1、菌種的保藏和防止衰退的措施菌種保藏的要點：選擇適宜的培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度和菌齡，以便得到健壯的細胞或抱子；保 存于低溫、隔氧、干燥、避光的環(huán)境中，盡量降低或停止微生物的代謝活動， 減慢或停止生長繁殖；不被雜菌污染，在較長時期內(nèi)保持著生活能力。方法和原理定期移植法：將菌種接種于所要求的培養(yǎng)基上，在最適溫度中培養(yǎng)，至靜止期或產(chǎn)生 成熟的抱子時，置入 5C的冰箱（或冰庫）保存。在培養(yǎng)和保存的過程中，由 于代謝產(chǎn)物的累積而改變了原菌的生活條件，結(jié)果菌落群體中的個體就不斷 衰老和死亡，因此每515天或14個月重新移植一次，具體間隔時間因種 而異。凡能人工培養(yǎng)的微生物都可用此法保存。此法不需特殊設(shè)備，但煩瑣，

2、 費時，而且經(jīng)常移植容易引起菌種退化。礦油封藏法：將化學(xué)純的液體石蠟（礦油）經(jīng)高壓蒸氣滅菌，放在 40C恒溫箱中蒸發(fā)其 中的水分，然後注入斜面培養(yǎng)物中，使液面高出斜面約1厘米。將試管直立,放在1520C室溫中保存。由于在斜面培養(yǎng)物上覆蓋一層液體，既能隔絕空 氣，又能防止培養(yǎng)基因水分蒸發(fā)而干燥，可以延長菌種保藏的時間。但注入 的液體必須不與培養(yǎng)基混溶、對菌種無毒，不易被利用和揮發(fā)。此法適用于 酵母菌、芽抱桿菌；不適用于固氮菌、乳酸桿菌、明串珠菌、法門氏菌和毛 黴目中的大多數(shù)屬種。此法簡便易行，但必須注意防火和污染。沙土管法：將沙或土過篩、烘干、裝管、滅菌、然後將菌種制成抱子懸液滴入其中 混勻，放

3、到盛氯化鈣的干燥器里吸除水分，干燥後保存或用火焰封管後保存。 吸附在干燥沙土上的抱子因缺水而處于休眠狀態(tài)，可保存較長時期。此法適 用于芽抱桿菌、梭狀芽抱桿菌、放線菌、鐮刀菌等。麩皮法：將麩皮制成培養(yǎng)基，培養(yǎng)要保存的菌種，待生長良好後，置干燥器中保 存。這是根據(jù)中國釀造酒、醋、醬時制麴的經(jīng)驗所采用的一種保藏方法，適 用于谷物微生物區(qū)系中的種類。L 干燥法：又稱液體干燥法或真空干燥法，用含3%谷氨酸鈉的0. 1M磷酸緩沖溶液(pH7.0)做分散媒，將待保藏的微生物制成高濃度的細胞懸液，滴入無菌安瓿 瓶中，每管0.05毫升；將安瓿瓶固定在多歧管上，并以水浴保持安瓿瓶內(nèi)樣品溫 度為10C,在13.31

4、.3帕的真空度下干燥，火焰封管保存。此法不經(jīng)凍結(jié)， 用真實泵迅速抽乾，可避免菌種的凍傷或死亡。廣泛應(yīng)用于病毒、噬菌體、 細菌、酵母菌、藍澡、原生動物等。梭氏法：將容有1滴細胞懸液的小管，置于盛有氫氧化鉀或五氧化二磷吸水劑的 大試管中，用真空泵抽至 1.3帕?xí)r，將大試管密封保存。這是為減少細胞死 亡率而采取的一種不經(jīng)凍結(jié)、緩慢脫水的干燥保藏法，適用于多種細菌、真 菌。冷凍真空干燥法：將細胞懸液每0.10.2毫升注入一無菌安瓿瓶，于 -40C預(yù)凍1小時， 再于-2030C、真空度為13.3帕的條件下脫水。在脫水過程後期，安瓿瓶 外溫度可逐漸升至25C。脫水後的樣品含水量應(yīng)在3%以下。最後，將安瓿瓶

