1、園 藝 學 報 2014，41（6）：11981206 http: / www. ahs. ac. cn acta horticulturae sinica e-mail: yuanyixuebao 收稿日期：20131211；修回日期：20140226 基金項目：國家自然科學基金項目（31360472）；江西省自然科學基金項目（20132bab204025） * 通信作者 author for correspondence（e-mail：xiaobiaoxu） 野生毛花獼猴桃果實表型性狀及ssr遺傳多樣性分析 湯佳樂，黃春輝，吳 寒，郎彬彬，曲雪艷，徐小彪* （江西農業大學農學院，南昌 33

2、0045） 摘 要：以江西省武功山境內的70份野生毛花獼猴桃種質資源為試材，對其果實表型性狀、ssr遺傳多樣性及其親緣關系進行分析和評價。根據upov（國際植物新品種保護聯盟）公布的獼猴桃屬品種測定標準對供試材料的果實表型性狀進行觀測。參照獼猴桃遺傳連鎖圖譜，選用分布于中華獼猴桃基因組中的70對ssr引物對供試材料進行多態性分析。結果表明，在70對引物中，21對引物成功擴增出多態性片段。隨機采集的70份野生毛花獼猴桃種質資源中，其果實表型性狀和dna分子水平均存在豐富的遺傳多樣性。基于upgma聚類分析將供試的野生毛花獼猴桃資源分為果實圓形和橢圓形混合組、果實橢圓形組以及果實圓柱形組。21對多

3、態性高的ssr引物共檢測出127個等位變異位點，變異范圍在2 12之間，平均每對ssr引物可檢測到6.04個等位位點。遺傳相似系數（gs）變異范圍為0.5306 0.9252。gs值在0.65水平上upgma聚類分析可將供試的野生毛花獼猴桃種質資源劃分成、和 共3個組，這與果實表型性狀分析的結果基本一致。這些遺傳變異豐富的種質資源可為獼猴桃育種提供有價值的材料。 關鍵詞：毛花獼猴桃；野生；ssr標記；果實表型性狀；遺傳多樣性 中圖分類號：s 663.4 文獻標志碼：a 文章編號：0513-353x（2014）06-1198-09 genetic diversity of wild actini

4、dia eriantha germplasm based on fruit traits and ssr markers tang jia-le，huang chun-hui，wu han，lang bin-bin，qu xue-yan，and xu xiao-biao* （college of agronomy，jiangxi agricultural university，nanchang 330045，china） abstract：genetic diversity and genetic relationship of 70 actinidia eriantha benth. ger

5、mplasms sampled from wugong mountain in jiangxi province were estimated based on the fruit morphological traits and ssr markers. the fruit phenotypic traits were collected based on the upov（international union for the protection of new varieties of plants）for kiwifruit. seventy srr primer pairs even

6、 distributed on genetic linkage map of actinidia chinensis were used to initially assess the polymorphism. of the 70 primer pairs tested，21 pairs successfully amplified polymorphic fragments. the collected 70 accessions have expressed rich genetic diversity in both fruit traits and ssr markers. seve

7、nty accessions were clustered into three groups including the circular and elliptic group，elliptic group and the oblong group 6期 湯佳樂等：野生毛花獼猴桃果實表型性狀及ssr遺傳多樣性分析 1199 based on upgma analysis. one hundred and twenty-seven bands were amplified using 21 primer pairs，and the number of allele per locus rang

8、ed from 2 to 12，with an average of 6.04. the genetic similarity ranged from 0.5306 to 0.9252. upon on the upgma cluster analysis，70 accessions were separated into three major groups when gs values were set at the level of 0.65，which was basically consistent with the results of the fruit traits. the

9、high level of genetic variation of a. eriantha suggested that these accessions may be useful to provide breeding materials for kiwifruit. key words：actinidia eriantha；wild；ssr marker；fruit morphological traits；genetic diversity 獼猴桃（actinidia spp.）原產于中國。相對于龐大的野生種質資源，獼猴桃的栽培品種只占了很小的一部分。目前獼猴桃品種選育主要還是通過從

10、野生資源中選擇或雜交育種（黃宏文 等，2000）。豐富的野生獼猴桃種質資源是獼猴桃品種選育和產業可持續發展的基礎（huang et al.，2004；ferguson & huang，2006）。 目前商業化栽培利用的獼猴桃主要是美味獼猴桃和中華獼猴桃（劉磊 等，2013），而毛花獼猴桃（actinidia eriantha benth.）多處于野生狀態，生產實踐中推廣應用的毛花獼猴桃品種極少（張佳佳 等，2011）。毛花獼猴桃果實asa含量較高（5.00 13.79 mg g-1 fw），是中華獼猴桃的3 4倍（鐘彩虹 等，2011）。毛花獼猴桃作為中國特有的野生種質，廣泛分布于云南、廣西、

