNA為 40 ug/ml ，單鏈寡聚核苷酸的含量為30 ug/ml ，可以據此來計算核酸樣品的濃度。DNA 濃度計算：根據經驗數據， 若

2、 OD 260=l 時，dsDNA 的濃度為50 微克 /毫升，假如質粒樣品 pBR322稀釋 500 倍，測得光吸收值為0.025，則該樣品 pBR322 濃度為 50*0.025*500=625 微克 / 毫升。分光光度法不但能確定核酸的濃度，還可通過測定在 260nm 和 280nm 的 OD 值的比值（OD 260/OD 280）估計核酸的純度。 純凈 DNA 的比值為1.8，純凈 RNA 的比值為 2.0。若 DNA 的比值高于1.8，說明 DNA樣品中的 RNA 尚未除盡，若樣品中含有酚和蛋白質將導致比值降低，此時，可通過苯酚-氯仿 -異戊醇方法抽提后再檢測，以排除蛋白質的影響。2

3、70nm 存在高吸收表明有酚的干擾。優點：使用 U -240 紫外分光光度計測定DNA 的方法簡便、快速。注意的問題：1）用 U -240 可以通過260 nm 和 280 nm 的 OD 值的比值 （ OD 260/OD 280）估計核酸的濃度和純度，但不能區分 DNA 的超螺旋、開環、線狀三種構型，也不能區分染色體DNA 。由于測定 OD 260 時，難于排除 RNA ，染色體 DNA ，以及 DNA 解鏈的增色效應等因素，因此測得的數據往往比實際濃度偏高。2）用 U -240 ，有因樣品槽大，測定用量較多的缺點，但對于測濃度較高的樣品，特別是測定寡聚核苷酸的濃度其效果甚佳。其他DNA 多

4、數選用瓊脂糖凝膠法進行鑒定。3）紫外分光光度法只能用于測定濃度大于0.25 ug/ml 的核酸溶液，對濃度更小的樣品，可采用熒光分光光度法。第二節溴化乙錠-標準DNA濃度比較法測定DNA濃度DNA 本身不產生熒光，但熒光染料溴化乙錠(EB) 嵌入堿基對之間后，可在紫外線激發下發出紅色熒光。不同濃度的DNA 溶于一定濃度的溴化乙錠溶液中，在紫外燈下所發射熒光的強度與核酸含量成正比，使用一系列已知濃度的DNA 溶液作標準對照，可比較出被測DNA 樣品的濃度。特點：儀器設備與操作都很簡單，省時，配制一套標準濃度的DNA 樣品與試劑存于-20，隨時可進行測定比較。克服了U -240用量大的缺點，只需l

5、 ul的用量，就可測出l ng的DNA 樣品。適合于測定經過分離純化后的DNA 片段濃度，為DNA 的重組連接提供濃度參數。在基因操作中，對于DNA 含量較少，特別是要對分離純化后的DNA 片段的濃度進行測定，用此比較法最為合適。此法直接簡便，測定量僅需0.51微升就能比較出確切濃度，靈敏度可達l5ng 。影響實驗結果的因素：1）本實驗對樣品中含有的染色體DNA 、RNA 以及質粒 DNA 的三種構型無法區分；若待測樣品不純，測得的濃度比實際濃度肯定偏高。2）實驗采用比較法，操作者的目測誤差也影響準確性。3） DNA 濃度大于 20ng/ul 以上時濃度誤差較大，需要樣品稀釋到合適的濃度才能進

6、行比較。第三節DNA 的凝膠電泳帶電物質在電場中向相反電極移動的現象稱為電泳(electrophoresis)。各種生物大分子在一定pH條件下，可以解離成帶電荷的離子，在電場中會向相反的電極移動。電泳技術是l9世紀初發明的，人們采用各種材料作為支持電泳介質，其中以瓊脂糖和聚丙烯酰胺為支持介質的凝膠電泳最為突出。凝膠電泳的原理比較筒單。當一種分子被放置在電場當中時，它們就會以一定的速度移向適當的電極。這種電泳分子在電場作用下的遷移速度，叫做電泳的遷移率，它同電場的強度和電泳分子本身所攜帶的凈電荷數成正比。即電場強度越大，電泳分子所攜帶的凈電荷數量越多，其遷移的速度也就越快，反之則較慢。由于在電泳

7、中使用了一種無反應活性的穩定的支持介質，如瓊脂糖凝膠和聚丙烯酞胺凝膠等，電泳的遷移率又是同分子的摩擦系數成反比的。已知摩擦系數是分子的大小、極性及介質黏度的函數，因此根據分子大小的不同、構型或形狀的差異，以及所帶的凈電荷的多寡，便可以通過電泳將蛋白質或核酸分子混合物中的各種成分彼此分離開來。應用凝膠電泳技木分離DNA 片段的基本原理：在一定生理條件下，核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基團是呈離子化狀態的，DNA 和 RNA 的多核苷酸鏈可叫做多聚陰離子，核酸分子在電場中向正電極方向遷移。由于糖 - 磷酸骨架在結構上的重復性質，相同數量的雙鏈DNA 幾乎具有等量的凈電荷，因此它們能以同樣的速度向正

