1、蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄羇蒄螆袆蒞蒃薅肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肅蒀袂羃莂葿薂螆羋薈蚄羈膄薈螆螄肀薇蒆羀羆薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃袁膆薃薃肆肂薂蚅衿莁螞螇肅芇蟻袀袇膃蝕蕿肅聿芆螂袆肅芅襖膁莃芅薄羄艿芄蚆腿膅芃螈羂肁節(jié)袀螅莀莁薀羈芆莀螞螃膂荿裊罿膈荿薄袂肄莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄羇蒄螆袆蒞蒃薅肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肅蒀袂羃莂葿薂螆羋薈蚄羈膄薈螆螄肀薇蒆羀羆薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃袁膆薃薃肆肂薂蚅衿莁螞螇肅芇蟻袀袇膃蝕蕿肅聿芆螂袆肅芅襖膁莃芅薄羄艿芄蚆腿膅芃螈羂肁節(jié)袀螅莀莁薀羈芆莀螞螃膂荿裊罿膈荿薄袂肄莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄羇蒄螆袆蒞蒃薅肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肅蒀袂羃莂葿薂螆羋薈蚄羈膄薈

2、螆螄肀薇蒆羀羆薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃袁膆薃薃肆肂薂蚅衿莁螞螇肅芇蟻袀袇膃蝕蕿肅聿芆螂袆肅芅襖膁莃芅薄羄艿芄蚆腿膅芃螈羂肁節(jié)袀螅莀莁薀羈芆莀螞螃膂荿裊罿膈荿薄袂肄莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄羇蒄螆袆蒞蒃薅肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肅蒀袂羃莂葿薂螆羋薈蚄羈膄薈螆螄肀薇蒆羀羆薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃袁膆薃薃肆肂薂蚅衿莁螞螇肅芇蟻袀袇膃蝕蕿肅聿芆螂袆肅芅襖膁莃芅薄羄艿芄蚆腿膅芃螈羂肁節(jié)袀螅莀莁薀羈芆莀螞螃膂荿裊罿膈荿薄袂肄莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄羇蒄螆袆蒞蒃薅肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肅蒀袂羃莂葿薂螆羋薈蚄羈膄薈螆螄肀薇蒆羀羆薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃袁膆薃薃肆肂薂蚅衿莁螞螇肅芇蟻袀袇膃蝕蕿肅聿芆螂袆肅芅

3、襖膁莃芅薄羄艿芄蚆腿膅芃螈羂肁節(jié)袀螅莀莁薀羈芆莀螞螃膂荿裊罿膈荿薄袂肄莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄羇蒄螆袆蒞蒃薅肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肅蒀袂羃莂葿薂螆羋薈蚄羈膄薈螆螄肀薇蒆羀羆薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃袁膆薃薃肆肂薂蚅衿莁螞螇肅芇蟻袀袇膃蝕蕿肅聿芆螂袆肅芅襖膁莃芅薄羄艿芄蚆腿膅芃螈羂肁節(jié)袀螅莀莁薀羈芆莀螞螃膂荿裊罿膈荿薄袂肄莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄羇蒄螆袆蒞蒃薅肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肅蒀袂羃莂葿薂螆羋薈蚄羈膄薈螆螄肀薇蒆羀羆薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃袁膆薃薃肆肂薂蚅衿莁螞螇肅芇蟻袀袇膃蝕蕿肅聿芆螂袆肅芅襖膁莃芅薄羄艿芄蚆腿膅芃螈羂肁節(jié)袀螅莀莁薀羈芆莀螞螃膂荿裊罿膈荿薄袂肄莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆

4、袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄羇蒄螆袆蒞蒃薅肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肅蒀袂羃莂葿薂螆羋薈蚄羈膄薈螆螄肀薇蒆羀羆薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃袁膆薃薃肆肂薂蚅衿莁螞螇肅芇蟻袀袇膃蝕蕿肅聿芆螂袆肅芅襖膁莃芅薄羄艿芄蚆腿膅芃螈羂肁節(jié)袀螅莀莁薀羈芆莀螞螃膂荿裊罿膈荿薄袂肄莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄羇蒄螆袆蒞蒃薅肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肅蒀袂羃莂葿薂螆羋薈蚄羈膄薈螆螄肀薇蒆羀羆薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃袁膆薃薃肆肂薂蚅衿莁螞螇肅芇蟻袀袇膃蝕蕿肅聿芆螂袆肅芅襖膁莃芅薄羄艿芄蚆腿膅芃螈羂肁節(jié)袀螅莀莁薀羈芆莀螞螃膂荿裊罿膈荿薄袂肄莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄羇蒄螆袆蒞蒃薅肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肅蒀袂羃莂葿薂螆羋薈蚄羈膄薈螆螄肀薇

5、蒆羀羆薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃袁膆薃薃肆肂薂蚅衿莁螞螇肅芇蟻袀袇膃蝕蕿肅聿芆螂袆肅芅襖膁莃芅薄羄艿芄蚆腿膅芃螈羂肁節(jié)袀螅莀莁薀羈芆莀螞螃膂荿裊罿膈荿薄袂肄莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄羇蒄螆袆蒞蒃薅肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肅蒀袂羃莂葿薂螆羋薈蚄羈膄薈螆螄肀薇蒆羀羆薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃袁膆薃薃肆肂薂蚅衿莁螞螇肅芇蟻袀袇膃蝕蕿肅聿芆螂袆肅芅襖膁莃芅薄羄艿芄蚆腿膅芃螈羂肁節(jié)袀螅莀莁薀羈芆莀螞螃膂荿裊罿膈荿薄袂肄莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄羇蒄螆袆蒞蒃薅肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肅蒀袂羃莂葿薂螆羋薈蚄羈膄薈螆螄肀薇蒆羀羆薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃袁膆薃薃肆肂薂蚅衿莁螞螇肅芇蟻袀袇膃蝕蕿肅聿芆螂袆肅芅襖膁莃芅

6、薄羄艿芄蚆腿膅芃螈羂肁節(jié)袀螅莀莁薀羈芆莀螞螃膂荿裊罿膈荿薄袂肄莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄羇蒄螆袆蒞蒃薅肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肅蒀袂羃莂葿薂螆羋薈蚄羈膄薈螆螄肀薇蒆羀羆薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃袁膆薃薃肆肂薂蚅衿莁螞螇肅芇蟻袀袇膃蝕蕿肅聿芆螂袆肅芅襖膁莃芅薄羄艿芄蚆腿膅芃螈羂肁節(jié)袀螅莀莁薀羈芆莀螞螃膂荿裊罿膈荿薄袂肄莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄羇蒄螆袆蒞蒃薅肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肅蒀袂羃莂葿薂螆羋薈蚄羈膄薈螆螄肀薇蒆羀羆薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃袁膆薃薃肆肂薂蚅衿莁螞螇肅芇蟻袀袇膃蝕蕿肅聿芆螂袆肅芅襖膁莃芅薄羄艿芄蚆腿膅芃螈羂肁節(jié)袀螅莀莁薀羈芆莀螞螃膂荿裊罿膈荿薄袂肄莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅

7、薁袈肁蒄蚃肄羇蒄螆袆蒞蒃薅肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肅蒀袂羃莂葿薂螆羋薈蚄羈膄薈螆螄肀薇蒆羀羆薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃袁膆薃薃肆肂薂蚅衿莁螞螇肅芇蟻袀袇膃蝕蕿肅聿芆螂袆肅芅襖膁莃芅薄羄艿芄蚆腿膅芃螈羂肁節(jié)袀螅莀莁薀羈芆莀螞螃膂荿裊罿膈荿薄袂肄莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄羇蒄螆袆蒞蒃薅肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肅蒀袂羃莂葿薂螆羋薈蚄羈膄薈螆螄肀薇蒆羀羆薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃袁膆薃薃肆肂薂蚅衿莁螞螇肅芇蟻袀袇膃蝕蕿肅聿芆螂袆肅芅襖膁莃芅薄羄艿芄蚆腿膅芃螈羂肁節(jié)袀螅莀莁薀羈芆莀螞螃膂荿裊罿膈荿薄袂肄莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄羇蒄螆袆蒞蒃薅肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肅蒀袂羃莂葿薂螆羋薈蚄羈膄薈螆螄肀薇蒆羀羆薆

8、蚈螂莄薅螁肈芀薄袃袁膆薃薃肆肂薂蚅衿莁螞螇肅芇蟻袀袇膃蝕蕿肅聿芆螂袆肅芅襖膁莃芅薄羄艿芄蚆腿膅芃螈羂肁節(jié)袀螅莀莁薀羈芆莀螞螃膂荿裊罿膈荿薄袂肄莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄羇蒄螆袆蒞蒃薅肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肅蒀袂羃莂葿薂螆羋薈蚄羈膄薈螆螄肀薇蒆羀羆薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃袁膆薃薃肆肂薂蚅衿莁螞螇肅芇蟻袀袇膃蝕蕿肅聿芆螂袆肅芅襖膁莃芅薄羄艿芄蚆腿膅芃螈羂肁節(jié)袀螅莀莁薀羈芆莀螞螃膂荿裊罿膈荿薄袂肄莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄羇蒄螆袆蒞蒃薅肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肅蒀袂羃莂葿薂螆羋薈蚄羈膄薈螆螄肀薇蒆羀羆薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃袁膆薃薃肆肂薂蚅衿莁螞螇肅芇蟻袀袇膃蝕蕿肅聿芆螂袆肅芅襖膁莃芅薄羄艿芄

9、蚆腿膅芃螈羂肁節(jié)袀螅莀莁薀羈芆莀螞螃膂荿裊罿膈荿薄袂肄莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄羇蒄螆袆蒞蒃薅肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肅蒀袂羃莂葿薂螆羋薈蚄羈膄薈螆螄肀薇蒆羀羆薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃袁膆薃薃肆肂薂蚅衿莁螞螇肅芇蟻袀袇膃蝕蕿肅聿芆螂袆肅芅襖膁莃芅薄羄艿芄蚆腿膅芃螈羂肁節(jié)袀螅莀莁薀羈芆莀螞螃膂荿裊罿膈荿薄袂肄莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄羇蒄螆袆蒞蒃薅肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肅蒀袂羃莂葿薂螆羋薈蚄羈膄薈螆螄肀薇蒆羀羆薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃袁膆薃薃肆肂薂蚅衿莁螞螇肅芇蟻袀袇膃蝕蕿肅聿芆螂袆肅芅襖膁莃芅薄羄艿芄蚆腿膅芃螈羂肁節(jié)袀螅莀莁薀羈芆莀螞螃膂荿裊罿膈荿薄袂肄莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄

10、蚃肄羇蒄螆袆蒞蒃薅肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肅蒀袂羃莂葿薂螆羋薈蚄羈膄薈螆螄肀薇蒆羀羆薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃袁膆薃薃肆肂薂蚅衿莁螞螇肅芇蟻袀袇膃蝕蕿肅聿芆螂袆肅芅襖膁莃芅薄羄艿芄蚆腿膅芃螈羂肁節(jié)袀螅莀莁薀羈芆莀螞螃膂荿裊罿膈荿薄袂肄莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄羇蒄螆袆蒞蒃薅肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肅蒀袂羃莂葿薂螆羋薈蚄羈膄薈螆螄肀薇蒆羀羆薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃袁膆薃薃肆肂薂蚅衿莁螞螇肅芇蟻袀袇膃蝕蕿肅聿芆螂袆肅芅襖膁莃芅薄羄艿芄蚆腿膅芃螈羂肁節(jié)袀螅莀莁薀羈芆莀螞螃膂荿裊罿膈荿薄袂肄莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄羇蒄螆袆蒞蒃薅肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肅蒀袂羃莂葿薂螆羋薈蚄羈膄薈螆螄肀薇蒆羀羆薆蚈螂莄薅

11、螁肈芀薄袃袁膆薃薃肆肂薂蚅衿莁螞螇肅芇蟻袀袇膃蝕蕿肅聿芆螂袆肅芅襖膁莃芅薄羄艿芄蚆腿膅芃螈羂肁節(jié)袀螅莀莁薀羈芆莀螞螃膂荿裊罿膈荿薄袂肄莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄羇蒄螆袆蒞蒃薅肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肅蒀袂羃莂葿薂螆羋薈蚄羈膄薈螆螄肀薇蒆羀羆薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃袁膆薃薃肆肂薂蚅衿莁螞螇肅芇蟻袀袇膃蝕蕿肅聿芆螂袆肅芅襖膁莃芅薄羄艿芄蚆腿膅芃螈羂肁節(jié)袀螅莀莁薀羈芆莀螞螃膂荿裊罿膈荿薄袂肄莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄羇蒄螆袆蒞蒃薅肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肅蒀袂羃莂葿薂螆羋薈蚄羈膄薈螆螄肀薇蒆羀羆薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃袁膆薃薃肆肂薂蚅衿莁螞螇肅芇蟻袀袇膃蝕蕿肅聿芆螂袆肅芅襖膁莃芅薄羄艿芄蚆腿膅芃

12、螈羂肁節(jié)袀螅莀莁薀羈芆莀螞螃膂荿裊罿膈荿薄袂肄莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄羇蒄螆袆蒞蒃薅肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肅蒀袂羃莂葿薂螆羋薈蚄羈膄薈螆螄肀薇蒆羀羆薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃袁膆薃薃肆肂薂蚅衿莁螞螇肅芇蟻袀袇膃蝕蕿肅聿芆螂袆肅芅襖膁莃芅薄羄艿芄蚆腿膅芃螈羂肁節(jié)袀螅莀莁薀羈芆莀螞螃膂荿裊罿膈荿薄袂肄莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄羇蒄螆袆蒞蒃薅肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肅蒀袂羃莂葿薂螆羋薈蚄羈膄薈螆螄肀薇蒆羀羆薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃袁膆薃薃肆肂薂蚅衿莁螞螇肅芇蟻袀袇膃蝕蕿肅聿芆螂袆肅芅襖膁莃芅薄羄艿芄蚆腿膅芃螈羂肁節(jié)袀螅莀莁薀羈芆莀螞螃膂荿裊罿膈荿薄袂肄莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄羇蒄

13、螆袆蒞蒃薅肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肅蒀袂羃莂葿薂螆羋薈蚄羈膄薈螆螄肀薇蒆羀羆薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃袁膆薃薃肆肂薂蚅衿莁螞螇肅芇蟻袀袇膃蝕蕿肅聿芆螂袆肅芅襖膁莃芅薄羄艿芄蚆腿膅芃螈羂肁節(jié)袀螅莀莁薀羈芆莀螞螃膂荿裊罿膈荿薄袂肄莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄羇蒄螆袆蒞蒃薅肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肅蒀袂羃莂葿薂螆羋薈蚄羈膄薈螆螄肀薇蒆羀羆薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃袁膆薃薃肆肂薂蚅衿莁螞螇肅芇蟻袀袇膃蝕蕿肅聿芆螂袆肅芅襖膁莃芅薄羄艿芄蚆腿膅芃螈羂肁節(jié)袀螅莀莁薀羈芆莀螞螃膂荿裊罿膈荿薄袂肄莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄羇蒄螆袆蒞蒃薅肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肅蒀袂羃莂葿薂螆羋薈蚄羈膄薈螆螄肀薇蒆羀羆薆蚈螂莄薅螁肈芀薄