11、貴州、湖南、江西、福建和浙江。通過對野生毛花獼猴桃種質資源進行果實表型性狀及ssr遺傳多樣性分析的研究，可了解其種內的遺傳背景，選擇優良的育種親本材料，提高育種效益。 weising等（1996）研究發現二倍體中華獼猴桃的大多數ssr位點擁有較高的雜合度。huang等（1998）用20個ssr位點研究發現二倍體和四倍體中華獼猴桃表現出很高的雜合度，在dna水平上的多倍體獼猴桃具有更豐富的多樣性。cipriani等（2002）用ssr標記在對獼猴桃進行遺傳圖譜構建時尋找到了控制果實質量的數量性狀位點連鎖的標記。tsetolin等（1997）采用“假測交”的作圖技術，挑選中華獼猴桃和硬齒獼猴桃雜交

12、后代對251個標記進行篩選，獲得了105個ssr位點，應用ssr和rflp標記構建了獼猴桃遺傳連鎖圖譜。 本研究中通過對江西武功山境內的野生毛花獼猴桃進行實地調查和資源收集，在對果實表型性狀分析的基礎上，采用ssr標記技術對野生毛花獼猴桃進行遺傳多樣性分析，旨為其優異基因發掘利用和野生株選優及其遺傳育種工作提供理論依據。 1 材料與方法 1.1 試驗材料及其果實表型性狀的觀測 2012年78月對江西省武功山境內的野生毛花獼猴桃種質資源進行了普查，供試材料為隨機采集的70份野生毛花獼猴桃種質的幼葉和果實，用冰盒保存并運回實驗室，置于20 超低溫冰箱中保存備用。 每份毛花獼猴桃種質隨機選取10個果

13、實，根據upov（國際植物新品種保護聯盟）公布的獼猴桃屬品種測定標準（upov，2012）對果實的8個表型性狀（表1）進行測定和評價。所有的表型性狀的測定結果按照upov標準進行分類和采用ntsys-pc2.1進行賦值轉換成表型數據矩陣。 1.2 基因組dna的提取與ssr分析 采用ctab法提取樣品幼葉基因組dna，用紫外分光光度計檢測dna質量和濃度，20 保1200 園 藝 學 報 41卷 存備用。 參照testolin等（2001）構建的獼猴桃ssr遺傳連鎖圖譜，選用廣泛分布于中華獼猴桃基因組中的70對srr引物（palombi & damiano，2002；zheng et al.，

14、2004；korkovelos et al.，2008），首先隨機選擇8份野生毛花獼猴桃種質材料進行擴增，篩選出多態性較好的21對ssr引物，再對70份野生毛花獼猴桃種質資源進行擴增。pcr擴增程序為94 預變性5 min；94 變性45 s，50 60 退火45 s，72 延伸45 s，30個循環；72 延伸10 min。擴增產物10%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，快速銀染法染色。 1.3 數據統計分析 對果實表型性狀賦值后，采用excel 2007進行頻率分析。根據ssr分析的結果，將每條ssr引物擴增出的每一條帶視為1個位點，相同遷移率的記為1，無條帶的記為0，統計等位位點數、多態性位點數和多

15、態性信息含量（pic）參數值，不具多態性的條帶不予統計。采用ntsys-pc2.1軟件計算野生毛花獼猴桃的遺傳距離并按照非加權配對平均法（upgma）和shan程序進行聚類分析，并對聚類分析得到的果實表型性狀歐式距離矩陣和ssr標記遺傳距離矩陣進行mantel相關性檢測（lapointe & legendre，1992）。 2 結果與分析 2.1 野生毛花獼猴桃果實表型性狀分析 調查結果（表1）表明，70份野生毛花獼猴桃的果實形狀變化豐富，果實形狀以圓柱形居多（49%），其次為橢圓形（37%）和圓形（14%）；果心橫截面有圓形、扁圓形和橫向橢圓形，所占比例分別為27%、32%和41%；果實橫截

16、面以圓形居多（61%），扁圓形和橫向橢圓形所占比例分別為23%和16%；果基形狀以微傾斜（74%）為主，果實傾斜則占26%；果頂形狀除了圓形所占比例為41%外，其它微凸和深凸所占比例分別為37%和22%；毛被顏色為白色和棕色，各占50%。 表1 野生毛花獼猴桃資源果實性狀描述及頻率統計 table 1 the description and frequency of fruit traits for wild actinidia eriantha benth. 果實性狀 fruit trait 性狀描述 description 頻率/% frequency 果實性狀 fruit trait 性