8、電極方向遷移。在一定的電場強度下，DNA 分子的這種遷移速度(亦即電泳的遷移率 )取決于核酸分子本身的大小和構型。分子量較小的DNA分子比分子量較大的DNA 分子具有較緊密的構型，其電泳遷移率快，而且比同等分子量的松散型的開環DNA 分子或線性 DNA 分子要快些。一、水平式瓊脂糖凝膠電泳檢測瓊脂糖是一種從紅色海藻產物瓊脂中提取而來的線性多糖聚合物。瓊脂糖是一種直鏈多糖，它由D-半乳糖和 3,6-脫水 -L- 半乳糖的殘基交替排列組成的線型多聚糖。由于鏈狀瓊脂糖分子相互以氫鍵交聯，因此與瓊脂一樣能形成凝膠。瓊脂糖帶有親水性，不含有帶電荷的基團，不引起DNA 變性，又不吸附被分離物質，因此它是一

9、種很好的凝膠劑。當瓊脂糖加熱到沸點后冷卻凝固便會形成良好的電泳介質，其密度是由瓊脂糖的濃度決定的。有兩種不同類型的瓊脂糖凝膠，一種是常熔點的， 另一種是低熔點的 （熔點為 6265的瓊脂衍生物），它一旦熔解，便可在37持續保持液體狀態達數小時之久，而在25下也可持續保持液體狀態約10分鐘。經化學修飾的低熔點(LMP) 的瓊脂糖在結構上比較脆弱，因此在較低的溫度下便會熔化，可用于DNA 片段的制備電泳，但價格卻相當昂貴。原理：溴化乙錠在紫外光照射下能發射熒光，當DNA 樣品在瓊脂糖凝膠中電泳時，瓊脂糖凝膠中的EB 就插入 DNA 分子中形成熒光絡合物，使DNA 發射的熒光增強幾十倍。而熒光的強度

10、正比于DNA 的含量，如將已知濃度的標準樣品作瓊脂糖凝膠電泳對照，就可比較出待測樣品的濃度。若用薄層分析掃描儀檢測，則可精確地測得樣品的濃度。電泳后的瓊脂糖凝膠塊直接在紫外燈照射下拍照，只需要510ngDNA ，就可以從照片上比較鑒別。如肉眼觀察，可檢測到0.010.1ug的 DNA 。在凝膠電泳中， DNA 分子的遷移速度與分子量的對數值成反比關系。質粒 DNA 樣品用單一切點的酶酶切后與已知分子量大小的標準DNA 片段進行電泳對照，觀察其遷移距離，就可獲知待測樣品的分子量大小。凝膠電泳不僅可以分離不同分子量的DNA ，也可以鑒別分子量相同，但構型不同的DNA 分子。一般情況下，超螺旋型(S

11、C)遷移速度最快，其次為線狀(L) 分子，最慢的為開環狀 (OC) 分子。當提取到的質粒DNA 樣品中還有染色體 DNA 或 RNA ，在瓊脂凝膠電泳上也可以分別觀察到電泳區帶，由此可分析樣品的純度。DNA 分子在瓊脂糖凝膠中泳動時，有電荷效應與分子篩效應，前者由分子所帶凈電荷量的多少而定，后者則主要與分子大小及其構型有關。DNA 分子在高于其等電點的溶液中帶負電荷，在電場中向正極移動，在用電泳法測定DNA 分子大小時，應當盡量減少電荷效應。增加凝膠的濃度可以在一定程度上降低電荷效應，使分子的遷移速度主要由分子受凝膠阻滯程度的差異所決定，提高分辨率。同時適當減低電泳時的電壓，也可使分子篩效應相

12、對增強而提高分辨率。影響瓊指糖凝膠電泳DNA 遷移速率的因素：1DNA 的分子大小：線狀雙鏈DNA 分子在凝膠基質中其遷移速率與堿基對數目以10 為底的對數值成反比。分子越大，則摩擦阻力越大，也越難于在凝膠孔隙中蠕行，因而遷移得越慢。2瓊脂糖濃度： 一個給定大小的線狀DNA 片段，其遷移速率在不同濃度的瓊脂糖中各不相同。DNA電泳遷移率 ( )的對數與凝膠濃度( ) 成線性關系 ,可用如下等式表示： lg=lg 0-K r，其中0為 DNA 的自由電泳遷移率； K r 是回歸系數，是一個與凝膠的性質、遷移分子的形狀和大小有關的常數。在大孔徑的瓊脂糖凝膠(即瓊脂糖含量低的凝膠)中，凝膠對不同大小

13、的 DNA分子，其阻滯程度差異不大，而 DNA 分子的遷移率更多地依賴于分子的凈電荷，因此對較小的DNA 分子群得不到很好的分離效果。如果增加瓊脂糖凝膠的濃度，可在一定的程度上降低電荷效應，使DNA 分子遷移速度的差異主要由分子受凝膠阻滯程度的差異所決定。但高濃度的瓊脂糖凝膠電泳，所需時間長，因此通常根據待測分子量范圍選擇合適濃度的凝膠。也要根據每次電泳的不同要求，選擇不同大小的電泳槽與合適的條件。3 DNA 的構象：分子量相同的超螺旋型、帶切口環狀及線狀DNA通過凝膠時速度不一。這三種DNA 的相對遷移率主要取決于凝膠的瓊脂糖濃度，也受電流強度、緩沖液的離子強度及超螺旋型DNA超螺旋度的影響

