1、第第四四章章 細胞質、核糖體與細胞質、核糖體與RNARNA 第一節第一節 細胞質細胞質 第二節第二節 核糖體核糖體 第三節第三節 非編碼非編碼RNARNA 第一節第一節 細胞質細胞質 細胞質(cytoplasm)又稱胞漿,是細胞質膜包圍的 除核區外的一切半透明、膠狀、顆粒狀物質的總稱， 由細胞質基質、細胞器、細胞骨架和包涵物組成。 細胞質基質中主要含有與細胞內各種中間代謝反 應相關的數以千計的酶類和與維持細胞形態和細胞內 物質運輸有關的細胞質骨架結構。 細胞質骨架是細胞質基質結構體系的組織者，為 細胞質基質中的各種成分和細胞器提供錨定位點，保 證細胞內各種復雜代謝反應高效而有序的進行。 p 細

2、胞質的組成 細胞質基質和胞質溶膠 化學組成：小分子：水、無機離子；中等分子： 脂類、糖類、氨基酸、核苷酸及其衍生物；大分 子：多糖、蛋白質、脂蛋白、RNA “酶溶液”vs 區域性分布 細胞質基質與蛋白質的壽命控制 細胞質基質 微管、微絲和中間絲組成的高度動態結構體系 不同細胞間差異很大 細胞特定形狀的維持 細胞內部布局 細胞運動 細胞質骨架 母牛內皮細胞的肌動蛋白纖維(微絲) 母牛內皮細胞的微管 沒有代謝活性，有特定形態的結構 貯存能源物質、分泌顆粒 糖原顆粒 脂滴 分泌顆粒 包涵物 胰腺外分泌腺細胞內 大量胰酶原分泌顆粒 肝細胞內大量糖原顆粒 分泌類固醇激素 的細胞內脂滴 葉綠體和線粒體中含

3、有的DNA 胞質遺傳因子與核基因的獨立性 多種表現形式，以母系遺傳為主 p 細胞質遺傳 基質基質基質類囊體基質類囊體基粒類囊體基粒類囊體 電鏡下的葉綠體超微結構 電鏡下的線粒體超微結構 核糖體是細胞質中最重要的細胞器之一。 在細胞將DNA的基因信息翻譯為蛋白質的過程 中，核糖體在mRNA的指導下合成相應的蛋白 質。在翻譯過程中，核糖體需要解讀mRNA的 密碼子，招集相應的氨酰tRNA，并催化肽鏈 的生成。 第二節第二節 核糖體核糖體 p核糖體的基本類型 u 按存在的生物類型 真核生物核糖體 原核生物核糖體 沉降系數 (sedimentation coefficient, s) u 按存在部位

4、細胞質核糖體 線粒體核糖體 （55S，由35S 和25S大、小 亞基組成） p 核糖體的基本類型 基本特點原核生物核糖體真核生物核糖體 沉降系數70S80S 相對分子量(kDa）2.5103 3.94.5103 亞基組成50S30S60S40S 豐度(每個細胞)15102-18103個106-107 個 其他 游離核糖體（free ribosome） 和附著核糖體（內質網） p 原核/真核細胞核糖體的特點比較 p 核糖體的成分 核糖體無膜結構，主要由核糖體蛋白(ribosomal protein, r蛋白質)和核糖體RNA(ribosomal RNA, rRNA)構成。 成分組成原核生物真核生

5、物 基本組成比列rRNA約占2/3 r蛋白質約為1/3 rRNA約占3 /5 r蛋白質約為2/5 大亞基組分31種蛋白質 2種rRNA （23S和5S) 49種蛋白質 3種rRNA （28S、5.8S、5S） 小亞基組分21種蛋白質 1種rRNA（16S） 33種蛋白質 1種rRNA（18S） p 核糖體的成分 rRNA占細胞總RNA的絕大部分 去除rRNA的核糖體不能維持正常形態 rRNA含有不同比例的A、U、G、CrRNA為單 鏈RNA，但有雙鏈區 p 核糖體的結構 核糖體大小亞基的結構示意圖 大小亞基的結構 大亞基(11.52323nm)： 略對稱的皇冠狀，中間為 “鼻”，兩側為“脊”和

