1、第十七章 流式細胞儀分析技術及應用,第一節 概述 一、工作原理 二、散射光的測定 三、熒光測量 四、細胞分選原理,第二節 數據的顯示與分析 一、參數 二、數據顯示方式 三、設門分析技術,第三節 流式細胞儀免疫分析的技術要求 一、免疫檢測樣品制備 二、免疫分析中常用的熒光染料與標記染色 三、免疫膠乳顆粒的應用 四、流式細胞免疫學技術的質量控制,第四節 流式細胞術在免疫學檢查中的應用 一、淋巴細胞及其亞群的分析 二、淋巴細胞功能分析 三、淋巴造血系統分化抗原及白血病免疫分型 四、腫瘤耐藥相關蛋白分析 五、AIDS病檢測中的應用 六、自身免疫性疾病相關HLA抗原分析 七、移植免疫中的應用,思考題 小

2、結,流式細胞術(flow cytometry, FCM)是以流式細胞儀為檢測手段的一項能快速、精確的對單個細胞理化特性進行多參數定量分析和分選的新技術,流式細胞術最大的特點是能在保持細胞及細胞器或微粒的結構及功能不被破壞的狀態下，通過熒光探針的協助，從分子水平上獲取多種信號對細胞進行定量分析或純化分選,細胞不被破壞，測量快速、大量、準確、靈敏、定量,流式細胞術的特點,流式細胞儀是測量染色細胞標記物熒光強度的細胞分析儀，是在單個細胞分析和分選基礎上發展起來的對細胞的物理或化學性質（如大小、內部結構、DNA、RNA、蛋白質、抗原等）進行快速測量并可分類收集的高技術,第一節 概述,流式細胞儀常檢測的

3、細胞特性,采用激光作為激發光源，保證其具有更好的單色性與激發效率； 利用熒光染料與單克隆抗體技術結合的標記技術，保證檢測的靈敏度和特異性； 用計算機系統對流動的單細胞懸液中單個細胞的多個參數信號進行數據處理分析，保證了檢測速度與統計分析精確性,一、工作原理,1） 液流系統 （2） 光學系統 （3） 數據處理系統,1.流式細胞儀的基本結構,由樣本和鞘液組成 待測細胞 單個細胞的懸液 熒光染料標記的單抗對其染色 受清潔氣體壓力 從樣品管進入流動室形成樣本流 鞘液：輔助樣本流被正常檢測的基質液。主要作用是包裹樣本流的周圍，保持樣本流中細胞處于噴嘴中心位置，防止其靠近孔壁而阻塞噴孔,1）液流系統,液流

4、系統示意圖,FCM的液流系統（如何形成單個細胞流,樣本管,鞘液管,激光光源：氣冷式氬離子激光器 分色反光鏡：反射長/短波長，通過短/長波長 光束成形器：兩十字交叉放置的透鏡 透鏡組：形成平行光，除去室內光 濾片：長通、短通、帶通 光電倍增管：FS, SS（散射光）， FL1, FL2, FL3, FL4（熒光,2）光學系統,光學系統示意圖,主要由計算機及其軟件組成,3）數據處理系統,基本工作原理,基本過程,流式細胞儀與顯微鏡的區別,細胞在液柱中與激光束相交時向周圍360立體角方向散射的光線信號，它的強弱與細胞的大小、形狀、胞內顆粒折射等有關，主要分為前向散射光和側向散射光,二、散射光的測定,前

5、向散射光（forward scatter, FS）：激光束照射細胞時，光以相對軸較小角度(0.510)向前方散射的訊號用于檢測細胞等粒子的表面屬性，信號強弱與細胞體積大小成正比,前向散射光示意圖,側向散射光（side scatter, SS）：激光束照射細胞時，光以90角散射的訊號，用于檢測細胞內部結構屬性,側向散射光示意圖,測得的FS與SS信號通過計算機處理，可得到FS-SS圖，由此可僅用散射光信號對未染色的活細胞進行分析或分選。 此為血細胞分類的基本原理，但不能分析表面分子,淋巴細胞,單核細胞,中性粒細胞,光散射測量最有效用途：從非均一群體中鑒別出某些亞群,熒光信號由被檢細胞上標記的特異性

