1、納豆及納豆激酶研究進展王 建，李宏梁(陜西科技大學生命科學與工程學院，陜西西安 710021)摘 要：納豆是一種營養價值極高但口味怪異的功能性食品，具有溶血栓作用等多種保健功能，具有極大的應用前景，概括了納豆的營養保健功能，生產工藝及其優化以及納豆的風味改善研究；納豆激酶是從納豆中提取的一種堿性絲氨酸蛋白酶，具有高效的降血栓作用，而且易吸收，無副作用，有望被開發為新一代的口服抗血栓藥物，重點概括了納豆激酶的制備方法和分離純化方法，并對納豆激酶的開發應用進行了展望。關鍵詞：納豆；溶栓作用；風味；納豆激酶；分離純化中圖分類號： TS 252.51 文獻標識碼： A 文章編號：Advance in

2、natto and nattokinase researchWANG Jian, LI Hong-liang （College of Life Science Engineering, Shaanxi University of Science Technology, Xian 710021, Shaanxi, China）Abstracts: Natto have many sanitarian functions, but the taste was specially, had dissolves the thrombus function and so on, had the enor

3、mous application prospect, summarized sanitarian functions, the technique of production and optimized as well as the research of natto flavor improvement; Nattokinase is one kind of alkalinity serine proteinase which found in the natto, has highly catalyse fibrinolysis function, easy to absorb and i

4、t is safe for health, is hopeful to become a possible drug in the treatment of thrombi, mainly summarized the preparation method and the purification method of nattokinase, and forecast the attokinases development application prospect.Key Words: natto; catalyse fibrinolysis; flavor; nattokinase; pur

5、ification納豆是日本的傳統發酵食品，它是以大豆為原料經納豆芽孢桿菌(BacilluSnatto)發酵而成。納豆具有獨特的風味和粘性，與我國的傳統食品豆豉相似，但納豆是由純菌種發酵而成，時間較短，便于控制，其保健功能也遠遠高于豆豉。納豆菌是在20世紀中期被發現并分離出來的，它不僅具有分解蛋白質、碳水化合物、脂肪等大分子物質的性能，使發酵產品中富含氨基酸、有機酸、寡聚糖等多種易被人體吸收的成分，而且在納豆中還發現一些生理活性物質而使納豆具有多種保健功能，如溶血栓、抗腫瘤、降血壓、抗菌等作用，還可預防骨質疏松、提高蛋白質的消化率、抗氧化等。隨著社會的進步和科學的發展，納豆作為功能性食品逐漸受

6、到人們的重視 ，但因納豆昂貴的價格和具有濃重的氨臭味，難以被國內消費者所接受1，因而開發價格低廉且符合中國人口味的納豆產品具有廣闊的前景2。納豆激酶（Nattokinase，NK）是一種由納豆菌或納豆枯草桿菌產生的堿性絲氨酸蛋白酶，1987年由日本的須見洋行等人3首次發現納豆含有溶解血栓纖維蛋白的成分，并將其命名為納豆激酶。此后研究人員對納豆激酶從不同角度進行了研究，并取得了一定的進展。目前，對納豆激酶的性質、作用機制、分離純化等方面都已有了一定的了解，基因克隆、轉基因技術也被運用到納豆激酶的研究當中，并在某些菌株中得到有效表達4,5。許多國家現已相繼推出以納豆激酶為原料的產品，對納豆及納豆激

7、酶的研究方興未艾。1納豆研究進展1.1 納豆的營養價值 納豆是大豆煮熟后經接菌發酵而制成的功能食品，它除了保持原料大豆的營養外，有些成分的含量比煮熟的大豆還要高，如蛋白質、纖維、鈣、鐵、鉀、維生素B1、維生素B2等，特別是鈣、鐵、鉀等礦物質的含量甚至超過了雞蛋。如果將納豆與雞蛋和牛肉作比較，100g納豆的蛋白質含量相當于3個雞蛋或80g牛肉6。納豆中氨基酸含量也非常豐富，這是由于納豆在發酵過程中產生多種維生素和酶類，如淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纖維酶、納豆激酶、溶菌酶、谷氨酸轉肽酶等，由于酶的作用使蛋白質及其它營養物質發生分解，因此納豆的消化率(85%)比煮熟的大豆(68%)還要高，營養更豐富，

8、也更容易吸收7。1.2 納豆的保健功能1.2.1 溶栓作用1987年，須見洋行等人通過試驗證明納豆激酶具有強烈的溶栓作用，每克濕納豆含有的納豆激酶的酶活相當于現在臨床使用的尿激酶1600IU甚至更高。此外，經研究證明納豆激酶不僅溶栓效果好，還具有許多其它優點，它可經口服被腸薄膜吸收、分子量小、無抗原性、無毒副作用、長期服用安全可靠、在體內半衰期長（約68h）、價格低廉、且屬于食源性激酶。因此，較現在臨床使用的一些溶血栓藥物如尿激酶、蚓激酶、鏈激酶和組織型纖溶酶原激活劑等更具優勢8。1.2.2 降血壓納豆周圍的黏性物質中含有一種血管緊張肽轉化酶抑制劑（ACE Inhibitor），具有降血壓的功

9、能9。1977年，日本帝國女子大學營養學教授林（林右市）的研究小組進行了納豆預防高血壓的實驗，他們分別用納豆和大豆喂養有遺傳性高血壓的小白鼠，結果發現，食用大豆的鼠血壓逐漸升高，4個月內平均波動達到0.033MPa，而食用納豆的鼠血壓4個月內波動最高值僅為0.027MPa，從而證實納豆具有降血壓的功能10。1.2.3 抗氧化作用經研究證實納豆比未經發酵的大豆具有更強的抗氧化作用，納豆抑制脂肪氧化的能力達91%，而大豆僅為13%。這是因為納豆中含有豐富的異黃酮、卵磷脂、超氧化物歧化酶(SOD)、不飽和脂肪酸和維生素E等抗氧化成分，因此經常食用可有效降低血脂、膽固醇及清除腦組織細胞中的過氧化脂質色

10、素。另外，納豆對由過氧化物(Cumene Hydroperoxide)所引起的細胞傷害也有療效。1.2.4 防止骨質疏松納豆菌是目前發現的唯一一種可以產生維生素K2的細菌，其發酵大豆可產生大量的維生素K2（100g納豆中約含有1000g的維生素K2）。維生素K2可促進骨蛋白質（Osteocalcin）的生成，這種蛋白質可與鈣共同生成骨質，增加骨骼的密度，每天食用l0g納豆就可提供機體足夠的維生素K2。須見洋行等研究證實，進食100g納豆4小時后血液中的維生素K2的濃度最高可達原來的54倍。1.2.5 抗菌作用納豆菌發酵大豆可以產生多種抗菌素，如桿菌肽、多黏菌素、2，6-吡啶二羧酸等，這些物質對

11、痢疾桿菌、原發性大腸桿菌（0-157、0-111、0-144）、傷寒菌以及沙門氏菌等都具有強烈的抑制作用。須見教授對納豆的抗菌功能作了研究，結果表明將納豆加進0-157病菌4天后，病菌全部被抑制而死亡11 。此外，國內學者鐘青萍等人研究發現納豆菌具有廣譜抗菌作用，特別是對細菌、酵母菌和霉菌等常見食品污染菌有較好的拮抗作用，對大腸桿菌也同樣有效12。 1.2.6 調整腸道功能納豆菌是一種對人體無病原性的安全菌株，食用后在腸道中可以生長，并能生存幾周，分泌各種酶和維生素，促進小腸粘膜細胞的增殖。另外，納豆菌還可抑制腸道內有害細菌的生長，尤其對痢疾志賀氏菌和傷寒沙門氏菌的抑制效果特別明顯，優于乳酸菌

12、；同時納豆中的纖維素類物質可以與寡糖耦合，從而促進雙歧桿菌、乳酸菌等有益菌的增殖，對腸道菌群的微生態平衡起重要的調節作用，從而保證腸功能的正常。1.2.7 抗腫瘤作用 國外研究發現，納豆菌可有效地抑制或殺滅癌細胞，并可刺激機體免疫系統誘發產生干擾素，起到抑制腫瘤的功效。1967年，日本金澤大學藥學院的龜田教授報告了納豆抗癌動物實驗的結果，他將Ehrlich肉瘤分別移植到小白鼠的左右足皮下，23天后，在右足部注入納豆菌，11天后研究發現右足沒有癌細胞生成，而左足有癌細胞生長，從而證實納豆菌具有抑制癌細胞生長的作用13。1.2.8 防治糖尿病日本學者研究發現納豆不僅能減緩小腸對糖份的吸收，還能防止

