1、第一節(jié)證明遺傳物質是DNA（RNA）的三 個經典試驗 n細菌的轉化 n噬菌體感染實驗 n病毒重建實驗 1、細菌的轉化實驗 1928, 英國Griffith, Streptococcus penumoniae 菌株毒力莢膜菌落 野生型有產生光滑Smooth 突變型無不產生粗糙Rough Griffith認為,加熱殺死的S型菌中存在某種 能使活的R型菌轉變成S型菌的因子,并把 此因子稱為轉化因子. 這種一種生物由于接受了另一種生物 的遺傳物質而表現(xiàn)出后者的遺傳性狀, 或發(fā)生遺傳性狀改變的現(xiàn)象叫做轉化. 結論:轉化因子是DNA Avery等的轉化實驗 2、噬菌體感染實驗 1952，Hershey 在

2、真 核生物中核小體的形成引入負超螺旋,在細菌 和古細菌中是DNA回旋酶引起超螺旋. DNA的不同形式有： 環(huán)狀和線狀 通常細菌的染色體DNA，質粒DNA， 以及真核生物的線粒體DNA和葉綠體DNA 為環(huán)狀 二、二、DNA的復制特點的復制特點 和幾種主要的復制方式和幾種主要的復制方式 1. 基本概念基本概念 2. 復制起點與方向復制起點與方向 3. Semi-Conservation Replication 4. 復制的方式復制的方式 1. 基基 本本 概概 念念 ( Basic Concept ) Watson Replicon; Replisome; 每一個復制起點及其復制區(qū)稱為一個復制單位

3、每一個復制起點及其復制區(qū)稱為一個復制單位 The multi protein (30The multi protein (30) structure that assembles ) structure that assembles at replicating fork to undertake synthesis of DNA at replicating fork to undertake synthesis of DNA 復制機理的復雜性復制機理的復雜性 D.S. DNAS.S. DNA 能量的供求能量的供求 構型的變化構型的變化 超螺旋超螺旋線狀，開環(huán)狀線狀，開環(huán)狀 多種酶類的互作多

4、種酶類的互作Replisome DNA復制起始控制機理知之甚少復制起始控制機理知之甚少 復制的準確性復制的準確性 （修復，校正）（修復，校正） 研究試材的特殊性研究試材的特殊性 （溫度敏感型（溫度敏感型ts，突變抑制體系，突變抑制體系Su） DNA復制速度復制速度(E.coli 105 bp/min ，高速解旋，高速解旋 112 km/h ?) 缺乏統(tǒng)一的模式缺乏統(tǒng)一的模式 (D.S. DNA, S.S. DNA, Linear DNA.) 原核生物的復制起點（Origin of replication ， 簡稱ori）例如，E.coli 的oriC，長度為245bp 真核生物多個復制起點，例

5、如釀酒酵母，約有 400個復制起點（autonomously replicatory sequence，ARS），每個長度為100-200bp。 2. 復制起點與方向復制起點與方向 （replication origin & direction ） isolation of ori rich AT & palindromrich AT & palindrom Enzymes binding site Enzymes binding site 300 bp 300 bp in replication origin in replication origin 0f Prokaryote 0f Pr

6、okaryote AT rich 復制起點的特征復制起點的特征 AT rich 真核生物復制起點的研究是以酵母為基礎的 ARS (automatic Replication Sequence) 自主復制序列 ARS1 (A, B1,B2,B3) A區(qū)具有高度保守性 A/TTTTATG/ATTTA/T B區(qū)變化較大 “呼吸呼吸現(xiàn)象現(xiàn)象” DNA復制原點處氫鍵迅速斷裂與再生，復制原點處氫鍵迅速斷裂與再生， 導致兩條導致兩條DNA鏈不斷解鏈與聚合，鏈不斷解鏈與聚合， 形成瞬間的單泡狀結構的過程。形成瞬間的單泡狀結構的過程。 在富含在富含AT的區(qū)域內尤為明顯的區(qū)域內尤為明顯 子鏈子鏈DNA延伸方向延伸

7、方向 DNA polymerase reacts on the 3 end onlyDNA polymerase reacts on the 3 end only New DNA elongation from 5 to 3 direction New DNA elongation from 5 to 3 direction 進化中保留進化中保留 的深刻的、的深刻的、 選擇與適應選擇與適應 的、化學及的、化學及 功能的根源功能的根源 5 OH T C A T C A C 5 OH 3 ppp OH C + + ppi 如果如果DNA的延伸方向是的延伸方向是 3 5 A T C G + 5 pp

8、p OH 3 G ppp OH G A T C G 5 ppp OH 3 A T C G + 5 ppp OH 3 G ppp OH G 5 ppp 因能量的需要，因能量的需要， DNA的的5 端必須帶有端必須帶有PPP 游離游離dNTP具有具有ppp ppp OH 3 A T C G 在在0.2M Nacl 的生理環(huán)境中，磷酸基團間的強電負性，使的生理環(huán)境中，磷酸基團間的強電負性，使dNTP難以聚合到難以聚合到 DNA的的5端，而且端，而且 雙鏈雙鏈DNA的的5端堿基配對困難端堿基配對困難 需要其他機制以解脫需要其他機制以解脫 堿基發(fā)生錯配后的校正堿基發(fā)生錯配后的校正 費時、費能、增加脫磷酸