14、袃袁膆薃薃肆肂薂蚅衿莁螞螇肅芇蟻袀袇膃蝕蕿肅聿芆螂袆肅芅襖膁莃芅薄羄艿芄蚆腿膅芃螈羂肁節(jié)袀螅莀莁薀羈芆莀螞螃膂荿裊罿膈荿薄袂肄莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄羇蒄螆袆蒞蒃薅肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肅蒀袂羃莂葿薂螆羋薈蚄羈膄薈螆螄肀薇蒆羀羆薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃袁膆薃薃肆肂薂蚅衿莁螞螇肅芇蟻袀袇膃蝕蕿肅聿芆螂袆肅芅襖膁莃芅薄羄艿芄蚆腿膅芃螈羂肁節(jié)袀螅莀莁薀羈芆莀螞螃膂荿裊罿膈荿薄袂肄莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄羇蒄螆袆蒞蒃薅肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肅蒀袂羃莂葿薂螆羋薈蚄羈膄薈螆螄肀薇蒆羀羆薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃袁膆薃薃肆肂薂蚅衿莁螞螇肅芇蟻袀袇膃蝕蕿肅聿芆螂袆肅芅襖膁莃芅薄羄艿芄蚆腿膅芃螈羂肁節(jié)

15、袀螅莀莁薀羈芆莀螞螃膂荿裊罿膈荿薄袂肄莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄羇蒄螆袆蒞蒃薅肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肅蒀袂羃莂葿薂螆羋薈蚄羈膄薈螆螄肀薇蒆羀羆薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃袁膆薃薃肆肂薂蚅衿莁螞螇肅芇蟻袀袇膃蝕蕿肅聿芆螂袆肅芅襖膁莃芅薄羄艿芄蚆腿膅芃螈羂肁節(jié)袀螅莀莁薀羈芆莀螞螃膂荿裊罿膈荿薄袂肄莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄羇蒄螆袆蒞蒃薅肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肅蒀袂羃莂葿薂螆羋薈蚄羈膄薈螆螄肀薇蒆羀羆薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃袁膆薃薃肆肂薂蚅衿莁螞螇肅芇蟻袀袇膃蝕蕿肅聿芆螂袆肅芅襖膁莃芅薄羄艿芄蚆腿膅芃螈羂肁節(jié)袀螅莀莁薀羈芆莀螞螃膂荿裊罿膈荿薄袂肄莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄羇蒄螆袆蒞蒃

16、薅肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肅蒀袂羃莂葿薂螆羋薈蚄羈膄薈螆螄肀薇蒆羀羆薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃袁膆薃薃肆肂薂蚅衿莁螞螇肅芇蟻袀袇膃蝕蕿肅聿芆螂袆肅芅襖膁莃芅薄羄艿芄蚆腿膅芃螈羂肁節(jié)袀螅莀莁薀羈芆莀螞螃膂荿裊罿膈荿薄袂肄莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄羇蒄螆袆蒞蒃薅肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肅蒀袂羃莂葿薂螆羋薈蚄羈膄薈螆螄肀薇蒆羀羆薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃袁膆薃薃肆肂薂蚅衿莁螞螇肅芇蟻袀袇膃蝕蕿肅聿芆螂袆肅芅襖膁莃芅薄羄艿芄蚆腿膅芃螈羂肁節(jié)袀螅莀莁薀羈芆莀螞螃膂荿裊罿膈荿薄袂肄莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄羇蒄螆袆蒞蒃薅肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肅蒀袂羃莂葿薂螆羋薈蚄羈膄薈螆螄肀薇蒆羀羆薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃袁膆薃

17、薃肆肂薂蚅衿莁螞螇肅芇蟻袀袇膃蝕蕿肅聿芆螂袆肅芅襖膁莃芅薄羄艿芄蚆腿膅芃螈羂肁節(jié)袀螅莀莁薀羈芆莀螞螃膂荿裊罿膈荿薄袂肄莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄羇蒄螆袆蒞蒃薅肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肅蒀袂羃莂葿薂螆羋薈蚄羈膄薈螆螄肀薇蒆羀羆薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃袁膆薃薃肆肂薂蚅衿莁螞螇肅芇蟻袀袇膃蝕蕿肅聿芆螂袆肅芅襖膁莃芅薄羄艿芄蚆腿膅芃螈羂肁節(jié)袀螅莀莁薀羈芆莀螞螃膂荿裊罿膈荿薄袂肄莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄羇蒄螆袆蒞蒃薅肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肅蒀袂羃莂葿薂螆羋薈蚄羈膄薈螆螄肀薇蒆羀羆薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃袁膆薃薃肆肂薂蚅衿莁螞螇肅芇蟻袀袇膃蝕蕿肅聿芆螂袆肅芅襖膁莃芅薄羄艿芄蚆腿膅芃螈羂肁節(jié)袀螅莀莁

18、薀羈芆莀螞螃膂荿裊罿膈荿薄袂肄莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄羇蒄螆袆蒞蒃薅肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肅蒀袂羃莂葿薂螆羋薈蚄羈膄薈螆螄肀薇蒆羀羆薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃袁膆薃薃肆肂薂蚅衿莁螞螇肅芇蟻袀袇膃蝕蕿肅聿芆螂袆肅芅襖膁莃芅薄羄艿芄蚆腿膅芃螈羂肁節(jié)袀螅莀莁薀羈芆莀螞螃膂荿裊罿膈荿薄袂肄莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄羇蒄螆袆蒞蒃薅肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肅蒀袂羃莂葿薂螆羋薈蚄羈膄薈螆螄肀薇蒆羀羆薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃袁膆薃薃肆肂薂蚅衿莁螞螇肅芇蟻袀袇膃蝕蕿肅聿芆螂袆肅芅襖膁莃芅薄羄艿芄蚆腿膅芃螈羂肁節(jié)袀螅莀莁薀羈芆莀螞螃膂荿裊罿膈荿薄袂肄莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄羇蒄螆袆蒞蒃薅肂芁蒂

19、蚈羅膇蒁螀膀肅蒀袂羃莂葿薂螆羋薈蚄羈膄薈螆螄肀薇蒆羀羆薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃袁膆薃薃肆肂薂蚅衿莁螞螇肅芇蟻袀袇膃蝕蕿肅聿芆螂袆肅芅襖膁莃芅薄羄艿芄蚆腿膅芃螈羂肁節(jié)袀螅莀莁薀羈芆莀螞螃膂荿裊罿膈荿薄袂肄莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄羇蒄螆袆蒞蒃薅肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肅蒀袂羃莂葿薂螆羋薈蚄羈膄薈螆螄肀薇蒆羀羆薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃袁膆薃薃肆肂薂蚅衿莁螞螇肅芇蟻袀袇膃蝕蕿肅聿芆螂袆肅芅襖膁莃芅薄羄艿芄蚆腿膅芃螈羂肁節(jié)袀螅莀莁薀羈芆莀螞螃膂荿裊罿膈荿薄袂肄莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄羇蒄螆袆蒞蒃薅肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肅蒀袂羃莂葿薂螆羋薈蚄羈膄薈螆螄肀薇蒆羀羆薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃袁膆薃薃肆肂薂