13、進食后血糖的迅速升高14。 納豆中含有的氨基酸誘導體的有效成份能使小腸中的-葡萄糖苷酶的活力下降，從而抑制攝入的淀粉和蔗糖轉化為單糖（小腸只能吸收單糖），起到防治糖尿病的作用。1.3 納豆生產工藝及優化1.3.1 納豆生產工藝納豆是以大豆為原料，經納豆芽抱桿菌(BacilluSnatto)發酵而成，具有獨特的風味和粘性。其一般生產工藝如下15,16：大豆精選清洗浸泡蒸煮冷卻接種發酵后熟調味包裝（1）納豆桿菌菌種液體振蕩培養，OD6001.6 后放入冰箱備用。（2）選用顆粒飽滿，蛋白質含量高的市售大豆。（3）用大豆三倍的水量浸泡一晝夜(室溫15 )，瀝水。（4）加入3%的食鹽和蔗糖，高壓鍋內12

14、1 下蒸煮20 min，以豆子很容易被用手捏碎為宜，冷卻至55 以下。（5）在無菌條件下，將事先活化好的菌種噴灑于大豆中攪拌均勻，鋪成35 cm 的薄層，恒溫培養發酵。（6）發酵結束，將納豆放入4 冰箱中老化24 h。1.3.2 納豆發酵工藝優化郭德軍等人17 通過正交試驗和產品感官評定，得到的納豆生產優化工藝是：菌種為B-1，大豆浸泡時間為14 h，蒸煮時間20 min（121），接種量4%，最佳發酵溫度為37，最佳發酵時間為24 h，NaCl 3%，蔗糖2%，在4下后熟24 h。齊鳳蘭等人15優化的納豆生產工藝是：種齡為18h，大豆浸泡時間為14h、蒸煮時間45min(121)、最佳發酵溫

15、度為37、最佳發酵時間為18h；納豆生產的促生長因子為玉米漿3%、NaCl0.5%、無水葡萄糖2%；在4下后熟24 h。熊迎新等人18以實驗室優選的枯草桿菌為出發菌株，研究各種因素對菌株產酶的影響。通過單因素實驗，確定固體淺盤發酵的最佳工藝條件：種子液(酵母粉2.0%，麥芽糖0.5%，Na2HPO40.3%，KH2PO40.03%，MgSO40.05%)于37、200r/min恒溫振蕩6 h，按10%的量接種于煮熟大豆，37培養24 h后用生理鹽水浸提，離心，即得納豆激酶供試品液。優化后，1 g大豆可發酵出納豆激酶1931IU(即1931IU/g)，而發酵工藝優化前只能達到1204IU/g。納

16、豆生產工藝的優化是以感官和納豆激酶酶活為評定標準，以納豆激酶酶活為主，但是納豆激酶酶活的測定存在制作成本高、費時等缺點，若能將電子鼻、質構儀等高新儀器應用于納豆感官的評定，在今后納豆生產工藝優化及納豆產業化標準制定方面將具有廣闊的應用前景。 1.3.3 納豆口味改善工藝 隨著人們生活水平的不斷提高，人們對食品的要求己經不僅僅是能夠吃飽，更重要的是吃好，吃出健康。在這種前提下，人們不僅注重食品的可口性，更注重食品的營養性和保健性。納豆正是這種集營養性與保健性于一身的理想食品，但納豆本身有一種臭苦味，較難為我國人民接，為了使納豆為更多國人所接受，我國學者正進行口味方面的改進。關茵等人19從納豆發酵

17、的工藝研究入手，對原料浸泡比例、蒸煮溫度和時間、發酵時間、接菌量等進行優化。研究表明，黃豆與水的比例為1:7，蒸煮溫度100，蒸煮時間70min，發酵時間20h，接菌量為14%時，制作的納豆所帶有的氨味最少，產品的各項感官指標均良好。王剛20考察了發酵條件對納豆口味的影響，主要考察了混合菌種發酵和不同培養基添加物對發酵口味的影響，如培養時間、投料比、接種量等因素對發酵口味的影響，同時考察了不同口味調味料對納豆產品口味掩蔽的作用。結果表明，利用有些菌株在發酵過程中能夠產生香味物質，比如乳酸菌利用山碴果珍粉、蜂蜜能夠產生口味純正、柔和的香味，試驗中通過接種不同的菌種，通過兩次發酵，調節納豆的口味，