6、“柄” 小亞基(5.52222nm): 長條形的扁平不對稱顆粒， 由頭和體兩部分組成。 大小亞基結合在一起形成核糖體， 凹陷部位彼此對應形成一個隧道， 供蛋白質翻譯時mRNA穿行 p 核糖體的結構 16S rRNA的結構 16S rRNA的一級和二 級結構均十分保守，具 有臂環結構(stem-loop structure)。 16S rRNA的空間結構在 電鏡下呈V字形 16S rRNA的二級 結構（上） 空間結構（右） p 核糖體的生物發生 rRNA的轉錄與加工 rRNA基因在基因組中具有多個拷貝，E.coli中有7套拷貝，真 核生物中有數百到數千個拷貝，其中5S rRNA有50000個拷貝

7、 真核生物的染色體中28S，18S和5.8S rRNA基因是串聯分布的， 基因間有間隔區分開; 5S rRNA基因為獨立存在 原核生物中5S rRNA基因與其他兩種rRNA基因位于同一染色體 上 在生命活躍的細胞中，rRNA的拷貝數或細胞核的數量增加，以 適應蛋白質大量合成的需要。 p 核糖體的生物發生 核糖體的自我裝配： 核糖體由各種RNA和蛋白零件組成完整的核糖 體不需要其它任何因子參與，屬于自我裝配 真核生物和原核生物的核糖體裝配方式不同 p 核糖體的生物發生 真核生物的核糖體裝配流程： p 核糖體的生物發生 鎂離子對核糖體存在形式的影響： 細胞質中，核糖體的存在形式受到鎂離子濃度的影響

8、 Mg2+1mM，核糖體以大、小亞基分離的形式存在 1mMMg2+10mM，核糖體形成100S大小的二聚體 p 核糖體的生物發生 原核生物的核糖體裝配流程(E.coli) 小亞基的裝配： 1.大約2/3的蛋白質在較低溫度條 件下先與16SrRNA結合，形成一個 21S的中間顆粒 2.當溫度上升到37后，核糖體 中間物發生構象改變，不增加蛋 白質但沉降系數改變為26S 3.由于構象變化，產生一些新結 合位點。其余的蛋白質(占1/3)再 次在較低溫度條件下與26S顆粒結 合，形成完整的有功能的30S顆粒 p 核糖體的生物發生 原核生物的核糖體裝配流程(E.coli) 大亞基的裝配： 大亞基的裝配過

9、程需要孵育條件(44、4mmol/L Mg2+) 和四步裝配過程： 1.由兩種rRNA (23S、5S)和大約20種蛋白質組成33S顆粒 2.當溫度上升到44時，沉降系數從33S增至41S 3.41S與另一些蛋白質結合，轉變為48S 4.溫度上升到50，48S轉變為有活性的50S大亞基 p 核糖體的作用與蛋白質的生物合成 作為蛋白質的裝配機，核糖體的許多結構 都對蛋白質的合成過程有著重要意義 核糖體的功能活性位點 p 核糖體的作用與蛋白質的生物合成 A位點（A site）：氨基酸位點。主要分布在大亞基上，是 與新摻入的氨酰基-tRNA結合的部位，可接受氨酰基-tRNA p 核糖體的作用與蛋白質

10、的生物合成 P位點（P site）：肽酰基位點。主要分布在大亞基上，是 與延伸中的肽酰tRNA結合的部位，即釋放tRNA的部位。 p 核糖體的作用與蛋白質的生物合成 E位點(exit site)：是脫氨酰tRNA離開A位點到完全從核糖體釋放 出來的一個中間停靠點，只是暫時的停留點。E位點被占據時，A 位點與氨酰基tRNA的親和力降低，可防止與另一個氨酰tRNA的結 合。直到核糖體準備就緒，E位點空出，才會接受下一個氨酰tRNA。 p 核糖體的作用與蛋白質的生物合成 mRNA結合位點：原核生物的核糖體中，與mRNA結合位點位于16S rRNA 的3端。mRNA與核糖體結合的序列稱為SD序列，是m

11、RNA中5端富含嘌 呤的短核苷酸序列，一般位于mRNA的起始密碼AUG的上游5-10bp處，并 且同16S rRNA3端的序列互補。真核生物沒有SD序列，mRNA同核糖體 小亞基的結合主要依賴于mRNA5端甲基化帽子結構的識別。 核糖體的蛋白合成功能主要是依靠rRNA來完成的，突變的rRNA能夠對 蛋白合成抑制劑產生抗性。 n 具有肽酰轉移酶的活性 n 為tRNA提供結合位點 n 為多種蛋白質合成因子提供結合位點 n 在蛋白質合成起始時參與同mRNA選擇性地結合以及在肽鏈的延伸 中與mRNA結合 n 核糖體大小亞單位的結合、校正閱讀(proof reading)、無意義鏈 或框架漂移的校正、以

12、及與抗菌素作用 r蛋白質的作用很可能是對核糖體功能的“微調”及對核糖體的合成、 穩定起到輔助作用，r蛋白質的缺失并不能完全阻止蛋白質的合成。 p 核糖體的作用與蛋白質的生物合成 核糖體中rRNA及r蛋白質的作用 p 核糖體的作用與蛋白質的生物合成 蛋白質的生物合成 蛋白質合成不僅要有合成的場所,而且還必須有mRNA、tRNA、 20種氨基酸按照密碼精確地摻入多肽鏈中，蛋白質因子、酶、Mg、 K離子等參與由ATP、GTP提供能量等。每一個核糖體一秒鐘可翻 譯40個密碼子而形成40個氨基酸肽鍵，其合成肽鏈效率極高。 蛋白質合成分為3大步驟： 氨基酸的活化及其與專一轉移核糖核酸(tRNA)的連接 肽

13、鏈的合成（包括起始、延伸和終止） 新生肽鏈加工成為成熟的蛋白質 p 核糖體的作用與蛋白質的生物合成 此步驟在胞質中進行 氨基酸本身不識別密碼，不直接反應生成肽鏈，不直接到達 核糖體上，需借助轉運RNA（tRNA） 特異性的氨酞tRNA合成酶催化氨基酸的羧基與其對應的tRNA 的3端羥基反應，生成含高能酯鍵的氨酰tRNA 氨基酸+ATPtRNA 氨酰tRNAAMPPPi 反應都是在氨酰tRNA合成酶催化下進行的，具有高度專一性。 每一種氨基酸均有專一的氨基酰-tRNA（aminoacyl-tRNA） 氨基酸的活化及其與專一tRNA的連接 肽鏈的合成 分3個步驟：起始、延伸、終止 蛋白質合成方向從

14、氨基端（N端）向羧基端（C端）進行 mRNA的翻譯方向是從5端到3端 p 核糖體的作用與蛋白質的生物合成 p 核糖體的作用與蛋白質的生物合成 肽鏈的合成-起始 1. 小亞基與mRNA起始密碼子的結合 2. 第一個氨酰-tRNA進入核糖體 3. 完整起始復合物的裝配（assembling） 肽鏈的合成-起始 原核生物的蛋白質合成的起始(引自Gerald Karp,Cell and Molecular Biology,2004) p 核糖體的作用與蛋白質的生物合成 p 核糖體的作用與蛋白質的生物合成 肽鏈的合成-延伸 1. 氨酰-tRNA進入A位點 2. 肽鍵（peptide bond）的形成 3

15、. 轉位（translocation） 4. 去氨酰tRNA的釋放 肽鏈的合成-延伸 原核生物的蛋白質合成的延伸(引自Gerald Karp,Cell and Molecular Biology,2004) p 核糖體的作用與蛋白質的生物合成 64個密碼子中有3個終止密碼子，不編碼氨基酸而終止多肽的裝 配。當核糖體到達UAA、UAG和UGA任何一個密碼子，由于沒有與之相 匹配的反密碼子，終止蛋白質的延伸，導致多肽鏈從tRNA中脫離出來 p 核糖體的作用與蛋白質的生物合成 肽鏈的合成-終止 肽鏈的加工 除去N端的甲酰甲硫氨酸（原核）或甲硫氨酸（真核） 切除沒有功能卻存在于前體中的肽段 氧化二個半

16、胱氨酸的巰基生成二硫鍵 氨基酸殘基的修飾，如：磷酰化、糖基化、甲基化、乙 酰化和羥基化 結構蛋白需經過修飾、剪接后形成四級結構而發揮功能 p 核糖體的作用與蛋白質的生物合成 嘌呤霉素對蛋白質合成抑制 p 核糖體的作用與蛋白質的生物合成 p 多聚核糖體 核糖體在細胞內并不是單個獨立地執行功能，而是由多個甚至 幾十個核糖體串連在一條mRNA分子上高效地進行肽鏈的合成， 這種具有特殊功能與形態結構的核糖體與mRNA的聚合體稱為多 聚核糖體（polyribosomes或polysome）。 多聚核糖體的生物學意義 n 細胞內各種多肽的合成，不論其分子量的大小或是mRNA的 長短如何，單位時間內所合成的

17、多肽分子數目都大體相等。 n 以多聚核糖體的形式進行多肽合成，對mRNA的利用及對其 濃度的調控更為經濟和有效。 p 多聚核糖體 電鏡下的多聚核糖體 p 多聚核糖體 第三節 非編碼RNA 一、核酶 二、小RNA 三、lncRNA Proportion of functional elements within genomes 17% 0.5% Drosophila 85% 2% 13% E. coli 70% 2% 28% Yeast S. cerevisiae 1.5% 0.5% 98% Human 28% 0.5% 71% Nematode C. elegans 0.5% 0.01% Lu

18、nfish (dipnoi) Coding (protein) RNA Non-coding 82% 99.5% 基因組和轉錄 Genome and transcription (tiling array data) 編碼蛋白序列 Protein coding sequence 人 (Human) 基因組的 2-3 % 線蟲(c.elegans) 基因組的 25 % 基因組的轉錄水平 Transcriptional activity 人基因組的 90 % (40-50X) 線蟲 基因組的 70 % (2-3X) 絕大部分的轉錄產物是 非編碼RNA 物種間最主要的差別也是 非編碼RNA 基因組的

19、轉錄情況 Transcriptional output/complexity 名稱名稱定義定義功能功能大小大小( (ntnt) ) mRNAsMessenger RNA編碼蛋白質的信使RNA變化大 rRNAsRibosomal RNA核糖體RNA，催化蛋白質合成 人：120,160, 1868,5024 tRNAsTransfer RNA 運輸RNA,蛋白質合成中作為mRNA和氨 基酸之間的橋梁 70-90 snRNAsSmall nuclear RNA 小的細胞核RNA，在細胞核加工中起 作用，如pre-mRNA的加工 100-300 snoRNAs Small nucleolar RNA

20、小核仁RNA，對rRNA進行加工和修飾60-300 scaRNAs Small Cajal body- associated RNA 在cajal小體中發現，用于修飾snRNA 200-300 miRNAsMicroRNAs小RNA，用于降解mRNA和阻斷翻譯 21-22 siRNAsSmall interfere RNAs 小干擾RNA，直接降解mRNA和建立壓 縮的染色質結構 20-25 piRNAsPiwi-interacting RNA 生殖細胞中的小RNA，維持轉座子沉默, 抵抗轉座子，在配子發生中起作用 23-30 lncRNAsLong noncoding RNA 長鏈非編碼RN