14、。在某些條件下超螺旋型DNA 遷移速率比線型DNA 快；在另一些條件下則恰恰相反。4所加電壓：在低電壓時，線狀DNA 片段的遷移速率與所加電壓成正比。隨著電場強度的增加，高分子量DNA片段的遷移率將以不同的幅度增長，不再與電壓成正比。因此，隨著電壓的增加，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍縮小。要使大于2kb 的 DNA 片段的分辨率達到最大，所加電壓不應超過5V/cm 。5電場方向：如果電場方向保持不變，則大于50100kb 的 DNA 分子在瓊脂糖凝膠上的遷移速率相同。如果電場方向改變，則DNA 分子被迫改變路徑。由于DNA 分子越大，為適應新的電場方向而重新排列所需的時間越長，因此可以通過脈沖電場

15、凝膠電泳來分辨極大的DNA 分子 (達到 10000kb)。6堿基組成與溫度：DNA在瓊脂糖凝膠中的電泳行為受DNA的堿基組成或凝膠電泳溫度的影響不明顯。不同大小的DNA 片段的相對遷移率在4與 30之間不發生改變。電泳一般在室溫下進行。但濃度低于0.5%的瓊脂糖凝膠和低熔點瓊脂糖凝膠較為脆弱，最好在4下電泳。7嵌入染料的存在：熒光染料EB 用于檢測瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠中的DNA ，它會使線狀 DNA的遷移率降低 15%。染料嵌入到堆積的堿基對之間，并拉長線狀和帶切口的環狀DNA ，使其剛性更強。8電泳緩沖液的組成：電泳緩沖液的組成及其離子強度影響DNA 的電泳遷移率。在沒有離子存在時 (如

16、凝膠中未加緩沖液 )，電導率最小，即使 DNA還能移動一點的話，也很慢。在高離子強度的緩沖液中 (如誤加了 10 倍電泳緩沖液 )，電導很高并明顯產熱。最壞的情況是引起凝膠熔解而DNA 發生變性。有幾種不同的緩沖液可用于天然雙鏈DNA 的電泳。這些緩沖液含 EDTA(pH8,0) 和 Tris- 乙酸 (TAE) 、Tris- 硼酸 (TBE) 或 Tris- 磷酸 (TPE) 。其濃度約為 50mmol/L(pH7.57.8)。電泳緩沖液通常配制成濃縮液，貯存于室溫。最常用的緩沖液是TAE 。但它的緩沖容量相當低，長時間電泳會使其緩沖容量喪失殆盡(陽極呈堿性，陰極變成酸性 )。在進行高壓、長

17、時間的電泳時，更新緩沖液或在兩槽之間進行緩沖液循環是可取的。 TPE和TBE 比 TAE 成本稍高，但它們的緩沖容量明顯較高。雙鏈線狀DNA 片段在 TAE 中的遷移速率比在 TBE 或 TPE 中快將近 10%，但這些系統的分辨能力幾乎相同，只是超螺旋DNA 在 TAE 中的分辨率要比在 TBE 中更好。核酸電泳常用的指示劑有兩種：溴酚藍，呈藍紫色，分子量為670道爾頓，在不同濃度凝膠中遷移速度基本相同，分子篩效應小，近似于自由電泳，故被普遍用作指示劑。在0.6% 、1%、2%的瓊脂糖凝膠電泳中，溴酚藍的遷移率分別與l kb 、0.6 kb 和 0.15 kb 的雙鏈線性 DNA 片段大致相

18、同。二甲苯腈，呈藍色，分子量為 554.6道爾頓，攜帶的電荷量比溴酚藍少，在凝膠中遷移率比溴酚藍慢。根據分離樣品中 DNA分子的大小，可以參照指示劑溴酚藍和二甲苯腈的遷移情況決定是否停止電泳。指示劑一般加在電泳上樣緩沖液中，為了使樣品能沉入膠孔，還要加入適量的蔗糖、聚蔗糖400或甘油以增加密度。在凝膠電泳中，把含有 DNA 分子的凝膠浸泡在EB溶液中，或是將 EB 直接加到凝膠介質中，染料便會在一切可能的部位同 DNA 分子結合，在紫外光的照射下，DNA 分子通過放射熒光而變成可見的譜帶。二、聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測聚丙烯酰胺凝膠電泳也是一種凝膠電泳檢測DNA 的方法， 分辨率最高， 只相差一個

19、 bp的 DNA 片斷也能分開，且可以容納較大容量的DNA 。但此法只能分離小于500bp以下的雙鏈 DNA 片段，瓊脂糖凝膠電泳雖然分離 DNA 的范圍較廣，但對200bp以下的小片段的分離卻很因難。因此將這兩種方法互補起來，就能很好地完成由 5bP到50kb 的雙鏈 DNA 的分離、鑒定和純化的工作。基本原理：過硫酸胺 (AP) 與 TEMED(N,N,N N -四甲基乙二胺 )是單體丙烯酰胺 (Acr) 的催化劑與誘導劑。它們使單體丙烯酰胺聚合成一串串長鏈。當溶液中的N,N -亞甲基雙丙烯酰胺參與聚合反應時，長鏈與長鏈之間就交聯成凝膠，鏈長與交聯度就決定了凝膠的孔徑，這種孔徑與瓊脂糖凝膠

20、的密度不同，只有 DNA 的小片段能進入凝膠內，在電泳場作用下進行分離。DNA 各片段在其相應的膠的位置上，然后通過溴化乙錠染色后，將凝膠移入紫外燈的照射下，根據凝膠中已知濃度的標準DNA 各片段的大小與熒光亮度的比較，測出未知樣品的濃度與分子量大小。如果需要凝膠中那一片段，可以從膠上切割下來進行純化，這種純化的 DNA 純度極高。與瓊脂糖凝膠一樣，聚丙烯酰胺凝膠可以灌制成各種形狀、大小和孔隙度，并在許多種不同的裝置里進行電泳。聚丙烯酰胺凝膠電泳根據電泳樣品的電荷、分子大小及形狀的差別分離物質。這種介質既具有分子篩效應，又具備靜電效應，分辨力高于瓊脂糖凝膠電泳，適用于低分子量蛋白質、寡聚核苷酸

21、的分離和 DNA 的序列分析。聚丙烯酰胺凝膠電泳可以容納相對大量的DNA ，其不足之處在于： 與瓊脂糖凝膠相比，凝膠的制備和電泳都比更為費事。聚丙烯酰胺凝膠一律是進行垂直裝置在恒定電場下電泳，根據分離的需要，其長度可以在10100cm 之間。雖然聚丙烯酰胺凝膠的灌制比瓊脂糖凝膠繁雜，但以下幾種優點是瓊脂糖凝膠所不具備的：1）分辨率極高，在同一DNA 混合物中，即使最大的片段比最小的片段長500倍 (如 1bp與 500bp)也能很好地分離；2）比瓊脂糖凝膠的載樣量大，在l cm X l mm的膠孔中能上樣到10ug的 DNA 樣品，而分辨率并無明顯下降；3）回收的 DNA 樣品純度極高，可用于

22、要求非常嚴格的實驗，如轉基因動物實驗；4）在聚丙烯酰胺凝膠分子的交聯網狀結構中，帶有酰胺側鏈的C-C聚合物不帶或少帶離子側鏈基團；5）聚丙烯酰胺凝膠無色透明，比瓊脂糖凝膠的紫外線吸收低，抗腐蝕性強，機械強度高，韌性好。影響 DNA 片段分離純化的因素：盡管聚丙烯酰胺凝膠電泳比瓊脂糖凝膠有以上優點，但還是有多種因素影響 DNA 分子條帶分離純化的效果，因此在聚丙烯酰胺凝膠電泳時有如下幾個方面要注意的：1）電泳中氣泡的影響：2）點樣孔的阻塞影響：3）電泳條件的影響：4）最少上樣量的估計：5） DNA 的聚丙烯酰胺凝膠電泳的結果分析。常用的丙烯酰胺凝膠有非變性與變性兩種：1）用于分離和純化雙鏈2）用

23、于分離、純化單鏈DNA 片段的非變性聚丙烯酰胺凝膠DNA 的變性聚丙烯酰胺凝膠三、脈沖電泳檢測瓊脂糖電泳是根據DNA 分子量大小來篩選DNA 分子的一種方法。瓊脂糖濃度低， 膠的孔徑大， 則可以允許通過的 DNA 分子也越大，然而當 DNA 分子太大時，實際上已無法通過膠孔，所有超過一定大小的線狀雙鏈 DNA 分子在瓊脂糖凝膠中的遷移速率相同，這時，瓊脂糖的分離能力達到了極限，而瓊脂糖凝膠的孔徑也不是可以無限增大的，且隨著膠濃度的降低，膠越來越軟易碎而難以操作。一般來說，普通的瓊脂糖凝膠電泳只能對50kb以下的 DNA 片段進行分離分析。但是，即使低等真核生物的一條染色體就有 7000kb ，

24、高等真核生物的染色體更大，一個基因有幾千 kb，怎么才可能盡量完整地來研究這些大段的 DNA 呢？為了解決這一問題， 1984 年，發展了脈沖電泳技術。1. 原理： DNA 分子在兩個交替改變的電場力作用下，不斷地改變自己的形狀，當它由“線團”狀變成“束”狀時，就有可能進入凝膠。在電場力的作用下，象蛇一樣地爬行，這時，大分子移動慢，小分子移動快。當電場發生變化時，DNA 分子又再次改變自己的形狀，沿著新的電場方向移動，在這一過程中，大分子較小分子要困難些，所化的時間也長一些。由于上述兩個因素，再加上小分子DNA 在凝膠孔中移動時受到的摩擦力也比大分子小，因此整個電泳過程的總效應是小分子移動快，

25、大分子移動慢。一般的瓊脂糖凝膠中：DNA 分子移動距離與其分子長度(bp) 的對數成反比。 但是脈沖電泳不符合這一規律。由于移動過程與分子改變自身形狀的時間有關，脈沖長則更適合于大分子的分離，一般用長脈沖、低電壓分離較大的分子；短脈沖高電壓分離小的分子，瓊脂糖的濃度也可隨所分離的DNA 分子的大小而作相應的變化。脈沖電泳的誕生，使可以分離的DNA 分子的上限大大提高，最大可達9000kb，使人類有可能對一些大的 DNA 片段進行分析研究。脈沖電場凝膠電泳分辨力的極限取決于幾個因素，包括：1）兩個電場的均一程度。2）電脈沖的絕對長度。3）用于產生兩個電場的電脈沖長度的比例。4）兩個電場與凝膠所成

26、的角度。2用于脈沖電泳的DNA5）兩個電場的相對強度。的制備（包塊法）：為避免大分子DNA 在抽提過程中受到剪切，可以在瓊脂糖塊或小珠中進行細胞原位裂解。由于瓊脂糖塊更有效，是目前應用最多的抽提大分子DNA 的方法。此法使細胞裂解，蛋白酶消化，DNA 分子酶解等整個過程在一定濃度的瓊脂糖塊中進行，避免了液相中和有機試劑中的劇烈處理，保證DNA 分子受到最小的機械損傷，被用于哺乳動物人和其他真核生物的總DNA 的提取。瓊脂糖塊可以直接加到脈沖電場凝膠的加樣孔中，也可以在上樣前使之熔化。第五章分子克隆中所用酶通過切割相鄰的兩個核苷酸殘基之間的磷酸二酯鍵，從而導致核酸分子多核苷酸發生水解斷裂的蛋白酶

27、叫做核酸酶。其中專門水解斷裂RNA 分子的叫做核糖核酸酶(RNase)，而特異水解斷裂DNA 分子的則叫做脫氧核糖核酸酶(DNase)。核酸酶按其水解斷裂核酸分子的不同方式，可分為兩種類型： 一類是從核酸分子的末端開始，一個核苷酸一個核苷酸地消化降解多核苷酸鏈，叫做核酸外切酶(exonuclease)；另一類是從核酸分子內部切割磷酸二酯鍵使之斷裂形成小片段，叫做核酸內切酶(endonuclease)。第一節核酸內切限制酶核酸內切限制酶是一類能夠識別雙鏈DNA 分子中的某種特定核苷酸序列， 并由此切割 DNA 雙鏈結構的酶。主要是從原核生物中分離純化出來的。根據1994 年美國出版的分子生物學百

28、科全書的統計數字，僅型核酸內切限制酶一項就已從各種不同的微生物當中，分離出了2300 種以上、可識別230種不同的 DNA 序列。在核酸內切限制酶的作用下，侵入細菌的“外源”DNA 分子便會被切割成不同大小的片段，而細菌自己固有的DNA 由于修飾酶 (通常是一種甲基化酶)的保護作用，則可免受限制酶的降解。目前已經鑒定出3種不同類型的核酸內切限制酶，即型酶、II 型酶和 III 型酶。最初在限制-修飾系統中發現的限制酶屬于第型限制酶，它們的切割位點是隨機的，至少距識別位點1000bp。第型限制酶的切割位點距識別序列 3端為 2426bp。第型限制酶的切割位點一般在識別序列上或與之靠近，而且具有序

29、列特異性，故在基因克隆中有特別廣泛的用途。型核酸內切限制酶具有 3個基本的特性： 在 DNA 分子雙鏈的特異性識別序列部位切割DNA 分子，產生鏈的斷裂； 2個單鏈斷裂部位在DNA 分子上的分布通常不是彼此直接相對的；斷裂結果形成的DNA 片段往往具有互補的單鏈延伸末端。限制酶的命名是根據分離出該酶的微生物的學名進行的，通常為3個字母：第一個字母大寫，來自微生物屬名的第一個字母；第二、第三個字母小寫，來自微生物種名的頭兩個字母。如果該微生物有不同的變種和品系，則再加一個大寫的來自變種或品系的第一個字母。從同一種微生物中發現的幾種限制酶，則根據其被發現和分離的順序用I、 III 等羅馬數字表示。

30、例如，從淀粉液化芽孢桿菌(Bacillusamyloliguefaciens )H株中發現并分離的第一種限制酶，被稱為BamH I 。絕大多數的型核酸內切限制酶，都能夠識別由4一 8個核苷酸組成的特定的核昔酸序列，我們稱這樣的序列為核酸內切限制酶的識別序列。一般說來，同一種DNA 分子中，識別序列短的出現概率大，識別序列長的出現概率小。原則上有n個核苷酸的識別序列的出現概率為1/4 n。如 Sau3A 的識別序列只有 4個核苷酸 GATC ，則間隔 256(4 4)個核苷酸就有一次機會出現這個識別序列；Not I 的識別序列有 8個核苷酸 GCGGCCGC ，則須間隔 65536(4 8)個核

31、苷酸才有一次機會出現這個識別序列。因此要獲得不同長度的DNA 片段，就得選用識別序列長短不同的限制性核酸內切酶進行切割。但實際上未必所有的限制性核酸內切酶識別序列的出現概率都符合這樣的規律。 往往是富 AT 的識別序列在富 AT 的 DNA 分子中出現的概率高， 在富 GC的DNA 分子中出現的概率低；而富 GC的識別序列在富 AT 的DNA 分子中出現的概率低，在富 GC的 DNA 分子中出現的概率高。由于那些長的識別序列和富GC或富 AT 的識別序列在 DNA 分子中出現的概率很低，所以把這些識別序列相應的限制性核酸內切酶稱為稀切酶(rare cutting enzymes) 。為了獲得大

32、的片段,有時須采用稀切酶切割。已發現多種限制性核酸內切酶屬稀切酶，如富 GC識別序列的稀切酶有Apa I(GGGCCC) 、Bgl (GGCN5GCC) 、BssH II(GCGCGC) 、 EclX I 和 XmaIII(CGCGCG) 、 Ksp I 和 SacII(CCGCGG) 、 Nar I(GGCGCC) 和 SmaI(CCCGGG) ；富 AT 識別序列的稀切酶有 Asn I 和 Ase I(ATTAAT) 、Dra I(TTTAAA)和 Ssp I(AATATT)。有的限制性核酸內切酶可識別兩種以上的核苷酸序列。如Acc I 既可識別GTATAC ，又可識別GTCGAC ；Dd

