1、KPL O O O D-PL O O OH 以近平滑假絲酵母Candida parapsilosis及小紅酵母Rhodotorula minuta為催化劑，葡萄糖作為能源，進行還原反應，在28， pH46下反應兩天，還原率達到100%，反應液中產品D-泛解酸內 酯的濃度達到5090 g/L，光學純度達到94%98%e.e.。 O OH COOH KPAD-PL O O OH OH OH COOH D-PA O O O KPL 與以前面的酮基泛解酸內酯還原方法相比較，酮基泛解酸還原方法具 有以下優點：酮基泛解酸還原酶的產生菌都屬于Agrobacterium屬，而許 多屬的微生物具有酮基泛解酸內酯

2、還原酶的活性。酮基泛解酸還原酶的 光學選擇性很高（98% e.e.以上），而酮基泛解酸內酯還原酶的光學選擇 性與產生該酶的微生物所在屬或者種無關。這些結果表明催化酮基泛解酸 還原的酶為單一酶（可能是酮基泛解酸還原酶），而酮基泛解酸內酯的還 原酶可能是多種具有不同光學選擇性的還原酶共同作用的。 1.1.3 不對稱氧化和還原兩步酶法轉化消旋泛解酸內酯 L-PL OH O O O O O KPL OH O O D-PL Nocardia asteroides可以不對稱氧化DL-泛解酸內酯中的L-型成酮基 泛解酸內酯，酮基泛解酸內酯又可以由Candida parapsilosis不對稱還原成 D-泛解

3、酸內酯。在這個兩步酶催化反應體系中，D-型的泛解酸內酯始終 沒有被修飾，而是L-型的泛解酸內酯經過兩步微生物酶催化，最終變成了 D-型。 O OH COOH KPA D-PL O O OH OH OH COOH D-PA O O O KPL L-PL OH O O OH OO 可以用來代替Candida parapsilosis，與Nocardia asteroides 共同進行反應，它可以在酮基泛解酸內酯自發水解為酮基泛解 酸后，將其不對稱還原成D-泛解酸，D-泛解酸再酯化得到D-泛 解酸內酯。這一系列反應用洗滌過的細胞可在同一生物反應器 內一步轉化完成。 O O OH OH OH COOH

4、 O O OH + 內酯化，消旋化 DL-PLL-PAD-PL 用L-立體專一性內酯水解酶水解，將L-泛解酸內酯水解為 L-泛解酸，可直接得到未水解的D-泛解酸內酯。L-泛解酸可 以回收，經過消旋化反應得到DL-泛解酸內酯重新用于拆分。 + 消旋化 O O OH DL-PL O O OH L-PL OH OH COOH D-PA O O OH D-PL 內酯化 用鐮孢霉菌Fusarium等微生物選擇性水解DL-泛解酸內 酯生成D-泛解酸，分離后的D-泛解酸在酸性條件下加熱， 轉化為D-泛解酸內酯。 D-泛解酸內酯水解酶的串珠鐮孢霉菌Fusarium moniliformeSW-902，用于發

5、酵生產的菌絲體作酶源，水解DL-泛解酸內酯中的D-泛解酸內酯，分離得到D-泛 解酸，再經過內酯化反應，可得到很高光學純度的D-泛解酸內酯。該方法不要求 水解徹底，反應時間短，得到產品D-泛解酸內酯的光學純度高，工藝控制簡單， 反應容易控制，底物的濃度可以很高。此項技術已在浙江鑫富生化公司實施產業 化。 異丁醛等 D-泛酸鈣 D-泛醇 D-泛解酸內酯的酶法拆分工藝流程 L-泛解酸內酯 DL-泛解酸內酯 異丁醛， 甲醛，HCN 消旋化反應 D-泛解酸 微生物酶 D-泛解酸內酯 內酯化反應 or D-泛酸鈣 D-泛醇 具有特定功能基團的手性醇是用于合成手性 藥物和其他手性化學品重要的中間體。3-氯-

6、1-苯 丙醇是一種重要的手性藥物中間體。光學純的3- 氯-1-苯丙醇可用于制備S-(+)-氟西汀，R-(-)-托莫 西汀，()-尼索西汀。S-(+)-氟西汀是R-(+)-氟西 汀藥效的3倍；R-(-)-托莫西汀是消旋體托莫西汀 藥效的2倍，是S-(-)-托莫西汀藥效的9倍。以上三 種藥物均為抗抑郁藥，可通過下圖制備。 由由3-氯氯-1-苯丙醇制備手性抗憂郁藥苯丙醇制備手性抗憂郁藥 氟 西 汀 氟 西 汀 托 托 莫 莫 西 西 西西 汀汀 汀汀尼尼索索 菌種菌種 Saccharo myces P2 Saccharom yces B5 Candida 104 Candida 1257 產率產率

7、(%) 305048100 光學純光學純 度度 ( ee%) 7410010033* A：3-氯-1-苯丙酮（31.166min），B：S-3-氯- 1-苯丙醇（42.613min） m in3234363840424446 pA 100 120 140 160 180 30 A B C A：3-氯-1-苯丙酮（31.166min），C: R-3-氯-1-苯丙醇 (44.022min) min3032343638404244 46 pA 93.5 94.5 95.5 96.5 97.5 C A 3-氯-1-苯丙 酮3-氯-1-苯丙 醇 氧化還 原酶 乙 醇 乙 醛 乙 醇脫氫酶 NADH NA

8、D+ + strains Reaction condition Anoxybiotic culture Oxybiotic culture Yield(%)ee(%)yield(%) ee(%) shaking 0/50100 standing 0 /28100 Candida 104 shaking 0/48100 standing 0/26100 Saccharo- myces B5 重復利用次數重復利用次數 Saccharomyces B5 Candida 104 yield(%)ee(%)yield(%)ee(%) 1 5110048 100 2 50 100 48 100 350 1

9、00 47100 4 37 1000/ 5 0/0/ S- S- - -氰基氰基-3-3-苯氧基芐醇苯氧基芐醇 ( (S-CPBA )S-CPBA )的合成與應用的合成與應用 O CN OH S-CPBA O CN OH R-CPBA O H O O CN OH + HCN mPBA (S)-CPBA catalyst 3-苯氧基苯甲醛（mPBA）的不對稱羥氰化反應 手性金屬復合物 生物堿催化 多肽催化 醇腈酶（Oxynitrilases） 或醇氰裂解酶（hydroxynitrile lyases） 催化劑: 3.1 拆分制備S-CPBAS-CPBA的過程的過程 RCN OH (R,S)-CP

10、BA (S)-CPBA Pa-Hnls HCN mPBA RCN OH RCN O S-醇腈酶催化拆分合成S-CPBA RCN OH (R,S)-CPBA(S)-CPBA RCN OAc RCN OH (R,S)-CPBAc 水解酯化 Ac2OLipase 脂肪酶催化選擇性水解合成S-CPBA RCN OH (R,S)-CPBA(R)-CPBA RCN OAc RCN OH (S)-CPBAc + lipase H OAc 酶催化不對稱酯化拆分合成S-CPBA lipase R-OH CN ChnRxn OAc OPh CN ChnRxn OH OPh CN ChnRxn OAc OPh (R

11、,S)-CPBAc (S)-CPBA (R)-CPBAc R-OAc 酶催化不對稱醇解合成S-CPBA RH O (R,S)-CPBAmPBA RCN OH RCN OAc (S)-CPBAc lipase OH CN AcO anion exchange resin k=l= m= n= a=b=Cld= O O e=O j= OCH2 i=h=g=OF f=O F CH3c= CH3 O (CH3)2CHCH3(CH2)4 其中R為： 化學-酶催化一鍋化合成S-CPBA lipase R-OH organic solvents CN OAc OPh CN OH OPh CN OAc OPh

12、 (R,S)-CPBAc (S)-CPBA (R)-CPBAc R-OAc 酶反應時 間 反應溶劑底物醇 S-CPBA mPBA(mmol/l) Yield%e.e.% 2228hr THF甲醇48.7499.16 8.97 乙醇49.9899.05 7.68 二氯甲烷甲醇35.5998.95 30.34 乙醇34.8799.11 24.11 乙醚甲醇50.1396.13 17.22 乙醇50.7797.69 12.43 2430hr THF甲醇49.6095.37 20.58 乙醇46.2296.15 15.4 氯仿甲醇20.4691.57 62.65 乙醇21.3892.73 55.34

13、甲苯甲醇26.5274.02 97.88 乙醇20.8775.19 92.55 OH CH3COOCHCH2 OCOCH3 CH3CHO+ + (R, S) (R) Lipase 無溶劑體系酶催化轉酯化反應式 生物催化法制備手性2-芳基丙酸 2-芳基丙酸類非甾體抗炎藥(Non-Steroid Anti- Inflamming Drugs，NSAIDs)，是一類重要的消炎鎮痛藥， 可用化學通式ArCH(CH3)COOH表示。目前已經發現具有 解熱、消炎鎮痛作用的2-芳基丙酸類藥物有幾十種，大多 數已經工業化生產。常見的品種有：萘普生(Naproxen)、 布洛芬(Ibuprofen)、氟比洛芬(

14、Flurbiprofen)、酮基布洛芬 (Ketoprofen)、舒洛芬(Suprofen)等等。以酮基布洛芬為例， 其消炎鎮痛作用比阿司匹林強150倍，解熱作用強100倍， 臨床上用于治療慢性類風濕關節炎、變形關節炎、外傷和 術后疼痛。 CH3 COOH MeO CH3 COOH OCH3 COOH CH3 COOH F S O CH3 COOH IbuprofenNaproxen Ketoprofen Flurbiprofen Suprofen COOH R 酶催化水解拆分芳基丙酸酯反應示意圖酶催化水解拆分芳基丙酸酯反應示意圖 CH3 ArCO2R CH3 ArCO2H CH3 ArCO2

15、R+ 脂肪(酯)酶 或催化抗體 研究發現來源于根霉（Rhizopus）、毛霉（Mucor）和假 絲酵母（Candida）屬的胞外脂肪酶均對不同的萘普生酯具有 很高的立體選擇性，且穩定性和底物耐受性很高（1mol/L）。 酶催化水解拆分芳基丙腈（酰胺）反應示意圖酶催化水解拆分芳基丙腈（酰胺）反應示意圖 CN CH3 Ar CH3 ArCOOH CN CH3 Ar CH3 ArCONH2 H2O H2O NH3 H2ONH3 + 腈水解酶 腈水合酶 酰胺酶 其路線主要有兩條：一是用微生物腈水解酶(Nitrilase)直接 立體選擇性水解拆分2-芳基丙腈為光學純的2-芳基丙酸；二是 腈水合酶(Nit

16、rile Hydratase)和酰胺酶(Amidase)相結合立體選擇 性水解拆分2-芳基丙腈為光學純的2-芳基丙酸。 酶催化酯化 CH3 ArCOOH CH3 ArCOOR CH3 ArCOOH + ROH + 酶催化酯化反應拆分酶催化酯化反應拆分2-芳基丙酸反應示意圖芳基丙酸反應示意圖 來源于Candida rugosa、Rhizomucor miehei、Candida antarctica等的脂肪酶均可用于2-芳基丙酸酯化的拆分。如 Novo公司的Lipozyme 1000L(來源于Rhizomucor miehei)用于催 化(R,S)-布洛芬與辛醇的選擇性酯化反應，優先選擇(S)-

17、構型， 對映選擇率(E)100;不過對于酮基布洛芬，優先選擇(R)-構型， 而且E值僅有2.4。 酶催化氧化 C H 3 A rC H 2 C H 2 C H 3 C H 3 A rC O O H 微生物 酶催化氧化芳基烷烴制備酶催化氧化芳基烷烴制備(S)-2-芳基丙酸示意圖芳基丙酸示意圖 酶催化氧化芳基丙醛制備酶催化氧化芳基丙醛制備(S)-布洛芬布洛芬 CHO COOH微生物 非水相酶促酯化拆分萘普生的技術路線非水相酶促酯化拆分萘普生的技術路線 MeO COOH MeO COOR MeO COOH MeO COOH MeO COOR MeO COOH + 產品分離 消旋 非水介質 +ROH,

18、 Lipase 水解 S-萘普生 MeO COOH MeO COOR MeO COOR MeO COOH MeO COONa MeO COOR + + 酯化 lipase，水解 分 離 有機相 水相 消旋化 1 2 3 4 酶促選擇性水解萘普生酯的技術路線酶促選擇性水解萘普生酯的技術路線 COOH COORCOOH COOH COOR COOH + +ROH, Lipase 非水介質 產品分離水解 消旋 S-布洛芬 非水相酶促酯化拆分布洛芬的技術路線非水相酶促酯化拆分布洛芬的技術路線 COOH COOR COOR COOH COOR COOH + 酯化 lipase，水解 分 離 有機相 水相

19、 消旋化 1 2 3 4 + 酶促選擇性水解布洛芬酯的技術路線酶促選擇性水解布洛芬酯的技術路線 (S)-布洛芬的提取工藝布洛芬的提取工藝 水解反應液 鹽酸酸化 石油醚提取 水相有機相 丟棄 5% NaOH溶液反應 水相有機相 鹽酸酸化 石油醚提取 水相有機相 丟棄 S(+)-布洛芬 R(-)-布洛芬乙酯 布洛芬消旋乙酯 O COOH O COOH O COOR O COOR O COOH O COOH + +ROH, Lipase 產品分離水解 消旋 非水相酶促酯化拆分酮洛芬的技術路線非水相酶促酯化拆分酮洛芬的技術路線 乙醇 乙醇 Novozym 435 1,2-二氯丙烷 總產率：60% No