6、熒光染料受激發后產生，發射的熒光波長與激發光波長不同。 每種熒光染料會產生特定波長的熒光和顏色，通過波長選擇通透性濾片，可將不同波長的散射光和熒光信號區分開，送入不同的光電倍增管。 選擇不同的單抗及染料就可同時測定一個細胞上的多個不同特征。 線性放大器和對數放大器,三、熒光測量,熒光染料的特性,激發波長(EXCITING) 發射波長(EMISSION,熒光補償,通過流式細胞儀進行細胞分選主要是在對具有某種特征的細胞需進一步培養和研究時進行的,四、細胞分選原理,壓電晶體,產生機械振動,不充電,充電,一）分選基本原理,分選速度：單位時間內分選的細胞數量。與懸液中細胞的含量成正比。 分選純度：分選出

7、的目的細胞占所有收獲細胞的百分率。 分選收獲率：實際收獲的分選細胞與設定通過測量點的分選細胞之間的比率。與純度成反比。 分選得率：從一群體細胞懸液中分辨出目的細胞的總量，再經分選后得到目的細胞的實際得率。與分選速度成反比,二）分選的技術要求,參數：FS,SS,FL 數據顯示方式 （單參數直方圖 、雙參數散點圖 、二維等高圖 、假三維等高圖 、三參數散點圖 ） 設門分析技術,第二節 數據的顯示與分析,FS：反映顆粒的大小 SS：反映顆粒的內部結構復雜程度 FL：反映顆粒被染上的熒光數量多少,一、 參數,單參數直方圖 雙參數直方圖:點圖 二維等高圖 假三維等高圖 三參數直方圖 多參數分析,直分析方

8、圖,設門分析:REGION和GATE設置,二、數據顯示方式,由一維參數(散射光或熒光)與顆粒計數(COUNT)構成，反映同樣散射光或熒光強度的顆粒數量的多少,一）單參數直方圖,單參數直方圖,雙參數直方圖：縱軸和橫軸分別代表被測量細胞的兩個測量參數，根據這兩個參數就可以確定細胞在圖上的表達位置。 雙參數信號通常采用對數信號，最常用的是點密圖，在圖中，每個點代表一個細胞，點圖利用顆粒密度反映同樣散射光或熒光強度的顆粒數量的多少,二）雙參數直方圖,1.雙參數直方圖點圖,雙參數直方圖點圖,2. 二維等高圖,由類似地圖上的等高線組成，其本質也是雙參數直方圖。 等高圖上每一條連續曲線上具有相同的細胞相對或

9、絕對數，即“等高”。 曲線層次越高(越里面的線) 所代表的細胞數愈多。 等高線越密集則表示細胞數變化率越大,二維等高圖,3. 假三維等高圖,三）三參數直方圖,多參數分析：當細胞標記了多色熒光，被激發光激發后，得到的熒光信號和散射光信號可根據需要進行組合分析,四）流式細胞儀的多參數分析,Gate設置：指在某一張選定參數的直方圖上，根據該圖的細胞群分布選定其中想要分析的特定細胞群，并要求該樣本所有其他參數組合的直方圖只體現這群細胞的分布情況,根據門的形狀又分為了線性門、矩形門、圓形門、多邊形門、任意形狀門和十字門,三、設門分析技術,A 淋巴細胞 B 單核細胞 C 中性粒細胞,A、B、C均為任意門,

10、線性門,Region設置: 區閾（region, R）與門(gate, G ) 是兩個相關的概念，區閾可與門對應，但是也可以包含于門,D1 CD4+/CD3- D2 CD4+/CD3+ D3 CD4- /CD3- D4 CD4- /CD3,如十字門分析時，起就可以由四個區域構成，即G=D1+D2+D3+D4,樣本制備 標記染色 液相芯片技術 質量控制,第四節 流式細胞儀免疫分析的技術要求,外周血淋巴細胞樣品的制備 分離單個核細胞 培養細胞的樣品制備 蛋白酶消化 機械吹打 使貼壁細胞脫落 洗滌 尼龍網過濾,一、免疫檢測樣品制備,新鮮實體組織單細胞懸液的制備 機械法 酶處理法 化學試劑處理法 表面

11、活性劑處理法 單細胞懸液的保存 深低溫保存法（一年） 乙醇或甲醇保存法（2周） 甲醛或多聚甲醛保存法（2月,適用條件: 有較高的量子產額和消光系數 對488nm的激發光波長有較強的吸收 發射光波長與激發光波長間有較大的波長差 易與標記單抗結合而不影響抗體的特異性,二、常用的熒光染料與標記染色,激光,細胞懸液,異硫氰酸熒光素,得州紅,能量傳遞復合染料,藻膽蛋白類,一）幾種常見的熒光染料,常用的幾類熒光染料,用化學法將兩種不同激發波長的染料結合在一起，在488nm激發光照射下，通過一個熒光染料被激發后產生的發射波長再激發另一熒光染料產生熒光信號，從而檢測到該特定熒光信號,能量傳遞復合染料,488n

