1、昆蟲分子生物學課程論文學院 :植物保護學院課程 :昆蟲分子生物學學號 :姓名 :任課教師 :職稱 :教授成績:2015 年 8 月 29 日PCR技術在微生物鑒定中的應用摘要隨著科學技術的發展和突破，PCR技術已在多個領域得到廣泛地應用，特別是在微生物檢測中的應用。細菌16S rDNA 測序鑒定需進行DNA擴增、測序和分析，其設備條件和實驗成本比傳統的表型鑒定更高，從鑒定的準確率來看，其具有的優勢毋庸置疑。同時，隨著微生物檢測技術的不斷發展,BOX-PCR技術在微生物的多樣性研究中也已得到應用。使用真菌ITS 區域序列通用引物PCR擴增和 DNA序列測定的方法，簡便快速、成本低穩定性好、結果可

2、靠，適合實驗室常規使用，可用于常見的和疑難真菌菌種快速鑒定。關鍵詞PCR ； 16S rDNA； BOX-PCR； ITS ；細菌；真菌PCR(polymerase chain reaction, PCR)即聚合酶鏈式反應，它是一種體外酶促合成擴增特定 DNA片段的方法， 1985 年美國 Karray 等學者首創了 PCR技術并由美國 Cetus 公司開發研制 1 。隨著科學技術的發展和突破， PCR技術已在多個領域得到廣泛地應用，如微生物檢測、獸醫學、水產養殖、環境科學、食品安全等領域，包括基因的克隆、修飾、改建、構建cDNA 文庫、遺傳病傳染病的診斷、法醫學鑒定、物種起源、生物進化分析、

3、流行病學調查等。由于該技術具有較強的靈敏度、準確度和特異性，又能快速進行檢測，因而其應用領域也在不斷延伸 2-3 。隨著 PCR技術的不斷發展， 在常規 PCR技術的基礎上又衍生出了許多技術，如多重 PCR（mutiplex ，PCR）技術 4 、實時熒光定量 PCR（real-timefluorescent quantitative PCR, FQ-PCR）技術 5 、單分子 PCR技術 6 等。1 PCR 技術原理PCR技術是根據待擴增的已知 DNA片段序列，人工合成與該 DNA 2 條鏈末端互補的 2 段寡核苷酸，引物在體外將待檢 DNA序列模板在酶促作用下進行擴增。 PCR的整個技術過

4、程經若干個循環組成，一個循環包括連續的 3 個步驟：第 1 步是高溫條件下的 DNA模板變性，即模板 DNA在 9394的條件下變性解鏈；第 2 步是退火，即人工合成的 2 個寡核苷酸引物與模板 DNA鏈 3端經降溫至 55退火；第 3 步是延伸，即在 4 種 dNTP底物同時存在的情況下， 借助 TaqDNA聚合酶的作用， 引物鏈將沿著5 3方向延伸與模板互補的新鏈 7 。經過這個循環后合成了新鏈可將其作為DNA模板繼續反應，由此循環進行。循環進程中擴增產物的量，以指數級方式增加，一般單一拷貝的基因循環2530 次， DNA可擴增l00萬200 萬倍 1 。2 PCR 技術在細菌鑒定中的應用

5、細菌檢測包括傳統的形態學檢查、分離培養、生化鑒定、免疫分析等多種方法，其中細菌的分離培養最為關鍵，但對苛養菌及生長緩慢的細菌分離培養很棘手。近年來各種基因診斷技術在細菌檢測中不斷開發利用，尤其是基于聚合酶鏈反應（PCR）的基因診斷技術發揮著越來越重要的作用。2.1 16S rDNA在細菌鑒定中的應用16S rDNA是編碼原核生物16S rRNA的基因 , 長度約 1500bp, 存在于所有細菌、衣原體、支原體、立克次體、螺旋體和放線菌等原核生物的基因組中，由多個保守區（conservedregion ）和與之相間的多個可變區 (variable region) 組成保守區，為所有細菌共有，細菌

6、之間無顯著差異 8 ；可變區在不同細菌之間存在一定的差異，具有細菌屬或種特異性。PCR擴增 16S rDNA包含兩層含義 : 在保守區設計 PCR通用引物，理論上可將存在于待測標本中的各種細菌都擴增出來；若選擇可變區設計PCR特異性引物，則可將標本中的細菌鑒定到屬種乃至菌株水平，因此16S rDNA已成為細菌鑒別與分類研究中較理想的靶序列9。細菌 16S rDNA 中含有個可變區，命名為V1-V9 區，確定某個可變區內具有細菌種特異性的序列就可能獲得細菌實驗室診斷的有用靶點，除V2、V3、V4 區稍長外，其他各高變區序列都很短，沒有哪個高變區能區分所有細菌10 。目前，已有很多基于 16S r