17、狀描述 description 頻率/% frequency 果實形狀 圓柱形 oblong 49 果實橫截面 圓形 circular 61 fruit shape 橢圓形 elliptic 37 shape in cross 扁圓形 oblate 23 圓形 circular 14 section（at median） 橢圓形 elliptic 16 果實橫徑 寬 broad 24 果基形狀 微傾斜 weakly sloping 74 fruit width 中等 medium 50 shape of shoulder 傾斜 strongly sloping 26 窄 narrow 26 a

18、t stalk end 果實縱徑 長 long 36 果頂形狀 圓形 circular 41 fruit length 中等 medium 38 stylar end 微凸 weakly blunt protruding 37 短 short 26 深凸 strongly blunt protruding 22 果心橫截面 圓形 circular 27 毛被顏色 白色 white 50 shape in core in 扁圓形 oblate 32 color of hairs 棕色 brown 50 cross section 橢圓形 elliptic 41 根據果實的表型性狀對野生毛花獼猴桃

19、進行upgma聚類分析，70份野生毛花獼猴桃資源分為3個組（圖1）。a組屬于果實圓形和橢圓形混合組，果基形狀微傾斜，毛被白色和棕色混合分布。a組又可以分為兩個亞組：a-1亞組果實橫徑寬，縱徑短，果心橫截面橢圓形，果實橫截面扁圓或 6期 湯佳樂等：野生毛花獼猴桃果實表型性狀及ssr遺傳多樣性分析 1201 圖1 野生毛花獼猴桃70份資源果實性狀upgma聚類圖 a-1：果實橫徑寬、縱徑短，果心橫截面橢圓形，果實橫截面扁圓或橢圓形，果頂圓形；a-2：果實橫徑中等或窄、縱徑中等， 果心橫截面圓形或扁圓形，果實橫截面圓形，果頂微凸；b：果實橢圓形，縱徑短，果頂微凸，毛被白色； c-1：果實橫徑中等，果

20、實橫截面圓形；c-2：果實橫徑窄，果實橫截面扁圓。 fig. 1 upgma dendrogram of 70 wild actinidia eriantha benth. accessions based on fruit traits a-1：fruit width broad，fruit length short，shape in core in cross section elliptic，shape in cross section（at median）oblate or elliptic， stylar end rounded；a-2：fruit width medium or n

21、arrow，fruit length medium，shape in core in cross section circular or oblate， shape in cross section（at median）circular，stylar end weakly blunt protruding；b：fruit shape elliptic， fruit length short，stylar end weakly blunt protruding，color of hairs white； c-1：fruit width medium，shape in cross section（

22、at median）circular； c-2：fruit width narrow，shape in cross section（at median）oblate. 1202 園 藝 學 報 41卷 橢圓形，果頂圓形；a-2亞組果實的橫徑中等或窄，縱徑中等，果心橫截面圓形或扁圓形，果實橫截面圓形，果頂微凸。b組果實橢圓形，縱徑短，果頂微凸，毛被為白色。c組果實圓柱形，果實的縱徑長，果心橫截面橢圓形，果基性狀傾斜，果頂深凸，毛被白色和棕色混合分布。c組又分為兩個亞組：c-1亞組果實的橫徑中等，果實橫截面圓形；c-2亞組果實橫徑窄，果實橫截面扁圓。 2.2 野生毛花獼猴桃ssr標記分析 利用所選

23、擇的70對ssr引物對野生毛花獼猴桃種質進行分析，共篩選出21對多態性高的ssr引物，通過對70份野生毛花獼猴桃種質群體的擴增，并對等位位點數、多態位點數以及多態性信息含量（pic）等進行多樣性統計（表2）。兩對ssr引物擴增得到的基因片度長度在75 400 bp，pcr總擴增總計得到127個等位位點，等位位點數在2 12之間，平均每對ssr引物可以檢測到6.04個等位位點數。其中多態性位點最豐富的是引物udk96-040，有12個等位位點變異，而引物udk97-401只檢測到了兩個等位位點變異。多態信息含量（pic值）變化范圍為0.358 0.837，平均為0.691。 表2 ssr 多態性

24、引物的特征 table 2 the characteristics for ssr polymorphism primer 引物編號 primer code 片段大小/ bp size range 等位位點數 number of alleles 多態位點數 number of polymorphic alleles 多態信息含量 pic udk96-001 200 300 3 3 0.520 udk96-026 150 200 4 4 0.640 udk96-030 100 200 6 6 0.704 udk96-039 150 200 4 4 0.480 udk96-040 50 150 1