12、m,575nm,670nm 紅色熒光,花青苷5,藻紅蛋白,能量傳遞復合染料機制,熒光染料與細胞成分的四種結合方式 結構親和式 嵌入結合 共價鍵結合 熒光標記抗體特異性結合 免疫熒光標記方法 直標:干擾少,但需購買多種單抗 間標:步驟多,干擾多,不需標記多種抗體 組合標記,二）免疫熒光標記,免疫膠乳顆粒的應用即液相芯片技術是把微小的乳膠微球分別染成上百種不同的熒光色，把針對不同檢測物的乳膠微球混合后再加入待標本，在懸液中與微粒進行特異性地結合，經激光照射后不同待測特產生不同顏色，并可進行定量分析。因檢測速度極快，所以又有“液相芯片”之稱,三、免疫膠乳顆粒技術的應用,微小的乳膠微球分別染成上百種不

13、同的熒光色（固相芯片是用探針在芯片上的坐標位置給基因的特異性編碼；而液相芯片則是用顏色來編碼,通過對標記不同熒光素分子的檢測，實現FCM對可溶性物質的定量分析,適當的制備方式 處理紅細胞 實體組織來源標本用機械法 溫度2537，pH7.07.2,四、流式細胞免疫學技術的質量控制,一）單細胞懸液制備的質控,溫度 pH 染料濃度 固定劑,二）免疫熒光染色的質控,光路與流路校正: 確保激光光路與樣品流處于正交狀態，減少變異（CV）。 PMT（光電倍增管）校準: 保證樣品檢測時儀器處于最佳靈敏度工作狀態。 絕對計數校準: 保證計數的準確性,Flow-check,Flow-set,Flow-count,

14、三）儀器操作的質控,同型對照：即免疫熒光標記中的陰性對照，選用相同源性的未標記單抗作為對照調整和設置電壓，以保證特異性。 全程質量控制：與待測標本一起標記和檢測，結果達靶值，提示本次實驗結果可靠,四）免疫檢測的質控,流式細胞術目前已廣泛地被應用于免疫學基礎研究和逐步進入臨床應用各方面，用流式細胞儀對細胞表面的抗原成分進行標記分析，可區別多種細胞的特性，為細胞免疫的研究增加了有效的手段和幫助,第四節 在免疫學檢驗中的應用,T淋巴細胞及其亞群分析 Th(CD3+CD4+CD8-T); Tc(CD3+CD4-CD8+T) B淋巴細胞及其亞群分析 B1(CD19+CD5+):產生IgM型自身抗體, 參

15、與免疫調節、與自身免疫病的發生有關 B2(CD19+CD5-):受外來抗原刺激, 產生高親和性特異性抗體 NK細胞分析 NK(CD3-CD16+CD56,一、淋巴細胞及其亞群的分析,細胞介導細胞毒性試驗(死細胞與活細胞比例) 細胞內細胞因子測定,二、淋巴細胞功能分析,三、淋巴造血系統及白血病免疫分型,對淋巴瘤和白血病進行多色免疫分型 用于選擇化療方案、判斷預后及檢出微小殘留病變,CD4+Th細胞、CD4+/CD8+比例,MDR(+)表示對化療藥物耐藥,四、腫瘤耐藥基因分析,五、AIDS病檢測中的應用,HLA-B27可出現在58%97%的強直性脊椎炎(As) 患者,六、自身免疫病相關HLA抗原分

16、析,FCM作為一個強大的技術平臺，已應用于多個領域，其在移植免疫分析中的應用也越來越廣泛。目前移植免疫中的FCM應用主要包括流式細胞術的交叉配型（Flow cytometry cross-matching, FCXM）和群體反應性抗體（Panel reactive antibody, PRA）檢測,七、移植免疫中的應用,思考題,流式細胞儀的分析檢測原理是什么？ 流式細胞儀分析中前向散射光、側向散射光和熒光的檢測意義。 何謂熒光補償？何謂“液相芯片”技術？ 細胞分選的基本原理。 FCM分析中有哪些數據顯示方式，如何解讀結果及其設門分析的意義？ 如何進行FCM分析檢測樣品的制備？ 流式細胞分析前如何驗證儀器工作狀態，采用何種校正物？ 流式細胞免疫分析的質量控制包括哪些方面？ 流式細胞術有哪些臨床應用價值？ 流式細胞儀分析中常見的熒光素有那些？他們的特性如何,小