7、DNA全長或部分序列的應用研究：王永智等在對20 余種致病菌進行 16S rDNA多序列比對的基礎上，設計擴增細菌 16S rDNA 的熒光定量 PCR通用引物，檢測血液細菌污染模擬標本11；應燕玲等通過 13 種標準菌株建立了一種基于16S rDNA 全長特異性擴增和測序的方法，利用與 GeneBank 數據庫比對，成功鑒定出血制品污染的11 種未知細菌 12 ；美國 Maastricht大學醫學中心研究的實時定量16S rDNA PCR擴增系統，利用通用探針外加種或屬特異性探針的多探針法，能在 2h 內對血液感染中常見的幾種細菌，包括革蘭陰性的假單胞菌、大腸埃希菌及革蘭陽性的葡萄球菌、腸球

8、菌、鏈球菌等進行快速鑒定13 。細菌 16S rDNA測序鑒定需進行 DNA擴增、測序和分析，其設備條件和實驗成本比傳統的表型鑒定更高，但不能對所有細菌都鑒定至種的水平。從鑒定的準確率來看，建立在細菌分離株基礎上的16S rDNA擴增及測序具有的優勢毋庸置疑，因此被視為細菌鑒定與分類的“金標準”。2.2 BOX-PCR 技術在細菌鑒定中的應用BOX-PCR指紋圖譜分析技術 , 是根據 BOX插入因子設計引物 , 擴增微生物基因組DNA的重復性片段 , 補充散布的重復序列 , 使不同大小的 DNA片段與位于這些片段之間的序列得到擴增 , 最后經瓊脂糖凝膠電泳檢測其多態性的一種微生物鑒定方法14

9、。隨著微生物檢測技術的不斷發展 ,BOX-PCR技術在微生物的多樣性研究中已得到應用。在細菌的基因組中已發現存在10 種以上可用于基因指紋分析鑒定的短重復序列，其中以 REP和 ERIC應用較多，后來在細菌重復序列中發現了BOX插入因子，大小為154 bp ，由保守性不同的boxA(57bp) 、box B(43bp) 和 boxC(50bp) 等亞單位組成，其中只有box A 存在細菌菌株、種、屬水平的分布差異及進化過程中表現出多拷貝和高保守性，Versalovic等根據 BOX片段中的 box A 亞單位設計寡核苷酸引物，使重復序列之間的不同基因區域得以選擇性擴增，得到大小不等的 DNA擴

10、增片段，進而對 PCR產物進行電泳圖譜分析獲得分類學信息 15 。BOX-PCR指紋圖譜分析技術與 REP-PCR和 ERIC-PCR技術相似，但操作更為簡單快捷，容易獲得較為豐富的擴增條帶，不需要菌株、種的特異性DNA探針，只需要一條單引物就能夠完成大量菌株的 DNA多態性分析，擴增的結果可直接進行瓊脂糖電泳檢測。BOX-PCR基因指紋分析獲得的分類信息來自于完整的基因組，能在種及菌株水平上反映出細菌的基因型、系統發育和分類關系，分辨率高、穩定、可重復性高，是一種快速而有效的DNA指紋技術，因此可作為檢測細菌菌株多樣性的方法。3 PCR 技術在真菌鑒定中的應用真菌 DNA的堿基組成遺傳穩定

11、, 不易受環境影響 , 而且在生活史任何階段均可獲得。 ITS區域在不同菌株間存在豐富的變異, 對 ITS 區進行序列分析不僅豐富了真核生物核糖體基因 ITS 的序列信息 , 為病原菌的分類鑒定及系統發育等研究提供了十分重要的資料和依據,而且為建立病原菌的分子疫病的快速診斷技術奠定了基礎, 對植物病害的防治具有一定意義抗藥性機理的研究是抗藥性治理的基礎。核糖體DNA是由核糖體基因及與之相鄰的間隔區組成, 其基因組序列從5到3依次為 : 外部轉錄間隔區(external transcribed spacer, ETS)、18S基因、內部轉錄間隔區1(internal transcribed sp

12、acer, ITS1)、5.8S基因、內部轉錄間隔區2(ITS2)、 28S 基因和基因間隔序列(intergenicspacer, IGS)16 。核糖體DNA中的18S、5.8S和 28S 的基因組序列在大多數真菌中趨于保守, 在生物種間變化小 , 而內轉錄間隔區 ITS1 和 ITS2 作為非編碼區 , 承受的選擇壓力較小, 相對變化較大 , 并且能夠提供詳盡的系統學分析所需要的可遺傳性狀。White 等為真菌 rRNA基因的 ITS 設計了 3 種特異引物 , 即 ITS1、 ITS4 和 ITS5, 用于大多數擔子菌和子囊菌, 但這些引物也能擴增一些植物ITS區域 17 。 Gard