21、A,用多種功能，如調控 基因的轉錄等 200以上 細胞中主要的RNA種類 具有催化功能的RNA稱為酶性RNA，又稱核酶(ribozyme， Rz)；具有催化功能的DNA稱為酶性DNA，又稱脫氧核酶 (deoxyribozyme，DRz)，兩者統稱核酶(nucleozyme)。 與蛋白質酶相比，核酶的催化效率較低，是一種較為原 始的催化酶。 核酶的發現突破了酶是蛋白質的經典觀念，是人類對酶 化學本質認識的飛躍，補充和發展了“中心法則”。 一、一、 核核 酶酶 發現 n1980s nThomas Cech等發現 n研究四膜蟲的26SrRNA前體加工 n發現:26S rRNA前體可進行自剪切(sel

22、f- splicing) 證明 n26SrRNA基因克隆 n無細胞系統中轉錄 n研究26SrRNA的前體分子剪切 p 核酶的發現 p 核酶的類型 Rz廣泛存在于由低等到高等的多種生物中，參與細 胞內RNA及其前體的加工和成熟過程。目前自然界發 現的核酶按分子大小分類，可分為大分子核酶和小 分子核酶兩類。 DRz是利用體外分子生化技術獲得的一種具有高效催 化活性和結構識別能力的單鏈DNA片段。迄今已發現 的DRz有幾十種，但有類似催化活性的DRz在自然界 中還沒找到。 p 核酶的類型 大分子Rz的類型： 核糖核酸酶P(RnaseP）催化切割tRNA、rRNA I類內含子 II類內含子 小分子Rz

23、的類型： 錘頭型 發夾型 HDV（丁型肝炎病毒）核酶 VS核酶 p 核酶的類型 具有RNA切割活性 具有DNA連接酶活性 具有卟啉金屬化酶和過氧化酶活性 具有DNA水解活性 具有DNA激酶活性 具有N2糖基化酶活性 具有DNA戴帽活性 DRz的類型 p 核酶的類型 Rz與DRz的比較： 特性DRzRz 化學組分 DNARNA 催化特性 高度專一性和高效性，與底物嚴格按照堿基 配對原則結合。DRz-mRNA雜交分子較Rz- mRNA雜交分子易解離；催化效率遠遠高于Rz 高度專一性和高效性， 與底物嚴格按照堿基 配對原則結合 成構及活 性中心特 點 缺少2-羥基，分子量較小，受靶序列二級結 構的影

24、響較弱，活性中心結構有更大的選擇 性，對底物的趨近性比Rz好，一般DRz較Rz 有更多的剪切靶位可供選擇 每個核苷酸都具有一 個2-羥基，結構相對 復雜 p 核酶的類型 Rz與DRz的比較： 特性DRzRz 底物DNA或RNARNA 穩定性 在生理pH、溫度和離子強度等條 件下，穩定性約為RNA的105 倍； 在細胞培養和體內環境中，對核 酸的降解作用比Rz高得多 與DRz相比穩定性差 p 核酶的作用機制 各種核酶的RNA分子中內含子（Intron）切除機制的 不同，可分為剪切型和剪接型兩大類型 剪接型：相當于內切酶和連接酶兩種酶的聯合作用， 催化自身RNA進行剪切和連接 剪切型：相當于內切核

25、酸酶的作用，可催化RNA分子 切除一段核苷酸序列 核酶的剪切作用和剪接作用都不需要其它酶（蛋白質） 參與，稱為自我剪切(self-cleavage)和自我剪接 （Self-Splicing）作用。 p 核酶的作用機制 剪接型核酶的作用機制第一類自我剪接 包括I型內含子和II型內含子 需要外源性親和物質：外源鳥苷或其它親和物質 催化反應需Mg2+參與 剪接型核酶的作用機制第二類自我剪接 不需要外源性親和物質，利用自身內部的腺苷作為親 和物質 催化反應需Mg2+參與 剪下的內含子生成一個套索(lariut)形式的中間產物 p 核酶的作用機制 剪切型核酶的作用機制 剪切型核酶是將自身RNA或異體RN