33、e I 可識別的核苷酸序列有 CTAAG 、 CTTAG 、 CTGAG 和 CTCAG 。這樣的限制性核酸內切酶為獲得多種酶切片段提供了方便。有一些來源不同的限制酶能識別同樣的核苷酸靶子序列， 這類酶稱為同裂酶 (isoschizomers)。同裂酶產生同樣的切割，形成同樣的末端。“完全同裂酶”能識別和切割完全相同的序列，如 Hin d III 與 Hsu I，“不完全同裂酶”雖能識別相同序列，但切割方式不同，如 Xma I和Sma I。某些限制酶的識別序列中存在簡并現象，即識別序列中的個別堿基可以允許一定程度的替換。有些酶來源各異，識別的靶子序列也各不相同，但都產生出相同的黏性末端，稱為同

34、尾酶(isocaudamer)。常用的限制酶BamH I 、Bcl I 、Bgl、 Sau3A I 和 Xho就是一組同尾酶，它們切割DNA 之后都形成由 GATC4個核苷酸組成的黏性末端。由同尾酶所產生的DNA 片段是能夠通過其黏性末端之間的互補作用而彼此連接起來。但由一對同尾酶分別產生的黏性末端共價結合形成的位點，稱為“雜種位點” (hybrid site) ，一般是不能再被原來的任何一種同尾酶所識別。亦有例外情況，如由Sau3A I 和 BamH I同尾酶形成的雜種位點，對Sau3A I 仍然是敏感的，但已不再是BamH I 的靶子位點。總結限制性內切酶的切割方式：根據切割位點相對于對稱

35、軸的位置而言有三種，在對稱軸5側切割產生 5粘端，在對稱軸的3側切割產生 3粘端，在對稱軸處切割產生平端。總結識別位點與切割方式之間的關系：可分為如下四種：（1）識別順序不同，切割方式也不同，:如 EcoR和 Pst I的識別位點不同，切割方式也不同， EcoR I 產生的是 5粘端， Pst I 產生的是 3粘端。（ 2）識別順序不同，切割產生的粘末端相同；此時兩種酶產生的相同粘端，可用連接酶將其連接起來，這兩種酶稱為同尾酶。（3）識別順序相同，切割方式不同；如Sma I 與 ma I。（ 4）相同的識別順序，切割方式亦相同；通常，我們將來源不同，但能切割同一靶序列的那些酶稱為同裂酶或異源同

36、工酶。核酸內切限制酶對 DNA 底物的酶解作用是否完全，直接關系到連接反應、重組體分子的篩選和鑒定等實驗結果。核酸內切限制酶活性的充分發揮受到以下幾個因索的影響：1）DNA 樣品的純度， 2）DNA的甲基化程度， 3）酶切消化反應的溫度， 4） DNA 的分子結構， 5）核酸內切限制酶的緩沖液。內切酶的星號活性：內切酶通常有嚴格的識別特異性，能精確地識別DNA 排列順序。但在某些反應條件下，識別順序的特異性可能發生變化。結果一種內切酶酶切同一種DNA 片段會產生新的酶切位點，得到不同的酶切片段，這就是內切酶的星號活性。最常見的例子是EcoR I ，一般條件下它識別 GAATTC六個核苷酸順序，

37、而EcoR I( 表現有星號活性 )，僅能識別 AATT 四個核苷酸的順序。在這種條件下的酶解反應，電泳后出現的DNA 條帶數可能增多。促使內切酶產生星號活性的因素有多種，主要由如下一些因素引起：（1）甘油濃度過高。這是引起星號反應的常見原因。（2）離子強度不合適。鹽濃度降低也可能引起星號反應。（3）陽離子變化。若將 Mg 2+改為 Mn 2+可能促使 EcoR和 Hin d 產生星號活性。（4）溶液中 pH 變化。如用 EcoR I 酶切時，反應溶液的 pH值由 7.5升高到 8.5時也會出現星號反應。（5）有機溶劑殘留的影響。在基因工程操作中都希望減少或避免這種星號反應的出現。為此進行酶切

38、反應時，應該按制造廠商推薦的條件進行反應， 尤其應注意甘油濃度、 鹽離子濃度、 二價離子的種類和濃度以及反應溶液的pH值。核酸內切限制酶在分子克隆中的應用：限制酶是分子克隆中最常用的工具酶，只要進行分子克隆操作，就必定要用限制酶， 歸納起來， 主要用在這幾方面： DNA 重組， 組建新質粒， DNA 分子雜交，制備 DNA 放射性探針，繪制DNA 物理圖譜， DNA 序列分析， DNA 甲基化堿基的識別與切割，基因定位及 DNA 同源性研究。第二節DNA 連接酶1967 年，世界上有幾個實驗室幾乎同時發現了一種能夠催化2條 DNA 分子之間形成磷酸二酯鍵的酶，即 DNA 連接酶 (Iigase

39、) 。這種酶能夠參與DNA 裂口的修復，在一定條件下還能連接DNA 分子的自由末端。連接的功能是通過合成相鄰核苷酸之間的磷酸二酯鍵，從而修復缺口(nick) 或單鏈的裂口 (gap)。DNA 連接酶能催化雙鏈DNA 片段緊靠在一起的 3羥基末端與 5磷酸基團末端之間形成磷酸二酯鍵，使兩末端連接。目前用于連接DNA 片段的 DNA 連接酶有 E. coliDNA 連接酶和 T4DNA 連接酶。 DNA 連接酶只能催化雙鏈 DNA 片段互補黏性末端之間的連接， 不能催化雙鏈 DNA 片段平末端之間的連接。 T4DNA連接酶既可用于雙鏈 DNA 片段互補黏性末端之間的連接，也能催化雙鏈 DNA 片段