20、蚅衿莁螞螇肅芇蟻袀袇膃蝕蕿肅聿芆螂袆肅芅襖膁莃芅薄羄艿芄蚆腿膅芃螈羂肁節(jié)袀螅莀莁薀羈芆莀螞螃膂荿裊罿膈荿薄袂肄莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄羇蒄螆袆蒞蒃薅肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肅蒀袂羃莂葿薂螆羋薈蚄羈膄薈螆螄肀薇蒆羀羆薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃袁膆薃薃肆肂薂蚅衿莁螞螇肅芇蟻袀袇膃蝕蕿肅聿芆螂袆肅芅襖膁莃芅薄羄艿芄蚆腿膅芃螈羂肁節(jié)袀螅莀莁薀羈芆莀螞螃膂荿裊罿膈荿薄袂肄莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄羇蒄螆袆蒞蒃薅肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肅蒀袂羃莂葿薂螆羋薈蚄羈膄薈螆螄肀薇蒆羀羆薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃袁膆薃薃肆肂薂蚅衿莁螞螇肅芇蟻袀袇膃蝕蕿肅聿芆螂袆肅芅襖膁莃芅薄羄艿芄蚆腿膅芃螈羂肁節(jié)袀螅莀莁薀羈芆莀

21、螞螃膂荿裊罿膈荿薄袂肄莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄羇蒄螆袆蒞蒃薅肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肅蒀袂羃莂葿薂螆羋薈蚄羈膄薈螆螄肀薇蒆羀羆薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃袁膆薃薃肆肂薂蚅衿莁螞螇肅芇蟻袀袇膃蝕蕿肅聿芆螂袆肅芅襖膁莃芅薄羄艿芄蚆腿膅芃螈羂肁節(jié)袀螅莀莁薀羈芆莀螞螃膂荿裊罿膈荿薄袂肄莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄羇蒄螆袆蒞蒃薅肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肅蒀袂羃莂葿薂螆羋薈蚄羈膄薈螆螄肀薇蒆羀羆薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃袁膆薃薃肆肂薂蚅衿莁螞螇肅芇蟻袀袇膃蝕蕿肅聿芆螂袆肅芅襖膁莃芅薄羄艿芄蚆腿膅芃螈羂肁節(jié)袀螅莀莁薀羈芆莀螞螃膂荿裊罿膈荿薄袂肄莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄羇蒄螆袆蒞蒃薅肂芁蒂蚈羅膇蒁

22、螀膀肅蒀袂羃莂葿薂螆羋薈蚄羈膄薈螆螄肀薇蒆羀羆薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃袁膆薃薃肆肂薂蚅衿莁螞螇肅芇蟻袀袇膃蝕蕿肅聿芆螂袆肅芅襖膁莃芅薄羄艿芄蚆腿膅芃螈羂肁節(jié)袀螅莀莁薀羈芆莀螞螃膂荿裊罿膈荿薄袂肄莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄羇蒄螆袆蒞蒃薅肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肅蒀袂羃莂葿薂螆羋薈蚄羈膄薈螆螄肀薇蒆羀羆薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃袁膆薃薃肆肂薂蚅衿莁螞螇肅芇蟻袀袇膃蝕蕿肅聿芆螂袆肅芅襖膁莃芅薄羄艿芄蚆腿膅芃螈羂肁節(jié)袀螅莀莁薀羈芆莀螞螃膂荿裊罿膈荿薄袂肄莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄羇蒄螆袆蒞蒃薅肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肅蒀袂羃莂葿薂螆羋薈蚄羈膄薈螆螄肀薇蒆羀羆薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃袁膆薃薃肆肂薂蚅衿莁螞

23、螇肅芇蟻袀袇膃蝕蕿肅聿芆螂袆肅芅襖膁莃芅薄羄艿芄蚆腿膅芃螈羂肁節(jié)袀螅莀莁薀羈芆莀螞螃膂荿裊罿膈荿薄袂肄莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄羇蒄螆袆蒞蒃薅肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肅蒀袂羃莂葿薂螆羋薈蚄羈膄薈螆螄肀薇蒆羀羆薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃袁膆薃薃肆肂薂蚅衿莁螞螇肅芇蟻袀袇膃蝕蕿肅聿芆螂袆肅芅襖膁莃芅薄羄艿芄蚆腿膅芃螈羂肁節(jié)袀螅莀莁薀羈芆莀螞螃膂荿裊罿膈荿薄袂肄莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄羇蒄螆袆蒞蒃薅肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肅蒀袂羃莂葿薂螆羋薈蚄羈膄薈螆螄肀薇蒆羀羆薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃袁膆薃薃肆肂薂蚅衿莁螞螇肅芇蟻袀袇膃蝕蕿肅聿芆螂袆肅芅襖膁莃芅薄羄艿芄蚆腿膅芃螈羂肁節(jié)袀螅莀莁薀羈芆莀螞螃膂荿

24、裊罿膈荿薄袂肄莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄羇蒄螆袆蒞蒃薅肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肅蒀袂羃莂葿薂螆羋薈蚄羈膄薈螆螄肀薇蒆羀羆薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃袁膆薃薃肆肂薂蚅衿莁螞螇肅芇蟻袀袇膃蝕蕿肅聿芆螂袆肅芅襖膁莃芅薄羄艿芄蚆腿膅芃螈羂肁節(jié)袀螅莀莁薀羈芆莀螞螃膂荿裊罿膈荿薄袂肄莈蚇肇莃莇蝿袀艿莆袁肅膅蒅薁袈肁蒄蚃肄羇蒄螆袆蒞蒃薅肂芁蒂蚈羅膇蒁螀膀肅蒀袂羃莂葿薂螆羋薈蚄羈膄薈螆螄肀薇蒆羀羆薆蚈螂莄薅螁肈芀薄袃袁膆薃薃肆肂薂蚅衿莁螞螇肅芇蟻袀袇膃蝕蕿肅聿芆螂袆肅芅襖膁莃芅薄羄艿芄蚆腿膅芃螈 緒論一、生化工程的概念biochemical engineering 生化工程：將生物技術的實驗室成果經(jīng)工藝及工程開

25、發(fā)，成為可供工業(yè)生產(chǎn)的工藝過程，常稱為生化工程。生物工程的重要組成部分，包括底物或營養(yǎng)液的準備、預處理、轉化以及產(chǎn)品的分離、精制等工程和工藝問題。一般把發(fā)酵工程、動植物細胞的大規(guī)模培養(yǎng)、酶工程、生化反應工程、生物分離工程（下游工程）、生物功能元件（如酶電極）以及生物過程中的控制和優(yōu)化都包括在生化工程之內。二、生化工程的由來20世紀40年代，第二次世界大戰(zhàn)中青霉素大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)而誕生了生化工程。美國科學家蓋頓關于通風攪拌傳質的論文，作為生化工程的誕生標志。1959年生化工程雜志biotech&bioengineering創(chuàng)刊。1965年出現(xiàn)第一本生化工程的書biochemical engine

26、ering。三、生化工程的特點1.以生物活細胞或由細胞提取出來的酶為催化劑生物化學反應過程。2.生物反應過程通常在溫和的條件下進行，但影響因素多。3.生化反應器復雜，控制參數(shù)眾多。四、生化工程研究的內容生化工程是一門邊緣交叉學科，研究的內容非常豐富。生化工程按所處理的對象分為微生物生化工程、植物生化工程、動物生化工程和酶生化工程。生化工程內容按對細胞處理的方式大致分胞外控制部分和胞內控制部分兩大部分。胞外控制部分包括：培養(yǎng)基的滅菌、通氣攪拌、固定化技術、空氣除菌、比擬放大、產(chǎn)品分離和純化、發(fā)酵動力學、發(fā)酵優(yōu)化控制和細胞培養(yǎng)技術等。胞內控制部分包括：遺傳育種、代謝控制、培養(yǎng)基平衡等。五、生化工程