26、A切除一段特異的 核苷酸序列 剪切型核酶的作用特點是只剪不接 剪切型核酶都是通過同樣可逆的磷酸二酯斷裂反應 來破壞RNA鏈 目前，關于磷酸二酯的斷裂機制尚有爭議。 p 核酶的作用機制 p 核酶的作用機制 錘頭型核酶 錘頭型核酶(hammerhead ribozyme) 是植物病毒中的一種核酶 催化時形成一種特殊的二級結構，類似錘頭 有一個雙鏈螺旋的柄結構(柄II) 核酶同靶RNA配對形成柄和柄 切點在靶RNA的柄、柄配對區之間 p 核酶的作用機制 p 核酶在演化中的地位 因發現RNA具有催化和自 復制(不同于病毒RNA的自復 制)功能而提出的一種假說， 認為生物進化過程中，最早 出現的生物大分

27、子是RNA，而 不是DNA和蛋白質，即在進化 某個階段有一個“RNA世界”。 RNA世界假說 p 核酶的應用研究進展 用于生命起源的研究 用于植物病毒防治的研究 用于人類疾病防治的研究 二、小二、小 RNARNA 小RNA（microRNA 或 small RNA）是一種 長度介于20-24個核苷酸的單鏈RNA，作為一種負 調控因子，miRNA作用于它們的靶標mRNA，能夠 在轉錄或翻譯水平上對基因的表達起到調控作用。 不同物種中大量的小RNA被報道 p 小RNA的分類 siRNA 由DICER(植物中為DCL4)識別并且切割的任何來源 （內源或者外源）的雙鏈RNA分子而形成 miRNA 由I

28、I型聚合酶轉錄，經過DICER(植物中為DCL1)切 割,成為成熟的功能小分子RNA p 小RNA的發生 siRNA 源于外源病毒入侵或內 源RNA產生的小分子雙 鏈RNA 長度一般為21nt-25nt siRNA能夠在細胞之間 短暫轉移 植物病毒入侵誘導初生siRNA p 小RNA的發生 miRNA 從自身基因組中轉錄并加 工而成 pri-miRNA - pre-miRNA - miRNA 一個miRNA可調節具有共同 功能域的幾個不同基因 p 小RNA的作用機制 RNA誘導沉默復合體 （RISC） RISC一種由多個蛋白質分 子與siRNA組合而成的復 合物，可切斷雙鏈RNA， 或是與短小

29、的反義RNA結 合。當RISC與互補鏈結合 之后，會活化RNase，并 將RNA切斷。 miRNA與siRNA參與調控基因沉默過程的異同 p 小RNA的作用機制 p 小RNA的作用機制 除通過RISC對基因進行轉錄后調控外，siRNA還可以通過DNA 甲基化、組蛋白甲基化等方式對基因的轉錄起到調控作用 RdDM: RNA dependent DNA methylation，only observed in plants p 小RNA的生物學意義 參與發育 參與病毒防御 參與環境脅迫響應 miRNAmiRNASiRNASiRNApiRNApiRNA 來源來源內源產生內源產生內源或外源合成導入內源

30、或外源合成導入內源產生內源產生 轉錄酶轉錄酶RNARNA聚合酶聚合酶IIIIRNARNA聚合酶聚合酶IIIIRNARNA聚合酶聚合酶IIII 形成形成單鏈單鏈RNARNA形成形成雙鏈雙鏈RNARNA單鏈單鏈RNARNA形成形成 加工加工加工過程：剪切一個側臂，加工過程：剪切一個側臂， 其他部分降解，加工成熟依賴其他部分降解，加工成熟依賴 DicerDicer 對稱地來源于雙鏈對稱地來源于雙鏈RNA RNA 前前 體的兩側臂，加工成熟依賴體的兩側臂，加工成熟依賴 DicerDicer 大的大的RNARNA前體，被加工成大量前體，被加工成大量 的的piRNApiRNA 作用的作用的mRNAmRNA

31、部位部位作用于靶標基因作用于靶標基因3 3-UTR-UTR 區區 作用于作用于mRNAmRNA任何部位任何部位作用于轉座子作用于轉座子RNARNA任何部位任何部位 位點數位點數一個基因上可有多個作用一個基因上可有多個作用 位點位點 一個作用位點一個作用位點一個基因上可有多個作用位點一個基因上可有多個作用位點 結合蛋白結合蛋白需要需要ArgonauteArgonaute家族蛋白家族蛋白 形成形成RICSRICS復合物復合物 與與Arg2Arg2等蛋白形成等蛋白形成RICSRICS復復 合物合物 與與PiwiPiwi、ago3ago3、AubergineAubergine等等 蛋白形成復合物蛋白形