20、vozym 435 1,2-二氯丙烷 O COOH O COOEt O COOH O COOH O COOH O COOH O COOR (+)-1, (500 g) (-)-2, ee 55% (322 g)(+)-1, ee 77% (209 g)(+)-1, (209 g) (+)-1, ee 38% (418 g) (+)-1, ee 96% (209 g) (-)-2, ee 20% (232 g) 大規模的制備（大規模的制備（S）-酮基布洛芬酮基布洛芬 O COOH O COOR O COOH O COOR O COONa O COOR + 酯化 lipase，水解 分離 有機相

21、水相 消旋化 1 2 3 4 + 酶促選擇性水解酮洛芬酯的技術路線酶促選擇性水解酮洛芬酯的技術路線 L-苯丙氨酸的酶法制備 苯丙氨酸純品為白色粉末，有苦味，微溶于醇，不溶 于苯，熔點283，比旋光D25=34.4（c=1，H2O）。 25時在水中溶解度是2.97g/100g。等電點為pH5.48。 NH2 COOH結構式： L-苯丙氨酸是人體必需的八種氨基酸之一，作為一種營 養增補劑，是配制氨基酸輸液和制劑及氨基酸營養食品的主 要成份，L-苯丙氨酸目前最大的用途是用于天苯二肽甜味劑 的合成，其中阿斯巴甜的世界銷量為4萬噸/年。阿斯巴甜以 安全、美味、低熱值、高甜度而成為優秀的無糖甜味劑。 苯丙

22、酮酸轉氨酶酶法 HOOCH2C COOH H2NH CH2 COOH H2NH C H2 C COOH O HOOCC H2 C COOH O aminotransferase L-Aspartic acidL-Phenylalanine + H3CC Oxaloacetic acid COOH Pyruvic acid O CO2 Phenylpyruvate + 肉桂酸酶法(苯丙氨酸解氨酶（PLA） ) + CH N CH2CHCOOHL N CHCOOHPLA 芐基海因酶法 橫關健三等以苯甲醛和海因為原料合成得到DL-芐基海因，在 L-海因酶和N氨甲酰水解酶的作用下酶法水解得到L-苯丙氨

23、 酸，該路線的關鍵是前體芐基海因的低成本制備和高活性L-海 因酶的篩選。 苯丙酮酸脫氫酶法 以苯丙酮酸為前體，通過還原性氨化作用合成L-苯丙氨 酸。1987年，Asano等人采用從自然界中分離到的尿素芽孢 八疊球菌（Sporosurcina ureae）SCRC-R04所生產的高活性 苯丙氨酸脫氫酶，與用于輔酶NADH再生的甲酸脫氫酶組 成共軛反應體系，L-苯丙氨酸產率達到116g/L，轉化率可以 達到89%。工藝路線示意如下： CH2 C O COOH NADH NH4CH2 CH COOHNAHOH2 NH2 藥用氨基酸： L-色氨酸、 L-蛋氨酸等 1969年日本千鈾一 郎首先在工業上應

24、用固 定化氨基酰化酶拆分 DL-氨基酸獲得成功。 被稱為酶工程的開始。 有些氨基酸發酵法很難， 酶工程方法是目前推崇 的方法 天冬氨酸轉氨酶催化轉氨反應生產L-苯丙氨酸 以苯丙酮酸和L- 天門冬氨酸為原 料，用天冬氨酸 轉氨酶催化轉氨 反應，生成 L-苯 丙氨酸和草酰乙 酸，草酰乙酸脫 羧生成丙酮酸和 二氧化碳。反應 式右圖。 L-天冬氨酸天冬氨酸 E.coli SW0209-31 酶法制備D-氨基酸 （1）多肽抗生素 LLDLDLDLD L D LDL HC O N H ValGlyAlaLeu AlaValValVal TrpLeu LeuTrpTrpLeuTrpNOH 短桿菌肽 A Cy

25、sD-Phe SS CysPheD-TrpLysThrThr 生長抑制素八肽類似物(oxtreotide)，用于治療VIP瘤、類 癌綜合癥及胃泌素瘤等 CysPhe SS CysD-TrpLysThrThr H(D)OL ( 醇) 醋酸奧曲肽(sandostatin acetate，商品名：善得定),用于治 療肢端肥大癥、胰瘺、腫瘤激素性腹瀉的肽激素分泌失調、非腫瘤性腹 瀉，治療胃切除后發生的腹瀉綜合癥。 半合成抗生素 以D-HPG或D-PG為側鏈的半合成抗生素，因其肽鍵 很難被-內酰胺酶作用從而具有較高的穩定性，而且具 有抗菌譜廣、毒性小、過敏性低、吸收快、血濃度高、 藥力持續時間長、口服效

26、果好等遠優于青霉素G的藥理 性能。 肽類甜味劑具有很高的商業價值。目前市售的天苯 二肽（商品名阿斯巴甜，aspartame）是一種優良的甜味 劑，其甜度為蔗糖的200倍，適用于肥胖癥、糖尿病和 心血管病人食用。但它不適合苯丙酮酸尿患者，并且對 酸堿和溫度穩定性差，限制了其在食品領域的廣泛應用。 由D-Ala與L-Asp反應合成得到的天丙二肽（商品名阿力 甜，alitame），其甜度為蔗糖的2,000倍，且對熱和酸堿 穩定，可廣泛適用于食品工業、日用化學工業作甜味劑， 具有極好的市場前景。1983年由Brennan T.M.獲得的阿 力甜的美國專利，目前已在澳大利亞、新西蘭等國獲準 應用、上市。

27、 酰化酶法 NH2H R COOH HNH2 R COOH (CH3C)2O O CH3C O N H H R COOH HN H CCH3 O R COOH NH2H R COOH HN H CCH3 O R COOH HNH2 R COOH L-AA D-AA 酰化酶 D或L-AA 消 旋化氨 基酸乙酰化產 物 容易分離的混 合 物 水解 L或D-AA L或D的乙酰化AA 酰化酶拆分消旋化氨基酸的過程 Tripathi等研究了從Alcaligenes denitrificans和Alcaligenes faecalis中誘導產生D-氨基酸酰化酶，利用培養產生的完整細 胞可將各種N-乙酰-D

28、-氨基酸轉化為D-Met、D-Val、D-Phe和 D-Leu。 羧肽酶法 RCHO HCN NH3 RCHCN NH2 RCHCONH2 NH2 R H NH2 COOH C H NH2 R C CONH2 D H N R C CONH2 phCH D H3O H NH2 R C COOH D MeOH H R H NH2 C COO Me NH3 L + phCHO pH=8-11 + + L 1. 2. Racem isation 目前，應用此法獲得D-氨基酸的最成功實例是荷蘭DSM 公司采用惡臭假單胞菌L-羧肽酶拆分DL-羧基酰化氨基酸， 以生產半合成青霉素和頭孢菌素類抗生素的重要側鏈

29、D-PG和 D-pHPG。 海因酶法制備D氨基酸的工藝路線 C H C O NH2 R H2N C O COOH H R H N H CONH2 COOH NH2 R H H D-HEn N-CAEn or NaNO 2 , HCl D-5-SuH N-CAA D-AA L-5-SuH 許多5-取代海因在反應條件下可以自發消旋，也可用 消旋酶加速消旋，利用此過程可以進一步將海因消旋而使 其100%地轉化為光學純的產品。 N H NH R H O O N H NH O O R H NHNH2 OH O O H R NH3 + CO2 NH2 OH O RH H O 2 H O 2 H O 2 L

30、-海因D-海因 海 因 消 旋 酶 或化學 消 旋 N-CAEn D-氨 基 酸N-CAA 一菌雙酶轉化工藝 H2 C CC HN O NH C O CH 2 C C HN O NH 2 C O OH H H2 C CC HN O NH C O H H (L) (D) Hydantoinase CH 2 C C NH 2 O OH H 一酶一樹脂法制備工藝 一酶一樹脂法是一酶一酸法的改進方法，通過采用強 酸性樹脂代替強酸，可減少反應中大量產生鹽，從而減輕 D-苯丙氨酸的分離純化難度。 化學 酶法制 備D-氨 基酸的 反應歷 程圖 具有特定功能基團的手性醇是用于合成手性 藥物和其他手性化學品重要的中間體。3-氯-1-苯 丙醇是一種重要的手性藥物中間體。光學純的3- 氯-1-苯丙醇可用于制備S-(+)-氟西汀，R-(-)-托莫 西汀，()-尼索西汀。S-(+)-氟西汀是R-(+)-氟西 汀藥效的3倍；R-(-