27、的發(fā)展兩大躍變第一次躍變：20世紀40年代抗生素的深層發(fā)酵的實現(xiàn)。第二次躍變：20世紀70年代后期分子生物學和遺傳學的發(fā)展。六、今后生化工程重點發(fā)展的四個方面1.新型生物反應器的研究開發(fā)，特別是針對基因工程產(chǎn)品和動、植物細胞培養(yǎng)的產(chǎn)品的投產(chǎn)研制新型生物反應器。重點在于生物安全。植物細胞對剪切力和環(huán)境敏感以及培養(yǎng)周期長而防止污染的問題。動物細胞的附壁生長的特點。2. 新型分離方法和設備的研發(fā)，特別是針對蛋白質、多肽產(chǎn)品的分離。3.各種描述生物反應過程的數(shù)學模型的建立，將有利于過程的控制和優(yōu)化以及計算機的應用。4.生物反應器內重要參數(shù)的傳感器的研制和有關計算機控制系統(tǒng)硬件及軟件的建立和完善。七、生

28、化工程的應用1.醫(yī)藥工業(yè)主要生產(chǎn)人體或動物體內調節(jié)生理作用的藥物。如：激素、胰島素、抗生素、干擾素、維生素以及一些高效藥物（tpa等）2.食品工業(yè)傳統(tǒng)的調味及發(fā)酵食品、醇類飲料、有機酸、氨基酸、單細胞蛋白、甜味劑、鮮味劑等。3.化工、冶金工業(yè)生產(chǎn)許多化工原料，有甲醇、乙醇、丁醇、檸檬酸、水楊酸、長鏈二元酸、丙酮、甘油還有使用微生物合成聚羥基丁酸（phb）塑料和聚羥基脂肪酸酯（pha）。4.能源、環(huán)保微生物發(fā)酵生產(chǎn)甲烷等可再生能源。利用微生物處理污水。八、我國生化工程研究現(xiàn)狀我國生化工程研究起步較晚，但發(fā)展很快。初期只涉及生化反應器及反應動力學的研究，現(xiàn)已擴展到分離工程、動植物細胞培養(yǎng)及生物傳感

29、器及過程控制的研究。2.5l、5l、10l自控發(fā)酵罐已研制成功，計算機在線控制青霉素生產(chǎn)過程。工業(yè)微生物學基礎一、 微生物的特點體積小，比表面積大種類多，分布廣生長旺盛，繁殖快適應強，易變異細胞是生物的基本單位，其結構包括細胞壁、細胞膜、細胞質、細胞核、其他生物按細胞結構分類：非細胞生物（病毒、類病毒等）；原核生物（細菌、放線菌等）；真核生物（酵母、霉菌、動植物等）原核和真核細胞是細胞進化中的兩個層次，二者的主要區(qū)別是原核細胞無核仁核膜和細胞內膜結構。二、 工業(yè)生產(chǎn)常用的微生物用于大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)的菌種應該符合以下基本要求：（1） 生長繁殖能力強，在較短的發(fā)酵周期內即可產(chǎn)生大量有價值的發(fā)酵產(chǎn)物。

30、high yield（2） 發(fā)酵培養(yǎng)基應價格低廉、來源充足、被轉化為產(chǎn)品的效率高。cheap medium（3） 發(fā)酵副產(chǎn)物少，產(chǎn)品相對容易分離。less by-products（4） 培養(yǎng)條件易于控制，并具有抗噬菌體感染的能力。easy to control（5） 遺傳特性穩(wěn)定，不易變異和退化。stability of microorganism（6） 對人、動植物和環(huán)境不應造成危害。harmless / environmentally friendly目前育種總的趨勢：從野生菌轉向變異菌自然選育轉向代謝育種從誘發(fā)基因突變轉向基因重組由于發(fā)酵工程本身的發(fā)展以及遺傳工程的介入，藻類和病毒等也正

31、在逐步變?yōu)楣I(yè)生產(chǎn)用的生物。盡管如此，目前人們對微生物的認識還是十分不夠的，已經(jīng)初步研究的不超過自然界微生物總量的10%。微生物的代謝產(chǎn)物據(jù)統(tǒng)計已超過1300多種，而大規(guī)模生產(chǎn)的不超過100多種。微生物酶有近千種，而在工業(yè)上利用的不過四五十種，潛力巨大。在工業(yè)生產(chǎn)中常用的微生物主要有細菌、酵母菌、霉菌和放線菌。細菌(bacteria)屬于單細胞原核生物(unicellular prokaryote)，以典型的二分分裂(binary)方式繁殖。工業(yè)生產(chǎn)常用的細菌有：枯草芽孢桿菌(bacillus subtilis)、乳酸桿菌(lactobacillus lactics)、醋酸桿菌(acetoba

32、cter)、棒狀桿菌(corynebacterium)、短桿菌(brevibacterium),用于生產(chǎn)淀粉酶(amylase)、蛋白酶(proteinase)、乳酸(lactic acid)、醋酸(acetic acid)、氨基酸(amino acid)、肌苷酸(inosinic acid)。酵母菌(yeast)為單細胞真核生物(unicellular eukaryote)，在自然界中普遍存在，主要分布于含糖質較多的酸性環(huán)境中，如水果、蔬菜和植物葉子上，以及果園土壤中。工業(yè)上常用的酵母菌有：啤酒酵母(saccharomyces cerevisiae)、假絲酵母(candida)、類酵母(sa

33、ccharomycodes)等，用于釀酒、制造面包、制造低凝固點石油、病毒(virus) 其特點如下：1.形體微小，體積比細菌小的多。2.沒有細胞結構，是一種獨特分子的生物，主要由核酸和蛋白質構成。3.營寄生生活，由于缺乏獨立代謝的酶體系，不能脫離寄主而自行生長繁殖，有專一性。三、 微生物菌種的分離、選育與保藏1. 微生物菌種的分離spawn isolation發(fā)酵工業(yè)獲得生產(chǎn)菌株的途徑主要有：（1）從自然界分離篩選；（2）向菌種保藏中心、各實驗室索取或購置菌株，從中篩選；（3）直接購置專利菌種或向生產(chǎn)單位購置優(yōu)良生產(chǎn)菌種。從自然界分離新菌種一般步驟：采樣富集分離篩選（1）采樣collecti

34、on定義：根據(jù)微生物的生態(tài)特點從自然界取樣分離所需菌種的過程。采樣方式一般是除去表土，取離地面5-15cm處的土樣。（并非定律）根據(jù)微生物營養(yǎng)類型和生理特點確定采樣地點：飯店肉類加工廠蛋白酶和脂肪酶產(chǎn)生菌；糕點面粉加工廠淀粉酶產(chǎn)生菌；枯枝落葉爛木頭纖維素酶產(chǎn)生菌；蜂蜜甜果植物汁酵母菌；腐爛果蔬果園土果膠酶產(chǎn)生菌；溫泉堆肥火山灰高溫菌；（2）富集enrichment控制營養(yǎng)成分：淀粉（葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨不合適）為唯一碳源產(chǎn)淀粉酶的微生物控制培養(yǎng)條件：通過熱處理較易分離到產(chǎn)芽孢的細菌（將樣品經(jīng)80水浴處理10min左右）使用抑制劑：青霉素抑制細菌和放線菌；放線酮抑制酵母菌和霉菌。（3）分離is

35、olation常規(guī)分離法：傾注平板分離法、涂布平板分離法、平板劃線分離法（最為常用）和組織分離法平皿生化反應分離法：利用特殊的分離培養(yǎng)基對大量混雜微生物進行初步分離的方法。分離培養(yǎng)基根據(jù)目的菌特殊的生理特性或代謝產(chǎn)物來設計。如：平皿生化反應分離法目的微生物分離培養(yǎng)基透明圈法淀粉酶產(chǎn)生菌淀粉+碘液變色圈法果膠酶產(chǎn)生菌果膠+0.2%剛果紅溶液抑菌圈法抗生素產(chǎn)生菌工具菌：抗生素敏感菌生長圈法氨基酸、核苷酸和維生素等的產(chǎn)生菌工具菌：某生長因子的營養(yǎng)缺陷型菌株（4）篩選screening舉例：-淀粉酶產(chǎn)生菌的篩選。2. 誘變育種mutation breeding變異（variation）又稱突變（mut

36、ation），是育種的基礎。l 自然突變（natural mutation）：突變頻率很小l 誘發(fā)突變（induced mutation）：提高突變頻率誘變育種的概念：p17中間段誘變育種的步驟和方法：（1） 出發(fā)菌株的選擇original/stating strain應挑選對誘變劑敏感性大、變異幅度廣、產(chǎn)量高的出發(fā)菌株。用作誘變育種的出發(fā)菌株常從以下3類菌株中選取：l 自然界新分離的野生型菌株；l 生產(chǎn)中由于自發(fā)突變或長期在生產(chǎn)條件下馴化而篩選得到的菌株；l 每次誘變處理都有一定提高的菌株。（2） 單細胞菌懸液的制備bacterial suspension目的是為了使出發(fā)菌株細胞均勻地接觸誘

37、變劑。菌懸液的制備應注意以下幾點：l 新培養(yǎng)的細胞，生理狀態(tài)同步，處于旺盛的對數(shù)期；l 菌懸液細胞處于良好的分散狀態(tài)；l 菌懸液的濃度要適當；l 選擇合適的介質（生理鹽水或緩沖液）。（3） 誘變劑及其劑量的選擇mutagen誘變劑主要是指某些能引起生物細胞dna結構改變的物理或化學因子，其作用是提高變異頻率、擴大變異幅度、改變產(chǎn)量。常用的誘變劑mutagenl 物理誘變劑：紫外線、x射線、射線、快中子、離子束等l 化學誘變劑：堿基類似物：5-溴尿嘧啶（bu）烷化劑：甲基磺酸乙酯（ems）；亞硝基胍（ntg）移碼誘變劑：溴化乙錠、吖啶類化合物脫氨劑：亞硝酸羥化劑：羥胺金屬鹽類：氯化鋰、硫酸錳l

38、生物誘變劑：噬菌體、轉座子近期研究發(fā)現(xiàn)，較低劑量比較容易出現(xiàn)正突變菌株。（4） 誘變劑處理方式treatment method單一誘變劑處理復合誘變劑處理單一誘變劑處理可以減少菌種遺傳背景復雜化、菌落類型分化過多的弊病，使得篩選工作趨向簡單化。缺點是突變率比復合誘變劑處理要低，突變類型較少。復合誘變劑處理容易得到更多的突變類型，能導致較大的突變。（5） 突變株的分離與篩選isolation and screening微生物通過誘變處理，群體中產(chǎn)生各種類型的突變體，有正突變型、負突變型和穩(wěn)定型。抗性突變株或營養(yǎng)缺陷型突變株，常用選擇培養(yǎng)基進行篩選。高產(chǎn)突變株的篩選較難。3. 原生質體融合技術pr

39、otoplast fusion 概念：p17最后一行 原生質體融合可發(fā)生在：不同種屬的細胞之間、非生殖細胞之間、2個以上細胞融合原生質體融合的主要步驟：p18第3段原生質體融合進行基因重組的優(yōu)點： p18第4段4. 菌種保藏spawn preservation目的：使菌種的生長代謝活動盡可能降低，以減少其變異。手段：保持培養(yǎng)基營養(yǎng)成分在最低水平，缺氧、干燥、低溫、避光保藏方法：方法措施保存期優(yōu)缺點斜面冰箱保藏法斜面，4冰箱低溫保存3-6個月簡便；短期過渡沙土管保藏法沙土，干燥+真空+冰箱數(shù)年簡便，長期石蠟油封存法斜面+石蠟油，低溫缺氧數(shù)年簡便，長期真空干燥冷凍保藏法低溫+干燥+缺氧5-15年效

40、果好，廣泛適用；設備、要求嚴格液氮超低溫保藏法-19620年適用范圍廣，保存期最長；費用高微生物的營養(yǎng)微生物的營養(yǎng)（nutrition）是指微生物從環(huán)境獲得它們合成自身的細胞物質和提供機體進行各種生理活動所需的能量，以及形成代謝產(chǎn)物所需的營養(yǎng)物質的全過程。一、 微生物的營養(yǎng)類型根據(jù)碳源不同，分為自養(yǎng)微生物（autotrophic microorganism）和異養(yǎng)微生物（heterotrophic microorganism）；根據(jù)所需能量不同，分為光能營養(yǎng)（phototrophy）型和化能營養(yǎng)（chemotrophy）型。上述營養(yǎng)型的分類并非絕對，在自養(yǎng)和異養(yǎng)、光能型和化能型之間都存在中間過

41、渡類型，成為兼性營養(yǎng)型。比如：氫細菌可以利用氫和co2進行自養(yǎng)生活，也可以直接利用有機物進行異養(yǎng)生活；紅螺菌既可利用光能又可利用化能。微生物的營養(yǎng)類型之間沒有絕對的界限。二、 微生物的營養(yǎng)基質（一）碳源（carbon source）碳源主要是碳水化合物，如葡萄糖、糖蜜、蔗糖、淀粉等。葡萄糖：活性碳源，微生物可以直接吸收利用。淀粉：惰性碳源，先要經(jīng)過微生物酶水解形成單糖才能被吸收利用。常用的淀粉原料有玉米、土豆、麩皮、米糠等，近年來木薯在發(fā)酵工業(yè)上廣泛用于生產(chǎn)酒精、檸檬酸、谷氨酸、賴氨酸等。糖蜜是制糖生產(chǎn)的副產(chǎn)品，含有豐富的糖、含氮化合物、無機鹽和維生素等，物美價廉，是發(fā)酵工業(yè)常用的原料。近年來

42、，醇類、有機酸、石油烷烴也常被用作碳源來發(fā)酵生產(chǎn)一些特殊產(chǎn)品。比如用烷烴或脂肪酸發(fā)酵生產(chǎn)化工原料長鏈二元酸。（二）氮源（nitrogen source）有機氮源：花生餅、豆餅、棉籽餅、菜籽餅、玉米漿、酵母粉、牛肉膏、蛋白胨、魚粉、蠶蛹、酒糟、米糠等。提供蛋白質、多肽、游離氨基酸，少量糖類、脂肪、無機鹽、維生素和某些生長因子。無機氮源：銨鹽、硝酸鹽、尿素、氨水等，與有機氮源配合使用往往效果更好。分子態(tài)氮：固氮微生物。（三）無機元素（inorganic element）主要功能：（1）構成菌體的組成成分；（2）作為酶活性基團的組成部分；（3）調節(jié)微生物體內的ph和氧化還原電位；（4）某些自養(yǎng)菌的能

43、源。6種主要元素：c、h、o、n、p、s大量元素：c、h、o、n、p、s、k、mg、ca、fe微量元素：mn、co、cu、zn、ni等（四）生長因子（growth factor）微生物生長發(fā)育過程中不可缺少而需要量極少的一類特殊營養(yǎng)物質，包括維生素、氨基酸、核苷酸等，以輔酶或輔基的形式參與菌體生長發(fā)育過程的酶促反應。許多天然碳源、氮源，比如玉米漿、麩皮、麥糠等含有豐富的生長因子。三、 微生物的培養(yǎng)基（culture medium）培養(yǎng)基：人工配制的適于微生物生長繁殖或累積代謝產(chǎn)物的營養(yǎng)基質。（一）按物理狀態(tài)分類1.固體培養(yǎng)基（solid medium）麩皮、米糠、豆餅粉、花生餅粉 + 無機鹽

44、+ 水 白酒廠、釀造廠等生產(chǎn)用溶解的培養(yǎng)液 + 膠凝劑（瓊脂、明膠等） 實驗室用2.半固體培養(yǎng)基（semisolid medium）半固體培養(yǎng)基是在培養(yǎng)液中加入少量的凝固劑（如0.2%0.5%的瓊脂）。這種培養(yǎng)基常用于觀察細菌的運動、厭氧菌的分離和菌種鑒定等。3.液體培養(yǎng)基（liquid medium）把培養(yǎng)基成分溶解或懸浮在水中而進行液體培養(yǎng)的培養(yǎng)基。廣泛用于微生物的培養(yǎng)、研究和大規(guī)模生產(chǎn)。（二）按營養(yǎng)物質的來源分類天然培養(yǎng)基（complex medium）：動植物組織或微生物的浸出物、水解液等，如蛋白胨、牛肉膏、麥芽汁、馬鈴薯、玉米粉、米糠、豆餅粉等。合成培養(yǎng)基（synthetic med

45、ium）：由已知化學成分及數(shù)量的化學藥品配制而成，適合于定性定量的研究工作。半合成培養(yǎng)基（semi-synthetic medium）：在天然培養(yǎng)基的基礎上，適當添加一些化學藥品，補充無機鹽等不足，使之更能充分滿足微生物對營養(yǎng)的需要。在實驗室和生產(chǎn)中使用最多。（三）按用途分類基礎培養(yǎng)基（basic medium）含有細菌生長繁殖所需的基本營養(yǎng)物質，可供大多數(shù)細菌生長鑒別培養(yǎng)基（differential medium）在培養(yǎng)基中加入某種試劑或化學藥品，使培養(yǎng)后會發(fā)生某種變化，從而區(qū)別不同類型的微生物。例如：伊紅美藍乳糖培養(yǎng)基（emb培養(yǎng)基，eosin-methylene blue medium）

46、用于檢測水中的大腸桿菌污染。加富培養(yǎng)基（enriched medium）有利于某種微生物而不利于其它微生物生長而設計的培養(yǎng)基。選擇培養(yǎng)基（selected medium）在培養(yǎng)基中加入某種化學物質以抑制不需要菌的生長而保證需要菌的生長，從而在混雜的微生物中選出需要的菌種。配制培養(yǎng)基的原則：（1） 目的明確：實驗or生產(chǎn)？菌種的營養(yǎng)類型？（2） 營養(yǎng)協(xié)調：特別是c:n（3） 條件適宜：ph、滲透壓等（4） 經(jīng)濟節(jié)約：盡量選用容易獲得、價格低廉的原料作為培養(yǎng)基成分四、 微生物對營養(yǎng)物質的吸收l 被動吸收：又稱單純擴散，通過濾過、滲透、簡單擴散和易化擴散（需要載體）等幾種形式，將營養(yǎng)物質吸收進入細胞

47、內。這種吸收形式不需要消耗能量。一些分子量低的物質，如簡單多肽、各種離子、電解質和水等的吸收即為被動吸收。l 主動吸收：又稱主動運輸，必須通過機體消耗能量，依靠細胞載體蛋白來完成的一種逆濃度梯度的物質轉運形式。是細胞吸收營養(yǎng)物質的主要機制。被動吸收和主動吸收主要區(qū)別有兩點：主動運輸需要能量和載體，可以跨濃度梯度運輸。被動吸收有濾過、滲透、簡單擴散和易化擴散，除易化擴散外都不需要載體，但都是順濃度梯度運輸，即靠滲透壓來運輸，但都不消耗能量。五、 影響微生物生長發(fā)育的因素1.溫度微生物的生長實際上可以看做是生物體的一系列生物化學反應的有機組合，溫度是這些反應的必須條件。最適溫度是一個相對的概念，最

48、適生長溫度未必最適合微生物的生物合成，反之亦然。2.ph一般霉菌、酵母最適ph為35，細菌、放線菌6.58。不同生長階段要求ph值不同，過程中ph值會發(fā)生改變（變酸為主），改變的原因是3.通氣（aeration）與攪拌（agitation / stirring）根據(jù)微生物對氧的需求不同，可將其分為3類：l 好氧微生物：工業(yè)發(fā)酵中應用最多l(xiāng) 厭氧微生物：分子態(tài)氧對其有毒害作用，如丙酮-丁醇產(chǎn)生菌l 兼性微生物：酵母菌有氧生長繁殖，無氧發(fā)酵產(chǎn)生酒精發(fā)酵過程中通氣一般前少后多攪拌能打碎氣泡，增加氣液接觸面積，加速氧的溶解，提高空氣利用率，促進微生物的繁殖，但過度劇烈的攪拌會導致培養(yǎng)液產(chǎn)生大量氣泡，增

49、加污染雜菌的機會。4.基質濃度菌體生長速率是基質濃度的函數(shù)，常用monod方程來描述菌體生長速率與基質濃度的關系：微生物的培養(yǎng)微生物培養(yǎng)的目的：l 以菌體為產(chǎn)品（如酵母、scp的生產(chǎn)）l 以酶為產(chǎn)品（酶制劑生產(chǎn)）l 除去某物（污染治理）l 獲得代謝產(chǎn)物（酒精、檸檬酸、味精等的生產(chǎn)）l 特定的轉化反應（酒精轉化為醋的生產(chǎn)）一、 微生物的培養(yǎng)方法（一）固體培養(yǎng)設備簡單，適于小規(guī)模生產(chǎn)，但勞動強度大，產(chǎn)品質量不太穩(wěn)定。近年來固體培養(yǎng)有新的發(fā)展，如用于酒精發(fā)酵等大工業(yè)生產(chǎn)中的厚層通風發(fā)酵。（二）液體深層培養(yǎng)生產(chǎn)效率高，便于控制、適于機械化和自動化，是當前微生物發(fā)酵工業(yè)中的主要生產(chǎn)方式。（三）載體培養(yǎng)以

50、天然或合成多孔材料為微生物生長的載體。此法兼?zhèn)涔腆w與液體培養(yǎng)的優(yōu)點。載體可反復使用。從不同的角度也可將培養(yǎng)方法分為l 靜置培養(yǎng)適于厭氧發(fā)酵l 通氣培養(yǎng)適于好氧發(fā)酵l 分批培養(yǎng)（batch culture）l 連續(xù)培養(yǎng)l 半連續(xù)培養(yǎng)二、微生物的分批培養(yǎng)典型的微生物分批培養(yǎng)工藝流程圖（p30圖2-13）（一）種子擴大培養(yǎng)目的在于提高發(fā)酵罐的生產(chǎn)率。作為種子必須具備下列條件：生長繁殖快；接種量適宜；生理狀態(tài)穩(wěn)定；無雜菌；保持穩(wěn)定的生產(chǎn)能力。1.種子制備的工藝流程p31圖2-142.種子罐的級數(shù)指制備種子需逐級擴大培養(yǎng)的次數(shù)，根據(jù)種子的生長繁殖速度而定。谷氨酸等氨基酸發(fā)酵所用菌種是細菌，生長繁殖速度很

51、快，常采用一級種子罐擴大培養(yǎng)，稱二級發(fā)酵，即將種子接入種子罐中擴大培養(yǎng)后移入發(fā)酵罐；抗生素的生產(chǎn)中，放線菌的生長繁殖速度較慢，常采用二級種子擴大培養(yǎng)，也稱三級發(fā)酵。一般50m3以上的發(fā)酵罐都采用三級甚至四級發(fā)酵。3.種齡和接種量種齡是指種子罐中培養(yǎng)的菌體開始移入下一級種子罐或發(fā)酵罐時的培養(yǎng)時間。通常以對數(shù)生長期為宜。接種量是指移入的種子液體積和接種后培養(yǎng)液體積的比例。大多數(shù)抗生素發(fā)酵的最適接種量為7-15%，棒桿菌生產(chǎn)谷氨酸發(fā)酵中的接種量只需1%。采用較大的接種量可以縮短發(fā)酵周期，但也不宜過大，因為種子培養(yǎng)費時，且過多的代謝廢物會影響正常發(fā)酵。（二）微生物群體的生長規(guī)律微生物典型生長曲線p32

52、圖2-15微生物分批培養(yǎng)時的生長曲線，代表了微生物在新的適宜環(huán)境中生長繁殖直至衰老死亡全過程的動態(tài)變化，根據(jù)微生物生長繁殖速率不同，可將生長曲線大致分為延滯期、對數(shù)生長期、穩(wěn)定期和衰亡期4個階段。1. 延滯期（lag phase）接種后，細胞往往并不立即生長繁殖，其細胞數(shù)在一定時間內無明顯增加，這一階段稱為延滯期（又稱調整期或適應期）。發(fā)酵工業(yè)中縮短延滯期的措施：使用對數(shù)期微生物進行擴大培養(yǎng)；增大接種量；在種子培養(yǎng)基中加入發(fā)酵培養(yǎng)基的某些成分，使菌種加快對發(fā)酵過程的適應。2. 對數(shù)生長期（log phase）細胞數(shù)目呈幾何級數(shù)增加，也成為指數(shù)期。n2=n12n繁殖代數(shù)n=(lgn2-lgn1)

53、/lg2世代時間=(t2-t1)lg2/(lgn2-lgn1)生長速率r=n/(t2-t1)=1/對數(shù)期是發(fā)酵生產(chǎn)中種子的最佳種齡期。3. 穩(wěn)定期（stationary phase）細胞總數(shù)處于動態(tài)平衡，在數(shù)量上處于最高峰，為最佳收獲期，生長速率為零。許多發(fā)酵產(chǎn)品主要在此階段形成和積累。生產(chǎn)中常采用補充營養(yǎng)物質和調整ph等措施，延長穩(wěn)定器，提高代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量。4. 衰亡期（decline phase）營養(yǎng)成分耗盡，代謝產(chǎn)物大量積累，死亡的細胞數(shù)增多，活細胞數(shù)顯著下降，生長速率為負。大多數(shù)分批培養(yǎng)都在進入衰亡期前結束。三、微生物的連續(xù)培養(yǎng)（continuous culture）在微生物培養(yǎng)中不斷

54、放出培養(yǎng)液，同時補充等量的新鮮培養(yǎng)基，保持微生物恒定的培養(yǎng)條件，有效延長對數(shù)期到穩(wěn)定期的階段，使微生物的生長代謝處于恒定狀態(tài)，從而達到增加產(chǎn)量的目的。（一）單級連續(xù)培養(yǎng)1. 物料衡算0 + cxv fcx = vdcx/dt加入 生長 流出 積累式中 菌體的生長比速率，h-1； cx反應器中的菌體濃度，g/l； v反應器中培養(yǎng)液體積，l； f培養(yǎng)基流入流量或培養(yǎng)液流出流量，l/h。=f/v=d式中 d流量f與培養(yǎng)液體積之比，稱為稀釋率，表示單位體積培養(yǎng)液的流加量，量綱為時間-1，即培養(yǎng)液在反應器內平均停留時間的倒數(shù)。生長比速率是微生物的特性，在分批培養(yǎng)中無法控制，但在連續(xù)培養(yǎng)中只要通過改變流量

55、f，就可以改變稀釋率，從而改變菌體的生長比速率。對限制性基質進行物料衡算：fcs0 fcs cxv/yx/s = vdcs/dt流入 流出 生長消耗 積累式中 cs0加料中限制性基質濃度，g/l； cs反應器中的限制性基質濃度，g/l； yx/s對限制性基質的菌體得率系數(shù)，其定義為yx/s=cx/cs在穩(wěn)態(tài)時，cx=yx/s(cs0-cs)2. 過程分析找出系統(tǒng)內底物濃度、菌體濃度、產(chǎn)物濃度與系統(tǒng)操作參數(shù)的關系。monod方程：若以菌體為目的產(chǎn)物，則菌體的生產(chǎn)率為生產(chǎn)率p存在一個極大值，對應最大生產(chǎn)率的稀釋率dm稱為最適稀釋率。（二）具有細胞循環(huán)的單級連續(xù)培養(yǎng)（三）多級連續(xù)培養(yǎng)具有多個串聯(lián)培養(yǎng)

56、器（發(fā)酵罐）的連續(xù)反應系統(tǒng)。以獲取菌體或與菌體同步生產(chǎn)的代謝產(chǎn)物為目標時，只要用單級連續(xù)培養(yǎng)即可。若要獲取與菌體生長不同步的次級代謝產(chǎn)物，就應根據(jù)菌體和產(chǎn)物的生產(chǎn)規(guī)律，采用與之適應的多級培養(yǎng)裝置，第一級以培養(yǎng)菌體為主，后幾級則以生產(chǎn)代謝產(chǎn)物為主。如丙酮-丁醇生產(chǎn)。（四）連續(xù)培養(yǎng)的優(yōu)缺點優(yōu)點：產(chǎn)品質量和產(chǎn)量穩(wěn)定；縮短培養(yǎng)周期，提高設備利用率；減輕勞動強度，便于自控。缺點：較易污染雜菌；菌體變異退化的可能性較大；收率和產(chǎn)物濃度比分批式低；設備要求高。四、補料分批培養(yǎng) 又稱半分批培養(yǎng)或半連續(xù)培養(yǎng)，是指在分批培養(yǎng)中補加新鮮培養(yǎng)基，但不同時取出培養(yǎng)液的方法。介于分批培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)之間。可用于以下情況：（1） 發(fā)生底物抑制的過程。（2） 發(fā)生快速利用碳源而產(chǎn)生阻遏效應的過程。（3） 細胞高密度培養(yǎng)。（4） 前體補充滅菌技術為什么要滅菌？（雜菌污染的后果）1. 營養(yǎng)基質或產(chǎn)物被消耗損失，造成生產(chǎn)能力下降；2. 雜菌的代謝產(chǎn)物導致提取困難，收率降低，產(chǎn)品質量下降；3. 雜菌繁殖導致ph改變，造成生物反應異常；4. 噬菌體污染會使生產(chǎn)菌細胞裂解，導致發(fā)酵生產(chǎn)失敗。一、滅菌方法滅菌（sterilization）是指利用物理或化學方