40、平末端之間的連接， 但平末端之間連接的效率比較低。DNA 連接酶同核酸內切限制酶一樣，都是在體外構建重組DNA 分子所必不可少的基本工具酶。核酸內切限制酶可以將 DNA 分子切割成不同大小的片段，然而要將不同來源的DNA 片段組成新的雜種 DNA分子，還必須將它們彼此連接起來。目前有3種體外連接 DNA 片段的方法：用DNA 連接酶連接具有互補黏性末端的 DNA 片段；用 T4DNA 連接酶直接將平末端的 DNA 片段連接起來， 或是用末端脫氧核苷酸轉移酶給具平末端的 DNA 片段加上 poly(dA)-poly(dT) 尾之后，再用 DNA 連接酶連接起來；先在DNA 片段末端加上化學合成的

41、銜接物或接頭，使之形成黏性末端，再用DNA 連接酶連接起來。這 3種方法雖然互有差異，但共同的一點都是利用DNA 連接酶所具有的連接和封閉單鏈DNA 的功能。第三節分子克隆中的其他工具酶一、 DNA 聚合酶：DNA 聚合酶：能夠把脫氧核糖核苷酸連續地加到雙鏈DNA 分子引物鏈的 3-OH 末端，催化核苷酸的聚合作用，而不發生從引物模板上解離的情況。到目前為止，已經從大腸桿菌中純化了3種不同類型的DNA 聚合酶，即 DNA 聚合酶 I 、 DNA 聚合酶和 DNA 聚合酶 III ，分別簡稱為Pol I 、 Pol II 和Pol III 。 Pol I和 Pol II 的主要功能是參與DNA

42、的修復過程，而Pol III 的功能看來是同DNA 的復制有關。在這3種 DNA 聚合酶中，只有 Pol同 DNA 分子克隆的關系最為密切。1大腸桿菌 DNA 聚合酶 (E. coli DNA Pol I) ：大腸桿菌 DNA 聚合酶由大小兩個亞基組成，具有3種酶活性， (1) 大亞基的 5 3DNA 聚合酶活性和 (2)3 5外切酶活性及(3) 小亞基的 5 3DNA 外切酶活性。 (1)需要以單鏈 DNA 作模板，并需要 3為一 OH的引物。 (2) 從游離的 3一 OH 末端降解單鏈或雙鏈DNA 成為單核苷酸， 其意義在于識別和消除不配對的核苷酸，保證 DNA 復制的忠實性。(3) 從

43、5末端降解雙鏈DNA 成單核苷酸或寡核昔酸。也降解DN A RNA雜交體的 RNA 成分 (具有 RNA 酶H 活性 )。利用該酶活性，可進行切口平移法標記DNA 。2大腸桿菌 DNA 聚合酶大片段(Klenow) 酶：該酶是用枯草桿菌蛋白酶或胰蛋白酶降解大腸桿菌DNA 聚合酶 I而得到的該酶大片段，亦稱Klenow酶，從全酶中去除了5 3外切酶活性，保留了5 3DNA聚合酶活性及3 5外切酶活性。Klenow 酶的用途：(l) 用同位素標記DNA 片段的末端。(2)補平 5粘端。 (3)合成 cDNA 的第二條鏈。(4)Sanger雙脫氧法進行序列分析。(5) 定位突變。3 T4 噬菌體 D

44、NA 聚合酶：來源于 T4噬菌體感染的大腸桿菌，與Klenow 相似，有 5 3聚合酶活性及3 5外切酶活性，但其3 5外切酶活性對單鏈作用比對雙鏈DNA 更強，外切酶活性比Klenow 酶強 200倍。因其不從單鏈DNA 模板上置換寡核苷酸引物，故在體外誘變反應中效率比Klenow 酶更強。該酶用途基本與Klenow 一致，不同之處在于可對3突出端的 DNA 分子進行末端標記。這是利用其強勁的3 5外切酶活性切除3突出端，產生 3凹端。4 T7 噬菌體 DNA 聚合酶及測序酶：T7 噬菌體 DNA 聚合酶來源于T7噬菌體感染的大腸桿菌，是兩種蛋白的復合物。其作用與相似，具有 5 3聚合酶活性

45、及35外切酶活性，無5 3外切酶活性。該酶是所有DNA成能力最強的一個， 所合成的 DNA 的長度亦比其他聚合酶長得多。其 3 5外切酶活性比Klenow 酶聚合酶中持續合 Klenow 酶強 1000倍。該酶的用途與T4DNA 聚合酶相似。另外還可用于拷貝長段模板的引物延伸反應。測序酶是經修飾的T7噬菌體 DNA 聚合酶，該酶具有5 3的聚合酶活性，其持續合成能力很強，而3 5外切酶活性則是喪失的，故該酶是Sanger雙脫氧測序法對長片段DNA 進行序列分析的理想用酶。5 TaqDNA 聚合酶：該酶是一種耐熱的依賴于DNA的 DNA 聚合酶，具有 5 3聚合酶活性及依賴于5 3聚合作用的外切