5、保持真空度1.3帕，用火焰溶封，置10C保存。為防止細胞在凍結(jié)和脫水過 程中損傷或死亡，要用保護劑制備細胞懸液。保護劑有脫脂牛奶、血清、10%蔗糖或葡萄糖溶液等，其作用是通過氧和離子鍵對水和細胞所產(chǎn)生的親合力 來穩(wěn)定細胞成分的構(gòu)型。此法適用于病毒、衣原體、枝原體、細菌、放線菌、酵母菌、絲狀真菌等的長期保存，是當前保藏菌種的一個重要方法。但是， 鹽桿菌、發(fā)光桿菌、黏桿菌、阿舒囊黴、多囊黴、擔子菌中的大多數(shù)屬種不 適用于此法保存。液態(tài)氮超低溫凍結(jié)法：用甘油或二甲亞(DMSO作保護劑制備細胞懸液，分裝入無菌安瓿瓶，每 管0.2毫升，在控制溫度下降速率為1C/分鐘的條件下預(yù)凍至-40C，然後立即放入液

6、氮生物貯存罐中氣相(-150C)保存。恢復(fù)培養(yǎng)時，先直接侵入38 C水浴中解凍510分鐘，再種植于適宜培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)。 這是根據(jù)在低于-130C 時一切生化反應(yīng)處于停止狀態(tài)、微生物也不能進行代謝活動而設(shè)計的凍結(jié) 法。為避免凍死、凍傷和細胞內(nèi)形成大量冰晶，用保護劑制備懸液并控制預(yù) 凍時的冷卻速率和解凍時融化速率。微生物的大多數(shù)屬種適于慢速凍結(jié)和快 速解凍。此法適用于病毒、枝原體、各種細菌、放線菌、酵母菌、絲狀真菌、藍澡等。分工和機構(gòu)：菌種保藏可按微生物各分支學(xué)科的專業(yè)性質(zhì)分為普通、工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī) 學(xué)、獸醫(yī)、抗生素等保藏管理中心。此外，也可按微生物類群進行分工，如 沙門氏菌、弧菌、根瘤菌、乳酸桿菌、

7、放線菌、酵母菌、絲狀真菌、藻類等 保藏中心。目前，世界上約有550個菌種保藏機構(gòu)。其中著名的有美國典型菌種保 藏中心（簡稱ATCC馬里蘭）；1925年建立，是世界上最大的、保存微生物種 類和數(shù)量最多的機構(gòu)，保存病毒、衣原體、細菌、放線菌、酵母菌、真菌、藻類、原生動物等約29000株，都是典型株；荷蘭真菌菌種保藏中心（簡稱CBS得福特）：1904年建立，保存酵母菌、絲狀真菌約 8400種、18000株，大多是模式株；英國全 國菌種保藏中心（簡稱NCTC倫敦）：保存醫(yī)用和獸醫(yī)用病原微生物約2740株;英聯(lián)邦真菌研究所（簡稱CMI,里郡）：保存真菌模式株、生理生化和有機合成 等菌種2763種，8000株；日本大阪發(fā)酵研究所（簡稱IFO,大阪）：保存普通 和工業(yè)微生物菌種約 9000株；美國農(nóng)業(yè)部北方利用研究開發(fā)部（北方地區(qū)研 究室，簡稱NRRL伊利諾伊州皮契里亞）：收藏農(nóng)業(yè)、工業(yè)、微生物分類學(xué)所 涉及的菌種，包括細菌 5000株，絲狀真菌1700株、酵母菌6000株。1970年8月在墨西哥城舉行的第 10屆國際微生物學(xué)代表大會上成立了 世界菌種保藏聯(lián)合會（簡稱WFCC）同時確定澳大利亞昆士蘭大學(xué)微生物系為 世界資料中心。這個中心用電子計算機儲存全世界各菌種保藏機構(gòu)的有關(guān)情 報和資料，1972年出版世界菌種保藏名錄。中國于1979年成立了中國