9、、加磷酸的能量消耗費時、費能、增加脫磷酸、加磷酸的能量消耗 A T C G ppp OH + ppp A p OH T C G pp p OH T C G T C G pp p OH 3. DNA的半保留復制的半保留復制 （Semi-Conservation Replication） Three replication hypotheses (CsCl gradient centrifuge) (CsCl gradient centrifuge) N15 N14 DNADNA Semi-Conservation Replication M. Meselson and F. W. Stahl,

10、Sciences 44:675, 1958. b) 半不連續(xù)復制半不連續(xù)復制 （semi-discontinuous replicationsemi-discontinuous replication） 后隨鏈后隨鏈 前導鏈前導鏈 5 3 3 5 3 5 5 3 4. DNA復制的方式復制的方式 (DNA replication model)(DNA replication model) 型復制型復制 1963年，Cairns根據(jù)E.coli 的環(huán)狀染色體復制的中間 產物自顯影實驗提出的。 形狀象 “ ” 滾環(huán)方式滾環(huán)方式 D.S. DNA Nick Elongation rolling 合成

11、互補鏈，形成雙鏈合成互補鏈，形成雙鏈 A蛋白識別起點，產生切口蛋白識別起點，產生切口 polIII催化延長 正鏈環(huán)化正鏈環(huán)化 形成雙鏈結構 產生A蛋白,識別 復制起點 置換式置換式 或或 D-Loop （Displacement formDisplacement form） D.S. DNA In mitochondrial DNA In mitochondrial DNA also in chloroplasm DNA also in chloroplasm DNA S.S. DNA as template New S.S. DNA Displacement D-Loop 重鏈復制 D-環(huán)延

12、伸 形成D-環(huán) 輕鏈開始復制 重鏈復制完成 輕鏈正在復制 輕鏈復制完成 封閉新合成鏈上的缺口 第三節(jié) 原核生物的染色體及其復制 n原核生物染色體 80%以上DNA RNA 蛋白質 環(huán)狀雙鏈DNA分子存在于細胞內相對集中的區(qū) 域，成為擬核。無核膜。 習慣上把原核生物的DNA分子也稱為染色體。 一、原核生物染色體的數(shù)目和大小 E.coli有1條環(huán)狀染色體，4.7Mb B.subtilis有1條環(huán)狀染色體，4.2Mb Agrobacterium tumefaciens有1條線性染色體， 2.1Mb；1條環(huán)狀染色體，3.0Mb。 二、細菌染色體的結構 參與DNA折疊 的蛋白質類組蛋白與 DNA結合后，

13、幫助 DNA進行高度折疊， 除類組蛋白外，DNA 還與其他蛋白質相結合。 如與復制、轉錄和加工 有關的蛋白質結合在一 起，這樣，其環(huán)狀染色 體DNA以緊密纏繞的、 致密的、不規(guī)則小體形 式存在，該小體即是擬 核。電鏡下呈圓形或橢 圓形。 擬核： 三、細菌染色體的復制 細菌的復制基因與酶類細菌的復制基因與酶類 Initiate genes dna B prepriming 300kd 20 copies/cell hexamer RNApol primase for leading S. dna C acts with dnaB 25kd dna G primase for lagging S.

14、 60kd 25 (Okazaki fragment ) monomer SSB Binding with S.S.DNA 74kd 300 Prevents from anneal monomer Elongate genes dnaE DNA polymerase III() 140kd 20 dnaZ DNA polymerase III() 52kd 20 polA DNA polymerase I 109kd 400 polB DNA polymerase II 90-120kd 100 Topoisomerase topA TopI (swivelase) 100kd superh

15、elix D.S.helix Topoisomerase gyr TopII (gyrase) gyr D.S.helix superhelix Cut D.S. DNA ATP Ligate Topoisomerase rep Relaxed protein (Helicase) D.S. DNA S.S. DNA lig Ligase HDP Helix Di-stabilizing Protein No ATPase Binding S. S. DNA decrease Tm Prevents from anneal b) DNA聚合酶聚合酶 （DNA polymerase） Proka

16、ryoteProkaryote I polA 109KD 3-5和5-3外切酶活性 切除RNA引物和參與后隨鏈合成中的缺口填 充反應 II polB 3-5外切酶活性 III 10種不同的亞基組成 核心酶和全酶 Top I , Top II Helicase (rep protein) Single Strand Binding protein (SSB) Helix destabilizing protein (HDP) DnaB protein DnaC protein Primase Ung-ase DNA Polymerase III DNA Polymerase I Ligase f