18、得到較為理想的結果：即接種量為4%、食鹽的添加量為4%、蔗糖的添加量為8%、山碴果珍粉0.2%、蜂蜜0.1%、發酵培養24h，納豆的口味較好，沒有氨味，而且黏液較多?？谖吨刑鸬某煞植皇呛艽?，結果較好。適合中國人的口味；在發酵調節的基礎上，對納豆產品的風味進行進一步的調節，主要設計了辛辣、酸辣等調味料，將通過發酵改善氣味的納豆，添加不同口味的調味料，使納豆原有的不愉快氣味基本得到了掩蓋。劉樹興等人21通過在納豆食品中加入甜面醬和芝麻醬這兩種基礎調味料，配以多種輔料，可制成具有良好風味且使用方便的復合調味醬包。結果表明，納豆復合調味醬的最佳配方為甜面醬與芝麻醬配比為3:4，花椒粉、食鹽、白砂糖添加

19、量分別為2%，1.5%，14%。添加5g/kg牛肉香精可增加其風味，添加5g/kg山梨酸鉀，于0.1Mpa，121條件下滅菌處理8min，復合調味醬包可長期保存。1.4 納豆前景展望目前，心腦血管栓塞的患者日益增多，特別是處于潛伏期的患者增多，很多人處于亞健康的狀態?，F在的藥品在實際應用中它們都具有一定的局限性，生產成本高、價格昂貴、毒性強、副作用大、體內半衰期短等。而開發納豆和納豆激酶制品將可以解決這一難題。納豆通過固體發酵制備，以大豆為原料，成本較低，較為容易被廣大人民群眾接受，特別是處于潛伏期的患者和健康人群所接受，并且我國大豆資源豐富，通過對納豆這種深加工產品的開發，轉化我國的大豆資源

20、，提高產品的附加值，對人民的生活水平和生活質量的提高有較為深遠的意義。2 納豆激酶的研究進展目前，關于納豆激酶的結構、理化性質、生物學功能溶栓機制等方面國內外學者已經進行了大量的研究，在這方面闡釋的已經比較清楚，目前的研究重點主要集中在納豆激酶的制備和分離純化。2.1納豆激酶的制備研究 制備納豆激酶一般有兩種方式，即固體淺盤發酵和液體深層發酵。目前我國許多高校和科研機構都對納豆激酶發酵條件進行了研究。梁淑娃22通過研究后認為，深層發酵的最佳培養基配方為葡萄糖2%，大豆蛋白胨1%，Na2HPO4 0.6%，NaH2PO4 0.1%，MgSO4 0.05%，CaCl2 0.02%，最佳培養基起始p

21、H值為7.0，接種量為3%，最適發酵溫度為35。在此條件下，500mL搖瓶、50L罐和500L罐發酵酶活最高分別達到1903IU/mL、2210IU/mL和1934IU/mL。祖國仁等23對納豆菌固體發酵條件進行了研究，確定最佳條件為浸泡后的大豆在121高壓蒸煮30min，納豆菌接種量2%，于37發酵24h，再置于4冰柜后熟24h。成熟的納豆產品納豆激酶活力可達670.15IU/g濕納豆。楊慧寧等24以海參為培養基進行液態發酵3d，酶活力可達到245.75IU/mL。黃占旺等25研究了采用米曲霉、納豆芽孢桿菌混合發酵技術制作納豆的新工藝。試驗結果表明：米曲霉無鹽發酵適宜溫度60，發酵時間36h

22、42h，用納豆芽孢桿菌進行二次發酵最佳條件為發酵溫度36，接種量1%，發酵時間30h，成品納豆中納豆激酶活性314.30IU/g，氨基酸態氮含量0.846%。胡升等26利用響應面法對納豆激酶的液體發酵條件進行了優化，使發酵液中納豆激酶濃度從1005.73IU/mL提高到1314.48IU/mL。各位研究者所得出的結論大不相同，這可能是由于所選擇的菌株不同或檢測納豆激酶活力方法不同等造成的。目前對納豆激酶發酵的研究，大多停留在實室搖床階段，對影響納豆激酶產率的一些重要因素，如誘導、阻遏等探討不深，因此對于納豆激酶的代謝途徑以及調控機制等方面還有待進一步研究。2.2 納豆激酶的分離提取納豆激酶是胞