46、酶活性，聚合酶的最適反應溫度為7580。該酶的主要用途是進行PCR反應。6逆轉錄酶 (依賴于 RNA 的 DNA 聚合酶 )：商品化的逆轉錄酶有兩種，均具有53DNA 聚合酶活性，其底物是RNA 或DNA 模板及帶 3一 OH 的RNA 或 DNA 引物。 RNA 酶 H活性 (5 3及 3 5外切核糖核酸酶活性)：能持續地、特異地降解RNA-DNA雜交體中的 RNA 。兩種逆轉錄酶在許多方面有差別，如RNA 酶H 活性強弱、最適反應溫度及pH等。逆轉錄酶的主要作用是將 mRNA 反轉錄成 cDNA ，并可用反轉錄成的cDNA 進行序列分析， 再推導出 RNA 序列。7末端轉移酶 (末端脫氧核

47、苷酸轉移酶 )：來源于小牛胸腺，在二價離子存在條件下，催化dNTP加于 DNA 分子的 3一 OH端， DNA 分子可以是單鏈，亦可是雙鏈 (主要是 3一 OH 突出的雙鏈 )。在適當條件下，也可在DNA 平末端或 3凹端的 3一 OH 端加上 dNTP。該酶主要用途是給載體或cDNA 加上互補的同聚物尾，其次是標記DNA 片段的 3一OH 端。二、堿性磷酸酶：包括細菌堿性磷酸酶 (BAP) 和小腸堿性磷酸酶 (C P)，其作用是去除DNA 、 RNA 、NTP 和dNTP 的 5磷酸根。可用于去除 DNA 片段的 5-P，以防自身環化；另外在用32P標記 5末端前，可先用其去除 DNA 或R

48、NA 上的 5-P。三、核酸酶：1Sl核酸酶：降解單鏈DNA 或 RNA ，產生帶 5磷酸的單核苷酸或寡聚核苷酸。酶量中等時可在切口或小缺口處切割雙鏈核酸，酶量大時則可切割雙鏈核酸。該酶用于去除DNA 片段粘末端而產生平端。打開 cDNA 中發夾結構， 使其成平端。 分析 DNA:RNA 雜交體的結構， 可證明基因內部內含子的存在。2綠豆核酸酶(Mung-bean 酶 )：將單鏈 DNA 降解為 5端帶磷酸的單核苷酸或寡核苷酸。只有酶量大時才能將雙鏈核酸完全降解，該酶的作用與 Sl酶相似，但比 Sl 酶溫和。其主要用途是將 DNA 突出端改為平端。3核糖核酸酶： RNaseA 來源于牛胰， 是

49、內切核糖核酸酶， 專門降解 RNA 。RNaseT，來自米曲霉菌，具有堿基專一性， 特異性降解 RNA 成 3鳥苷酸或 3端為鳥苷酸的寡核昔酸鏈。 這兩種酶的用途： 在質粒提取時降解 RNA ；從 DNA-RNA 雜交體中去除未雜交的 RNA 區。4脫氧核糖核酸酶(DNA 酶 )：為內切核酸酶，水解單鏈或雙鏈DNA 。用途缺口平移法標記DNA 時，先在 DNA 雙鏈上隨機產生切口，以及其它需產生單切口的用途。建立隨機克隆，以便進行序列分析。5外切核酸酶III(ExoIII)：催化雙鏈 DNA3 羥基端逐一除去單核苷酸。底物為線狀雙鏈或缺口的環狀 DNA ，不降解單鏈 DNA 及 3粘端雙鏈 D

50、NA 。此外還具有另二種活性，即無嘌呤內切核酸酶活性，RNA 酶 H活性及 3磷酸酶活性 (去除 3末端磷酸 )。除以上所介紹的工具酶外，還有其他常用的基因工程工具酶，它們的作用在這里不詳細介紹了。DNA 及切口 DNA 特異的第六章目的基因的制備與克隆隨著基因工程研究工作的不斷深入，絕大多數具有重要經濟意義的轉基因動物、轉基因植物品種的培育獲得成功，表明動物、植物的許多優良品質特性，完全可以通過轉基因技術得以實現。遺憾的是，目前已經分離鑒定的具有優良品質的基因不多，致使許多重要的有經濟價值的生物體無法培育出性狀更加優越的轉基因品系，因此目的基因的分離引起了分子生物學家和遺傳學家的關注。一般來

51、說，目的基因的克隆分為兩大類：一類是構建感興趣的生物個體的基因組文庫，即將某生物體的全基因組分段克隆，然后建立合適的篩選模型，從基因組文庫中挑出含有目的基因的重組克隆；另一類是利用 PCR 擴增技術甚至化學合成法體外直接合成目的基因， 然后將之克隆表達。 這兩大類戰略的選擇往往取決于對待克隆目的基因背景知識的了解程度、目的基因的用途以及現有的實驗手段等因素，只有在目的基因克隆戰略確定之后，才能制訂基因克隆的各項單元操作方案。第一節直接分離法限制性核酸內切酶酶切分離法適于從簡單基因組中分離目的基因。質粒和病毒等DNA分子小的只有幾千堿基，大的也不超過幾十萬堿基，編碼的基因較少，獲得目的基因的方法也比較簡單。1對己測序的 DNA 分子，只需用已知識別序列的限制性核酸內切酶進行一次或幾次切割，分離純化所需 DNA 片段，與適當載體重組后轉化受體菌后即可得到目的基因的克隆。2