32、成復合物 效果效果抑制翻譯或者導致抑制翻譯或者導致mRNAmRNA降降 解解 靶標靶標mRNAmRNA降解降解轉錄轉錄水平（水平（PiwiPiwi）和轉錄后切）和轉錄后切 割割(ago3(ago3、AubAub) )抑制轉座子活性抑制轉座子活性 存在的細胞存在的細胞廣泛存在廣泛存在廣泛存在廣泛存在僅在部分動物生殖細胞中發現僅在部分動物生殖細胞中發現 功能功能主要參與發育過程，調節主要參與發育過程，調節 表達表達 RNAiRNAi產物，抑制轉座子活產物，抑制轉座子活 性和病毒感染性和病毒感染 只作用于轉座子只作用于轉座子mRNAmRNA miRNA、 siRNA和piRNA的異同 p 小RNA的

33、應用 RNAi RNA干擾（RNA interference，縮寫為RNAi）是指一種分子 生物學上由雙鏈RNA誘發的基因沉默現象，其機制是通過阻 礙特定基因的翻譯或轉錄來抑制基因表達。當細胞中導入與 內源性mRNA編碼區同源的雙鏈RNA時，該mRNA發生降解而導 致基因表達沉默，siRNA和miRNA介導的基因沉默現象均可稱 為RNAi。 RNAi現象可以廣泛地應用于研究或治療領域 p 小RNA的應用 用于疾病治療 RNAi主要通過在轉錄后水平阻斷基因的表達，導致蛋白無法 合成，出現“基因沉默”。理論上說，我們可以關閉非必需 或致病基因的功能，以達到治療疾病的作用。 動物實驗已證明，可以通過

34、RNAi的方法使導致血膽固醇升高 的基因“沉默”；病毒性疾病（HIV，肝炎等），心血管代 謝性疾病等方面的臨床試驗也正在進行中；這一方法為病毒 性肝炎、艾滋病和腫瘤等人類頑疾的治療指了一條新路 。 p 小RNA的應用 用于科學研究 在科學研究中，很多時候需要用到基因敲除技術來對某一基 因的功能進行研究。傳統的在基因組水平上剔除基因費時費 力，實驗周期長。利用RNAi技術，可以方便地通過siRNA或 siRNA表達載體對目標基因基因進行沉默，已成為研究基因 功能的重要手段。 p 小RNA的應用 用于動植物品種改良 通過RNAi的方法，利用基 因工程的手段對動植物的 遺傳特性進行改變，以獲 得新的

35、品種 p 小RNA的應用 用于病毒防御 Hu WY等證明了siRNA能阻抑逆轉錄Rous 肉瘤病毒（RSV） 感染脊椎動物； Leonid等發現針對脊髓灰質炎病毒中編碼衣殼蛋白或編 碼病毒聚合酶的mRNA的siRNA可以抑制病毒復制，加速清除 受染細胞中的脊髓灰質炎病毒； Jia等發現Rta-siRNA( Rta是皰疹病毒基因表達的一種起 始轉錄因子)和ORF45-siRNA能特異阻止皰疹病毒復制。 三、長鏈非編碼 RNA 長鏈非編碼RNA(1ong non coding RNA, lncRNA)： 不編碼蛋白且轉錄本超過200個核苷酸的RNA分子， lncRNAs和mRNA類似，主要由RNA

36、聚合酶II (RNA PII) 轉 錄，有可變剪接，有些具有poly(A)尾巴，有些沒有 poly(A)尾巴。 Figure 1. Paradigms for how long ncRNAs function. Recent studies have identified a variety of regulatory paradigms for how long ncRNAs function, many of which are highlighted here. Transcription from an upstream noncoding promoter (orange) can