25、2 12 0.773 udk96-053 100 200 5 5 0.747 udk97-401 75 150 2 2 0.358 udk97-408 100 200 8 8 0.774 udk97-411 75 150 4 4 0.652 udk97-414 100 150 5 5 0.562 uth03-04 100 300 8 8 0.832 udk99-143 100 200 8 8 0.837 ke221 75 200 7 7 0.725 ke227 100 250 7 5 0.652 97-421 200 400 7 7 0.756 714 100 150 11 9 0.786 7

26、19 250 350 3 3 0.685 722 100 150 5 5 0.812 751 150 350 7 7 0.748 761 100 350 10 9 0.695 764 150 250 6 6 0.775 2.3 遺傳相似系數及聚類分析 通過21對多態性ssr引物分析，70份野生毛花獼猴桃種質材料的遺傳相似系數（gs）變異范圍為0.5306 0.9252，平均值為0.7805。其中種質66和68、種質45和53的gs值最大（0.9252），表明兩者的親緣關系很近，而種質25和47的gs值最小，說明兩者的親緣關系最遠，兩者的相似性只有為0.5306。 根據材料間的遺傳相似系數，采用

27、upgma法對野生毛花獼猴桃種質進行聚類分析（圖2），利用21對ssr標記能將70份野生毛花獼猴桃種質相互區分，在gs值在0.65水平上將所有的材料6期 湯佳樂等：野生毛花獼猴桃果實表型性狀及ssr遺傳多樣性分析 1203 劃分成、和 共3個組。組包括了27份種質材料，包含了全部10份果實圓形的種質和17份的果實橢圓形的種質。組包括19份種質材料，果實形狀主要為橢圓形，但也包括了5份的圓柱形的種質材料。組則包括了24份種質材料，種質的果實形狀主要為圓柱形，同時也聚集了3份橢圓形的種質材料。圓形、橢圓形和圓柱形果實的種質都有各自聚類的趨勢，但三者之間并沒有完全分開。 圖2 野生毛花獼猴桃材料ss

28、r標記遺傳相似（gs）聚類圖 ：果實圓形或橢圓形；：果實橢圓形或圓柱形；：果實圓柱形或橢圓形。 fig. 2 cluster result of wild actinidia eriantha benth. materials based on ssr markers ：fruit shape circular or elliptic；：fruit shape elliptic or oblong；：fruit shape oblong or elliptic. 1204 園 藝 學 報 41卷 2.4 野生毛花獼猴桃果實表型性狀與ssr標記相關性分析 為了解野生毛花獼猴桃果實表型性狀的遺傳多

29、樣性和ssr分子標記之間可能存在的內在聯系，將野生毛花獼猴桃果實表型性狀歐式距離矩陣和ssr標記遺傳距離矩陣進行mantel相關性分析，結果表明二者相關性達到極顯著水平（r = 0.814，p 0.01），兩種分析方法得出的結果具有很大程度的吻合性。野生毛花獼猴桃不同單株之間在ssr標記遺傳距離矩陣中親緣關系的遠近與果實表型性狀變異的程度大致吻合，果實表型性狀歐式距離矩陣中相距較近的單株之間其遺傳距離也相對較小。 3 討論 3.1 野生毛花獼猴桃果實表型性狀分析 近年來，對野生植物的遺傳多樣性和核心種質的研究是國內外研究的熱點問題（馬玉敏 等，2008）。通過對野生居群的表型性狀的調查和研究，

30、不僅可以對野生資源進行科學有效地保護和合理地開發利用提供指導意義，而且還可以為推動保護生物學和遺傳育種提供重要的理論基礎。雖然野生毛花獼猴桃在中國多個省份有分布，但大多數是出于零星分布的狀態，再加上人為的因素，毛花獼猴桃資源破壞很嚴重。本研究中對江西省武功山境內的野生毛花獼猴桃居群進行實地調查中發現，70份野生毛花獼猴桃種質資源集中分布在（n273214，e1140722）至（n273252，e1140747）之間，分布較集中，超出這一范圍則所發現的野生毛花獼猴桃極少，基本處于零星分布狀態。在獼猴桃種質資源進行評價和遺傳育種工作中，果實的表型性狀是一類十分重要的評價指標（黃宏文 等，2000）