17、or primosome 復復 制制 體體 進進 化化 中中 形形 成成 了了 靈靈 活活 的的 多多 酶酶 復復 合合 體體 replisome 進進 化化 中中 形形 成成 了了 靈靈 活活 的的 多多 酶酶 復復 合合 體體 replisome 位于復制叉處的多酶復合體位于復制叉處的多酶復合體 完成完成 lagging Strand DNA延伸時延伸時 必須快速從一個岡崎片段移到另一岡崎片段必須快速從一個岡崎片段移到另一岡崎片段 In lagging Strand 多酶系統(tǒng)多酶系統(tǒng) 必須完成多次反復的啟動與擴展必須完成多次反復的啟動與擴展 E.coli 啟動啟動20004000次的岡崎片

18、段復制次的岡崎片段復制 Replisome modelReplisome model 復制起點 AT豐富DNA識別位點 DNA box 5-TTATCCACA-3 13個富含AT的單核苷酸 5-GATCTNTTNTTTT-3 大腸桿菌染色體復制起點oriC 的結構 DNA復制過程 鏈的生長原理 起始階段: 識別oriC 起始階段: 雙鏈分開 起始階段: 引物的合成 延伸階段: The termination of DNA replication E.coli (單起點雙方向單起點雙方向) 兩復制叉的相遇處具有多個終止位點兩復制叉的相遇處具有多個終止位點(不是復制叉簡單相遇）不是復制叉簡單相遇）

19、 terE, D, A terF, C, B (22bp保守區(qū)保守區(qū)) F B Terminus Utilization Substance（TUS 36kd） C A D ETer-TUS復合體 終止階段: terE, D, A 僅對反時針方向的復制叉具有終止效應僅對反時針方向的復制叉具有終止效應 terF, B, C 僅對順時針僅對順時針方向的復制叉具有終止效應方向的復制叉具有終止效應 F B C A D E Ter-TUS復合體復合體 (Rep. fork trap) 終止終止DnaB(螺旋酶螺旋酶) 防止防止DNA過度復制過度復制 避免出現(xiàn)避免出現(xiàn)DNA多聚體，高拷貝多聚體，高拷貝 四

20、、細菌染色體的分離機制 第五節(jié)基因結構和基因組 n基因結構和基因概念的發(fā)展 n基因組學 n大腸桿菌的基因組 nX174噬菌體的基因組 n真核生物的基因組及其特點 原核基因結構:-35,-10區(qū)的特征 真核基因結構:增強子,外顯子,內含子 一、基因結構和基因概念 基本概念 ngene npromoter nORF nterminator nIntron nexon nTATA box nCAAT box nEnhancer nsilencer overlapping gene split gene pseudogene movable gene 二、基因組學 基因組的大小: 病毒103bp 原核

21、生物106bp 真核生物109bp 基因組:單倍體細胞核內整套染色體所含的 DNA分子及其所攜帶的全部基因 Map of the Mycoplasma genitalium genome Map of the Haemophilus influenzae genome 基因組學的發(fā)展 E. coli 的基因組 轉錄單元:由啟動子,結構基因和終止子組成 的一段DNA順序. 操縱子:功能上相關聯(lián)的幾個結構基因前后相 連,利用一個共同的啟動子和終止子,這種轉 錄單元被稱為操縱子. X174噬菌體的基因組 真核生物的基因組及其特點 基因組的分子量大基因組的分子量大 真核生物有很多條染色體，一般呈線性真

22、核生物有很多條染色體，一般呈線性 核基因組核基因組DNADNA存在于細胞核內存在于細胞核內 基因組有大量不編碼蛋白質的序列基因組有大量不編碼蛋白質的序列 真核生物的蛋白質編碼基因往往以單拷貝形式存在真核生物的蛋白質編碼基因往往以單拷貝形式存在 非重復序列（單一序列） 中度重復序列 高度重復序列（衛(wèi)星DNA） 真核生物基因組中的DNA序列特征: 基因家族:真核生物基因組中存在的許多來源相同、 結構相似、功能相關的一組基因。 基因簇：有些基因家族的成員緊密排列成大段的 串聯(lián)重復單位，定位于染色體上的特殊區(qū)域。 DNA 一一 級級 結結 構構 分分 析析 （DNA sequencing ） The

23、Nobel Prize in Chemistry 1980 for their contributions concerning the determination of base sequences in nucleic acids Frederick Sanger MRC Laboratory of Molecular Biology Cambridge, Great Britain 1918 - 全基因組測序舉例 Haemophilus influenzae 復習題 n工業(yè)微生物菌種的特點。 n簡述微生物遺傳育種發(fā)展簡史。 n證明遺傳物質是DNA/RNA的實驗是什么？ n說明DNA的三級結構。 n闡述DNA復制方式。 n總結本章基本概念。 1. 基本概念基本概念 2. 復制起點與方向復制起點與方向 3. Semi-Conservation Replication 4. 復制的方式復制的方式 isolation of ori 細菌的復制基因與酶類細菌的復制基因與酶類 Initiate genes dna B prepriming 300kd 20 copies/cell hexamer RNApol primase for leading S. dna C acts w