37、negatively (1) or positively (2) affect expression of the downstream gene (blue) by inhibiting RNA polymerase II recruitment or inducing chromatin remodeling, respectively. (3) An antisense transcript (purple) is able to hybridize to the overlapping sense transcript (blue) and block recognition of t

38、he splice sites by the spliceosome, thus resulting in an alternatively spliced transcript. (4) Alternatively, hybridization of the sense and antisense transcripts can allow Dicer to generate endogenous siRNAs. By binding to specific protein partners, a noncoding transcript (green) can modulate the a

39、ctivity of the protein (5), serve as a structural component that allows a larger RNAproteincomplex to form (6), or alter where the protein localizes in the cell (7). (8) Long ncRNAs (pink) can be processed to yield small RNAs, such as miRNAs, piRNAs, and other less well-characterized classes of smal

40、l transcripts. Long noncoding RNAs: functional surprises from the RNA world Genes Dev. 2009 23: 1494-1504 Access the most recent version at doi:10.1101/gad.1800909 lncRNAslncRNAs轉錄干擾的調控機制轉錄干擾的調控機制: : （1）抑制RNA聚合酶（RNAPII）的活性 （2）作為共調節子干擾轉錄因子的活性 （3）通過核小體的重置來進行轉錄干擾 （4）通過招募染色質重塑復合物進行轉錄干擾 （5）通過促進啟動子DNA甲基化來

41、進行轉錄干擾 （6）在沉默啟動子上維持染色質阻抑結構實現轉錄干擾 lncRNAslncRNAs轉錄激活的調控機制轉錄激活的調控機制: : （1）lncRNA創造了一個自由的染色質環境，最近報道ncRNA可以 直接從轉錄增強子上轉錄(稱為增強子或eRNA)，可能介導復合物與 核心轉錄起始位點的相互作用，鎖定穩定的轉錄起始過程。 （2）ncRNA 和位點激活，另一種lncRNA激活基因表達的方式是 阻止阻遏復合物的進入，如人的HOXA基因簇的活化表達與lncRNA 及 PCG/染色質相互作用失活有關。 lncRNAlncRNA的轉錄后調控和其它作用的轉錄后調控和其它作用 （1）參與可變剪接,即ln

42、cRNA可以與編碼蛋白基因的轉錄本形成互補雙鏈 干擾mRNA的剪切，進而產生不同的剪切形式； （2）lncRNA與編碼蛋白基因的轉錄本形成互補雙鏈，在Dicer酶作用下產 生內源性的siRNA，負調控基因的表達水平； （3）可作為小分子RNA（如miRNA）的前體分子，負調控基因表達； （4）lncRNA結合在特定蛋白質上調節相應蛋白的活性。 內源性競爭內源性競爭RNARNA（ceRNAceRNA） ceRNA（competing endogenous RNAs）假說揭示了一種RNA間相互作用 的新機制。ceRNA可以通過競爭性地結合miRNA來調節基因表達。ceRNA可 以通過應答元件（mi

43、croRNA response elements，MREs)與miRNA結合從而 影響miRNA導致的基因沉默，這揭示了一條RNA-miRNA調節通路的存在 A Large Intergenic Noncoding RNA Induced by p53 Mediates Global Gene Repression in the p53 Response Cell 142, 409419, August 6, 2010 在這篇文章，作者發現P53可以直接提高lncRNA-P21的表達，然后 lincRNA-P21與蛋白hnRNP-K結合，再調節其他基因的表達（如圖） A ceRNA Hypot

44、hesis: The Rosetta Stone of a Hidden RNA Language? Cell, Volume 146, Issue 3, 353-358, 28 July 2011 競爭性內源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA) Figure 1. The Basis of the ceRNA Language How mRNAs affect microRNAs is less well characterized than how microRNAs affect mRNAs. (A)The relationship between mRNAs and microRNAs could be reciprocal (Seitz, 2009), causing the level of one mRNA to influence the level and activity of another mRNA. (B) Thus, RNA molecules could communicate with each other through microRNA and microRNA response sequences (MREs). The greater the number