23、外酶，可以利用納豆菌的發酵液提取。方法如下：將納豆菌的發酵液離心，取上清液，用硫酸銨或乙醇沉淀，再經離心以除去發酵上清液中的粘性物質，主要是果糖（fructose）和多聚谷氨酸(polyglutamine)。離心后取沉淀，溶于緩沖液中便為粗酶液。粗酶液經超濾脫鹽、離子交換、柱層析、透析，最后冷凍干燥即得酶干粉。若以納豆為材料提取NK，只需在上述步驟前增加一步，先用生理鹽水浸提，其他相同。劉俊果等27以順-2-乙基己基磺酸鈉/異辛烷反膠團體系為有機相對發酵液中的納豆激酶進行萃取，經過一次萃取循環，蛋白質回收率約為33.25%，酶活力回收率達到80.2%。劉柳等28研究得出較好分離純化方案為樣品依

24、次經過DEAE-Sepharose FastFlow陰離子層析、CM-Sepha-roseFastFlow陽離子層析和Penpyl-SepharoseCl-4B疏水層析柱，納豆激酶最終的純化倍數達到32.2，回收率為13.2%。陸瑾等29利用金屬鏊合親和雙水相分配技術對納豆激酶的分離純化進行了研究，結果表明，雙聚合物系統比聚合物/無機鹽系統更有利于納豆激酶親和分配；pH值和親和配基加入量是影響分配的關鍵因素。高大海等30采用發酵液離心除菌, 20%60%飽和度的硫酸銨沉淀，Superdex 75凝膠過濾層析和SP Sepharose FastFlow離子交換層析對活性組分進行分離提純，最終純化

25、倍數和酶活回收率分別為8.4和49%。許芳等31通過超聲波破碎、硫酸銨分級沉淀、SephadexG-100柱層析以及冷凍干燥等步驟進行分離純化，得到電泳純的納豆激酶。陸利霞等32通過硫酸銨分級鹽析法和PhenylSepharose疏水柱層析進行分離純化，用SDS-PAGE電泳驗證為電泳純。綜上所述，目前納豆激酶的分離純化大數是使用離心、鹽析、過濾、層析等常規手段，雖然也可以獲得電泳純的產品，但是由于純化的步驟多、時間長，從而導致納豆激酶的回收率普遍不高，酶失活也比較嚴重。少數研究者也采用了一些新的分離純化方法，如反膠團萃取、雙水相萃取、超濾等，取得了一些成果但并不完善。2.3 納豆激酶的前景展

26、望納豆激酶產品在世界各國已開始積極開發，日本、韓國、朝鮮等許多國家已研制出多種以納豆激酶為主要成分的產品，大多由納豆激酶與其他種類的酶制劑復合而成，如菠蘿蛋白酶、纖維素酶、淀粉酶等，或添加甘油、蜂蠟及卵磷脂、DHA、SOD等營養物質，制成粉劑、片劑、軟硬膠囊、口服液或保健食品，但關于臨床注射用的納豆激酶產品還未見報道。為了進一步提高納豆激酶活力，各國科研人員正通過加強基因工程改良納豆菌株，生產工藝優化等研究，試圖將納豆激酶的生產引入大規模工業化生產33。在我國，由吉林省雁鳴湖大豆生物技術科技有限責任公司出品的納豆已經上市。黑龍江省應用微生物研究所已進行了納豆激酶制劑的生產工藝中試研究，納豆激酶

27、制劑-恩開膠囊也已進入中試階段，納豆激酶的口服藥劑也有多家投產上市，如草仙藥業的凈血酶納豆膠囊、燕京啤酒公司的納豆膠囊、天津寶恒生物的蛋白硒納豆膠囊等34。參考文獻：1 陳麗花, 陳有容. 功能性食品納豆的研制J. 上海水產大學學報, 2001, 10(2):187- 189.2 梁劍光. 納豆激酶發酵控制及其酶學特性研究D. 南京工業大學, 2003.3 SumiH, Hamada H, Tsushima Hetal.A novel fibrinolytic enzyme(nattokinase) in the vegetable cheesenatto, atypical and popu

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