31、。通過對收集的70份野生毛花獼猴桃果實表型性狀的研究，發現毛花獼猴桃在野生狀態下存在豐富的表型性狀遺傳多樣性，如在果實形狀、果實橫徑、果實縱徑、果心及果實橫截面形狀、果基及果頂形狀以及毛被的顏色等性狀上都表現出了很高的多樣性和差異性。同時，豐富的表型性狀遺傳多樣性也為野生毛花獼猴桃的品種選育和遺傳育種的親本選擇提供豐富的種質資源。因此，在對野生毛花獼猴桃資源進行野生選優工作中，發現具有優良的果實表型性狀的單株，從中培育出適應性和抗性強、果實表型性狀優良的毛花獼猴桃品種是今后研究工作的重點方向。 3.2 野生毛花獼猴桃ssr遺傳多樣性分析 選擇優良性狀的親本材料是進行獼猴桃育種工作的前提和基礎，

32、親本材料遺傳背景狹窄則會導致難以培育出優良性狀的品種。因此，通過選擇優良性狀的親本材料，比較材料間親緣關系的遠近，對于獼猴桃新品種的選育和品種改良工作具有重要的生產指導意義。利用ssr分子標記技術進行獼猴桃遺傳多樣性的研究，國內外已有相關報道。鄭軼琦等（2003）利用9對ssr引物，對中國栽培的48個獼猴桃品種（品系）進行了遺傳多樣性研究，結果表明中國獼猴桃栽培品種具有較高的遺傳多樣性，ssr標記在獼猴桃品種中有較高鑒定效率；栗琪等（2004）對中華獼猴桃（a. chinensis）和美味獼猴桃（a. deliciosa）的9個天然居群的遺傳多樣性進行了初步分析，通過對14對獼猴桃引物的篩選，

33、8對重現性好的引物擴增結果表現出良好的多態性。liu等（2010）和劉亞令等（2006）對毛花獼猴桃自然居群進行了ssr分析，結果表明毛花獼猴桃自然居群的多態信息含量變化范圍為 0.705 0.827。然而，本研究中在對武功山境內的野生毛花獼猴桃ssr遺傳多樣性分析時，70份種質資源材料的多態信息含量變化范圍為0.358 0.837。造成武功山境內自然居群遺傳多樣性含量變化范圍不同的原因除了本身的群體結構差異之外，可能主要是由于隨機選擇ssr位點的所帶來的影響（劉亞令 等，2008）。雖然所收集的70份野生毛花獼猴桃種質資源為一個野生居群，各個單株6期 湯佳樂等：野生毛花獼猴桃果實表型性狀及s

34、sr遺傳多樣性分析 1205 都分布在很近的地域范圍，同處在相同或相近的氣候和地域環境條件下，野生毛花獼猴桃單株之間具有一定的親緣關系，但各自遺傳背景的卻存在一定的多樣性。因此，通過ssr分子標記分析野生毛花獼猴桃種質資源遺傳多樣性，可為野生毛花獼猴桃居群優良單株的選擇在分子水平上提供了依據。野生毛花獼猴桃資源開發與利用工作重點是應該結合毛花獼猴桃具有高asa含量的特性，發掘與其相關的ssr標記位點（湯佳樂 等，2014），揭示野生毛花獼猴桃asa富集的分子特征，并有效地促進改良獼猴桃果實品質性狀與種質創新。 3.3 野生毛花獼猴桃果實表型性狀與ssr標記相關性分析 歲立云等（2013）在對中

35、華獼猴桃和美味獼猴桃紅肉類型獼猴桃調查研究中發現兩種獼猴桃親緣關系較近，有按地理來源優先聚類的趨勢，且果實性狀數據和aflp數據之間具有極顯著的相關性。本研究中通過對70份野生毛花獼猴桃種質資源基于遺傳距離的聚類分析，gs值在0.65水平上將所有的材料劃分成、和 3個組，說明野生毛花獼猴桃不同單株之間存在較大的遺傳差異。進一步研究發現野生毛花獼猴桃資源有按照圓形、橢圓形和圓柱形果實形狀聚合在一起的趨勢，但三者之間并沒有完全的分開，果實表型性狀分析與ssr標記分析聚類的結果具有極顯著的相關性（r = 0.814，p 0.01）。這說明同一個地理地域來源的野生毛花獼猴桃種質資源ssr分子標記上的遺

36、傳多樣性在一定程度上可以反映表型性狀上的多樣性。因此，今后在對獼猴桃進行品種改良和遺傳育種工作過程中，野生毛花獼猴桃在果實表型性狀和ssr分子標記上表現出的豐富的遺傳變異能夠為獼猴桃產業提供有價值的育種材料。 references cipriani g，huang q g，testolin r. 2002. towards a linkage map in kiwifruit（actinidia chinensis）based in simple sequence repeat（ssrs）. proceeding of the fifth international symposium kiw

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