13、es 等為真菌和擔子菌分別設計了特異引物ITS1-F和 ITS4-B 18 。楊佩文等應用真菌核糖體基因ITS區段通用引物ITS1和ITS4，對十字花科蔬菜根腫病菌(Plasmodiophorabrassicae)rDNA進行PCR擴增，測序分析和特異引物的設計，獲得根腫菌一特異性分子片段并對不同寄主植物進行了檢測19 。謝勇等根據從 Gene Bank database 獲得的疫霉屬真菌 (Pytophthora spp.) rDNA ITS 區段序列，設計合成了煙草寄生性疫霉的特異性引物，并從不同病組織及土壤中均檢測到煙草寄生疫霉，而參試的其他菌株如交鏈孢菌菌株、鐮刀菌菌株、炭疽菌菌株、立

14、枯絲核菌菌株、稻瘟病菌菌株和野火病菌菌株均沒有擴增產物20 。使用通用引物 PCR擴增和 DNA序列測定的方法，簡便快速、成本低穩定性好、結果可靠，適合實驗室常規使用，可用于常見的和疑難真菌菌種快速鑒定。使用真菌通用引物雖然無法將所有的菌株鑒定到種， 但是可以鑒定到屬的水平。 相信隨著分子生物技術的發展,采用分子方法進行物種間分類、鑒定、確定種間系統進化關系等諸多方面能夠更加貼近生物的本原。4 研究展望各項研究表明 ,PCR 技術從分子水平上迅速、準確的進行微生物的分類和鑒定。但是,在該技術的廣泛應用和不斷改進中, 某些樣品的復雜性等問題會給研究造成一定的困難。首先 , 由于 PCR反應的靈敏

15、度很高 , 所以環境中存在的抑制劑以及在樣品保存、濃縮和提純過程中所帶來的污染會抑制PCR反應 , 或是造成假陽性后果 , 從而影響實驗結果的準確性；其次 , 由于 DNA檢測無需使用活細胞 ,PCR 反應對樣品中存在的核酸物質都可以進行擴增故 PCR技術無法區分活細胞和死細胞；此外, 分子生物學尚不能完全取代傳統微生物技術,還需采用傳統微生物技術與分子生物學技術相結合, 對微生物進行分類鑒定。隨著PCR技術的成熟與發展, 以此為基礎的分子生物學技術將成為微生物分類鑒定的技術前沿, 它必將會為微生物分類學帶來廣闊的發展前景。參考文獻1常世敏 . PCR 在食品微生物檢測中的應用J.邯鄲農業高等

16、專科學校學報, 2004,21(4): 23-25.2 唐永凱 , 俞菊華 , 徐跑等 . 實時熒光定量 PCR技術及其在水產上的應用 J. 中國農學通報 , 2010, (21): 422-426.3吳學貴 .LPS 刺激點帶石斑魚免疫相關基因的克隆與組織表達差異性分析D.海口 :海南大學 , 2011.4侯立華 ,黃新 , 朱水芳等 . 雙色熒光多重 PCR 技術及在禽流感病毒檢測中的應用J.生物技術通報 , 2010, (1):168-172.5查錫良 .生物化學 M. 7版. 北京人民衛生出版社 . 2009, 483-485.6張杰道 .生物化學實驗技術PCR技術及應用 M. 北京科

17、學出版社 , 2005, 12-18.7 謝海燕 . 黑線倉鼠 LHR部分序列克隆及組織器官的表達差異D. 曲阜 : 曲阜師范大學 , 2011.8 Petti CA. Detection and identification of microorganisms by gene amplification and sequencingJ. Clin Infect Dis, 2007, 44(8): 1108-1114.9Sontakke S, Cadenas MB, Maggi RG. Use of broad range 16S rDNA PCRinclinicalmicrobiologyJ

18、.Methods. 2009, 76(3): 217-225.J Microbiol10 Baker GC, Smith JJ, Cowan DA. Review and re-analysis of domain-specific 16S primersJ. J Microbiol Methods. 2003, 55(3): 541-555.11王永智 , 薛利軍 , 任浩趙 ,等.基于 16S rDNA的快速檢測血液細菌污染的熒光定量PCR研究 J.中華實驗和臨床感染病雜志 , 2007, 1(4): 204-210.12應燕玲 , 許先國 , 朱發明 ,等.16S rDNA快速鑒定血液制

19、品中污染細菌的測序方法的建立J.中華微生物學和免疫學雜志 , 2009, 9(10): 880-883.13Hansen WL, Beuving J, Bruggeman VA. Molecular probes for the diagnosis of clinicallyrelevant bacterialinfections in blood culturesJ. J Clin Microbiol, 2010, 48(12): 4432-4438.14 劉佳妍 , 金莉莉 , 王秋雨 . 細菌基因組重復序列 PCR技術及其應用 J. 微生物學雜志 , 2006, 26(3): 90-93.15 Versalovic J, Schneider M, De Bruijin FJ, et al. Genomic fingerprinting of bacteria using repetitivesequence based PCR (rep-PCR)J. Methods in Molecular and Cellular Biology, 1994, 5: