.,1,第十一章分子熒光與分子磷光光譜法分子發光分析MolecularLuminescenceAnalysis分子發光分析包括熒光、磷光、化學發光、生物發光和散射光譜等。一、基本原理分子發光：處于基態的分子吸收能量（電、熱、化學和光能等）被激發至激發態，然后從不穩定的激發態返回至基態并發射出光子，此種現象稱為發光。發光分析包括熒光、磷光、化學發光、生物發光等。物質吸收光能后所產生的光輻射稱之為熒光和磷光,.,2,單重態和三重態：分子中的電子運動包括電子軌道的運動和電子的自旋運動。分子中電子的自旋狀態可用多重態2S+1描述（電子激發態的多重度用M2S+1表示），S為總自旋量子數（其數值為0和1）。若分子中沒有未配對的電子，即S=0,則2S+1=1稱為單重態（Pauli)；若分子中有兩個自旋平行的未配對電子，即S=1，則2S+1=3稱為三重態，用T表示。電子通常的情況下分子的電子處于最低的能級狀態（大多數有機物的分子的基態是處于單重態的）。用S0表示。若分子受激發，其電子從基態的電子能級躍遷到較高的電子能級，即激發態，用S1,S2表示。（一）熒光和磷光的產生處于分子基態單重態中的電子對，其自旋方向相反，當分子吸收能量，若電子在躍遷過程中不發生自旋方向的改變，通常躍遷至第一激發態單重態軌道上，也可能躍遷至能級更高的單重態上。這種躍遷是符合光譜選律的。如果電子在躍遷過程中還伴隨著自旋方向的改變，即躍遷至第一或更高的激發三重態軌道上，這屬于禁阻躍遷。單重態與三重態的區別在于電子自旋方向不同，激發三重態具有較低能級（處于分立軌道上的非成對電子，平行自旋要比成對自旋更穩定些洪特規則）。,.,3,.,4,在單重激發態中，兩個電子平行自旋，單重態分子具有抗磁性，其激發態的平均壽命大約為10-8s，而三重態分子具有順磁性，其激發態的平均壽命為10-41s以上（通常用S和T分別表示單重態和三重態）。處于激發態的電子，通常以輻射躍遷方式或無輻射躍遷方式再回到基態。輻射躍遷主要涉及到熒光、延遲熒光或磷光的發射；無輻射躍遷則是指以熱的形式輻射其多余的能量，包括振動弛豫（VR）、內部轉移（IR）、系間竄躍（IX）及外部轉移（EC）等，各種躍遷方式發生的可能性及程度，與熒光物質本身的結構及激發時的物理和化學環境等因素有關。下面結合熒光和磷光的產生過程，進一步說明各種能量傳遞方式在其中所起的作用。設處于基態單重態中的電子吸收波長為1和2的輻射光之后，分別激發至第二單重態S2及第一單重態S1。,.,5,去活化過程（Deactivation）處于激發態分子不穩定，通過輻射或非輻射躍遷等去活化過程返回至基態。這些過程包括：振動弛豫（VibrationalRelaxation,VR）它是指在同一電子能級中，電子由高振動能級轉至低振動能級，而將多余的能量以熱的形式發出。發生振動弛豫的時間為10-12s數量級。,熒光、磷光能級圖振動弛豫,.,6,內轉換（InternalConversion，IC）當兩個電子能級非常靠近以至其振動能級有重疊時，常發生電子由高能級以無輻射躍遷方式轉移至低能級。右圖中指出，處于高激發單重態的電子，通過內轉移及振動弛豫，均躍回到第一激發單重態的最低振動能級。,熒光、磷光能級圖,.,7,熒光發射處于第一激發單重態中的電子躍回至基態各振動能級時，將得到最大波長為3的熒光。注意：基態中也有振動馳豫躍遷。很明顯，3的波長較激發波長1或2都長，而且不論電子開始被激發至什么高能級，最終將只發射出波長3為的熒光。熒光的產生在10-7-10-9s內完成。,熒光,.,8,系間竄躍,系間竄躍（IntersystemConversion，ISC）系間跨躍指不同多重態間的無輻射躍遷，例如S1T1就是一種系間竄躍。通常，發生系間竄躍時，電子由S1的較低振動能級轉移至T1的較高振動能級處。有時，通過熱激發，有可能發生T1S1，然后由S1發生熒光。這是產生延遲熒光的機理。,熒光、磷光能級圖,.,9,磷光,熒光、磷光能級圖,磷光發射電子由基態單重態激發至第一激發三重態的幾率很小，因為這是禁阻躍遷。但是，由第一激發單重態的最低振動能級，有可能以系間竄躍方式轉至第一激發三重態，再經過振動馳豫，轉至其最低振動能級，由此激發態躍回至基態時，便發射磷光，這個躍遷過程（T1S0）也是自旋禁阻的，其發光速率較慢，約為10-4-10s。因此，這種躍遷所發射的光，在光照停止后，仍可持續一段時間。,.,10,外轉移（ExternalConversion，EC）外轉換指激發分子與溶劑分子或其它溶質分子的相互作用及能量轉移，使熒光或磷光強度減弱甚至消失。這一現象稱為“熄滅”或“猝滅”。熒光與磷光的根本區別：熒光是由激發單重態最低振動能層至基態各振動能層間躍遷產生的；而磷光是由激發三重態的最低振動能層至基態各振動能層間躍遷產生的。,.,11,.,12,（二）激發光譜曲線和熒光、磷光光譜曲線熒光和磷光均為光致發光，因此必須選擇合適的激發光波長，可根據它們的激發光譜曲線來確定。繪制激發光譜曲線時，固定測量波長為熒光（或磷光）最大發射波長，然后改變激發波長，根據所測得的熒光（磷光）強度與激發光波長的關系，即可繪制激發光譜曲線。應該指出，激發光譜曲線與其吸收曲線可能相同，但激發光譜曲線是熒光強度與波長的關系曲線，吸收曲線則是吸光度與波長的關系曲線，兩者在性質上是不同的。當然，在激發光譜曲線的最大波長處，處于激發態的分子數目是最多的，這可說明所吸收的光能量也是最多的，自然能產生最強的熒光。,.,13,如果固定激發光波長為其最大激發波長，然后測定不同的波長時所發射的熒光或磷光強度，即可繪制熒光或磷光光譜曲線。在熒光和磷光的產生過程中，由于存在各種形式的無輻射躍遷，損失能量，所以它們的最大發射波長都向長波方向移動，以磷光波長的移動最多，而且它的強度也相對較弱。,.,14,熒光發射光譜的普遍特性：（1）Stokes位移在溶液中，分子熒光的發射相對于吸收位移到較長的波長，稱為Stokes位移。這是由于受激分子通過振動弛豫而失去轉動能，也由于溶液中溶劑分子與受激分子的碰撞，也會有能量的損失。因此，在激發和發射之間產生了能量損失。（2）熒光發射光譜的形狀與激發波長無關因為分子吸收了不同能量的光子可以由基態激發到幾個不同的電子激發態，而具有幾個吸收帶。由于較高激發態通過內轉換及轉動弛豫回到第一電子激發態的幾率較高，遠大于由高能激發態直接發射光子的速度，故在熒光發射時，不論用哪一個波長的光輻射激發，電子都從第一電子激發態的最低振動能層返回到基態的各個振動能層，所以熒光發射光譜與激發波長無關。,.,15,（3）鏡像規則通常熒光發射光譜和它的吸收光譜呈鏡像對稱關系。吸收光譜是物質分子由基態激發至第一電子激發態的各振動能層形成的。其形狀決定于第一電子激發態中各振動能層的分布情況。熒光光譜是激發分子從第一電子激發態的最低振動能層回到基態中各不同能層形成的。所以熒光光譜的形狀決定于基態中各振動能層的分布情況?；鶓B中振動能層的分布和第一電子激發態中振動能層的分布情況是類似的。因此熒光光譜的形狀和吸收光譜的形狀極為相似。,.,16,熒光光譜與吸收光譜呈鏡像對稱關系。,.,17,由基態最低振動能層躍遷到第一電子激發態各個振動能層的吸收過程中，振動能層越高，兩個能層之間的能量差越大，即激發所需的能量越高，所以吸收峰的波長越短。反之，由第一電子激發態的最低振動能層降落到基態各個振動能層的熒光發射過程中，基態振動能層越高，兩個能層之間的能量差越小，熒光峰的波長越長。另外，也可以從位能曲線解釋鏡像規則。由于光吸收在大約10-15的短時間內發生，原子核沒有發生明顯的位移，即電子與核之間的位移沒有發生變化。假如在吸收過程中，基態的零振動能層與激發態的第二振動能層之間的躍遷幾率最大，那么，在熒光發射過程中，其相反躍遷的幾率也應該最大。也就是說，吸收和發射的能量都最大。,.,18,（三）熒光和分子結構的關系分子產生熒光必須具備兩個條件：分子必須具有與所照射的輻射頻率相適應的結構，才能吸收激發光；吸收了與其本身特征頻率相同的能量之后，必須具有一定的熒光量子產率。1.量子產率熒光量子產率也叫熒光效率或量子效率，它表示物質發射熒光的能力，通常用下式表示=發射熒光分子數/激發分子總數或=發射熒光量子數/吸收光量子數在產生熒光的過程中，涉及到許多輻射和無輻射躍遷過程，如熒光發射、內轉移，系間竄躍和外轉移等。很明顯，熒光的量子產率，將與上述每一個過程的速率常數有關。,.,19,若用數學式來表達這些關系，得到=kf/（kf+ki）式中kf為熒光發射過程的速率常數，ki為其它有關過程的速率常數的總和。凡是能使kf值升高而使其它ki值降低的因素，都可增強熒光。實際上，對于高熒光分子，例如熒光素，其量子產率在某些情況下接近1，說明ki很小，可以忽略不計。一般來說，kf主要取決于化學結構，而ki則主要取決于化學環境，同時也與化學結構有關。磷光的量子產率與此類似。,.,20,2.熒光與有機化合物的結構（1）躍遷類型實驗證明，對于大多數熒光物質，首先經歷或n（非鍵電子軌道）激發，然后經過振動弛豫或其他無輻射躍遷，再發生或n躍遷而得到熒光。在這兩種躍遷類型中，躍遷常能發出較強的熒光（較大的量子產率）。這是由于躍遷具有較大的摩爾吸光系數（一般比n大100-1000倍），其次，躍遷的壽命約為10-710-9s，比n躍遷的壽命10-510-7s要短。在各種躍遷過程的競爭中，它是有利于發射熒光的。此外，在躍遷過程中，通過系間竄躍至三重態的速率常數也較?。⊿1T!能級差較大），這也有利于熒光的發射，總之，躍遷是產生熒光的主要躍遷類型。,.,21,（2）共軛效應實驗證明，容易實現激發的芳香族化合物容易發生熒光，能發生熒光的脂肪族和脂環族化合物極少（僅少數高度共軛體系化合物除外）。此外，增加體系的共軛度，熒光效率一般也將增大。例如，在多烯結構中，ph（CH=CH）3ph和ph（CH=CH）2ph在苯中的熒光效率分別為0.68和0.28。共軛效應使熒光增強的原因：主要是由于增大熒光物質的摩爾吸光系數，有利于產生更多的激發態分子，從而有利于熒光的發生。(3)剛性平面結構實驗發現，多數具有剛性平面結構的有機分子具有強烈的熒光。因為這種結構可以減少分子的振動，使分子與溶劑或其它溶質分子的相互作用減少，也就減少了碰撞去活的可能性。,.,22,（4）取代基效應芳香族化合物苯環上的不同取代基對該化合物的熒光強度和熒光光譜有很大的影響。給電子基團，如-OH、-OR、-CN、-NH2、-NR2等，使熒光增強。因為產生了p-共軛作用，增強了電子共軛程度，使最低激發單重態與基態之間的躍遷幾率增大。吸電子基團，如-COOH、-NO、-CO、鹵素等，會減弱甚至會猝滅熒光。鹵素取代基隨原子序數的增加而熒光降低。這可能是由所謂“重原子效應”使系間跨越速率增加所致。在重原子中，能級之間的交叉現象比較嚴重，因此容易發生自旋軌道的相互作用，增加了由單重態轉化為三重態的速率。取代基的空間障礙對熒光也有影響。立體異構現象對熒光強度有顯著的影響。,.,23,3.金屬螯合物的熒光除過渡元素的順磁性原子會發生線狀熒光光譜外，大多數無機鹽類金屬離子，在溶液中只能發生無輻射躍遷，因而不產生熒光。但是，在某些情況下，金屬螯合物卻能產生很強的熒光，并可用于痕量金屬元素分析。（1）螯合物中配位體的發光不少有機化合物雖然具有共軛雙鍵，但由于不是剛性結構，分子處于非同一平面，因而不發生熒光。若這些化合物和金屬離子形成螯合物，隨著分子的剛性增強，平面結構的增大，常會發生熒光。如8-羥基喹啉本身有很弱的熒光，但其金屬螯合物具有很強的熒光。（2）螯合物中金屬離子的特征熒光這類發光過程通常是螯合物首先通過配位體的躍遷激發，接著配位體把能量轉給金屬離子，導致dd躍遷和ff躍遷，最終發射的是dd躍遷和ff躍遷光譜,.,24,（四）溶液的熒光（或磷光）強度1.熒光強度與溶液濃度的關系熒光強度If正比于吸收的光量Ia與熒光量子產率。If=Ia式中為熒光量子效率，又根據Beer定律Ia=I0-It=I0(1-10-lC)I0和It分別是入射光強度和透射光強度。代入上式得If=I0(1-10-lc)=I0(1-e-2.3lc)整理得：If=2.3I0lc當入射光強度I0和l一定時，上式為：If=Kc即熒光強度與熒光物質的濃度成之正比，但這種線性關系只有在極稀的溶液中，當lc0.05時才成立。對于較濃溶液，由于猝滅現象和自吸收等原因，使熒光強度和濃度不呈線性關系。,.,25,2.影響熒光強度的因素溶劑對熒光強度的影響。溶劑的影響可分為一般溶劑效應和特殊溶劑效應。一般溶劑效應指的是溶劑的折射率和介電常數的影響。特殊溶劑效應指的是熒光體和溶劑分子間的特殊化學作用，如氫鍵的生成和化合作用。一般溶劑效應是普遍的，而特殊溶劑效應則決定于溶劑和熒光體的化學結構。特殊溶劑效應所引起熒光光譜的移動值，往往大于一般溶劑效應所引起的影響。由于溶質分子與溶劑分子間的作用，使同一種熒光物質在不同的溶劑中的熒光光譜可能會有顯著不同。有的情況，增大溶劑的極性，將使n躍遷的能量增大，躍遷的能量減小，而導致熒光增強，熒光峰紅移。但也有相反的情況，例如，苯胺奈磺酸類化合物在戊醇、丁醇、丙醇、乙醇和甲醇中，隨著醇的極性增大，熒光強度減小，熒光峰藍移。因此熒光光譜的位置和強度與溶劑極性之間的關系，應根據熒光物質與溶劑的不同而異。如果溶劑和熒光物質形成了化合物，或溶劑使熒光物質的電離狀態改變，則熒光峰位和強度都會發生較大的變化。,.,26,溫度對熒光強度的影響溫度上升使熒光強度下降。其中一個原因是分子的內部能量轉化作用。當激發分子接受額外熱能時，有可能使激發能轉換為基態的振動能量，隨后迅速振動弛豫而喪失振動能量。另一個原因是碰撞頻率增加，使外轉換的去活幾率增加。溶液pH值對熒光強度的影響帶有酸性或堿性官能團的大多數芳香族化合物的熒光與溶液的pH有關。不同的pH值，化合物所處狀態不同，不同的化合物或化合物的分子與其離子在電子構型上有所不同，因此，它們的熒光強度和熒光光譜就有一定的差別。對于金屬離子與有機試劑形成的發光鏊合物，一方面pH會影響鏊合物的形成，另一方面還會影響鏊合物的組成，因而影響它們的熒光性質。,.,27,內濾光作用和自吸收現象溶液中若存在能吸收激發或熒光物質所發射光能的物質，就會使熒光減弱，這種現象稱為“內濾光作用”。內濾光作用的另一種情況是熒光物質的熒光發射光的短波長的一端與該物質的吸收光譜的長波長一端有重疊。在溶液濃度較大時，一部分熒光發射被自身吸收，產生“自吸收”現象而降低了溶液的熒光強度。,.,28,3.溶液熒光猝滅熒光物質分子與溶劑分子或其它溶質分子的相互作用引起熒光強度降低的現象稱為熒光猝滅。能引起熒光強度降低的物質稱為猝滅劑。導致熒光猝滅的主要類型：碰撞猝滅碰撞猝滅是指處于激發單重態的熒光分子與猝滅劑分子相碰撞，使激發單重態的熒光分子以無輻射躍遷的方式回到基態，產生猝滅作用。靜態猝滅（組成化合物的猝滅）由于部分熒光物質分子與猝滅劑分子生成非熒光的配合物而產生的。此過程往往還會引起溶液吸收光譜的改變。,.,29,轉入三重態的猝滅分子由于系間的跨越躍遷，由單重態躍遷到三重態。轉入三重態的分子在常溫下不發光，它們在與其它分子的碰撞中消耗能量而使熒光猝滅。溶液中的溶解氧對有機化合物的熒光產生猝滅效應是由于三重態基態的氧分子和單重激發態的熒光物質分子碰撞，形成了單重激發態的氧分子和三重態的熒光物質分子，使熒光猝滅。發生電子轉移反應的猝滅某些猝滅劑分子與熒光物質分子相互作用時，發生了電子轉移反應，因而引起熒光猝滅。熒光物質的自猝滅在濃度較高的熒光物質溶液中，單重激發態的分子在發生熒光之前和未激發的熒光物質分子碰撞而引起的自猝滅。有些熒光物質分子在溶液濃度較高時會形成二聚體或多聚體，使它們的吸收光譜發生變化，也引起溶液熒光強度的降低或消失。,.,30,二、熒光分析儀用于測量熒光的儀器由激發光源、樣品池、用于選擇激發光波長和熒光波長的單色器以及檢測器四部分組成。目前常用的國內外熒光光譜儀,Jasco日本分光FP-6500,.,31,熒光分光光度計RF-5301PC,分子熒光光譜(FS)-儀器,930A熒光光度計,.,32,.,33,F95/96熒光分光光度計中國上海,.,34,測定原理：由光源發射的光經第一單色器得到所需的激發光波長，通過樣品池后，一部分光能被熒光物質所吸收，熒光物質被激發后，發射熒光。為了消除入射光和散射光的影響，熒光的測量通常在與激發光成直角的方向上進行。為消除可能共存的其它光線的干擾，如由激發所產生的反射光、Raman光以及為將溶液中雜質濾去，以獲得所需的熒光，在樣品池和檢測器之間設置了第二單色器。熒光作用于檢測器上，得到響應的電信號。,（熒光分析儀器基本部件示意圖）,.,35,（1）激發光源在紫外-可見區范圍，通常的光源是氙燈和高壓汞燈。,（3）單色器光柵（4）檢測器由光電管和光電倍曾管作檢測器，并與激發光成直角。,（2）樣品池熒光用的樣品池須用低熒光的材料制成，通常用石英，形狀以方形和長方形為宜。,三、分子熒光分析法及其應用,1.熒光分析方法的特點（1）靈敏度高（2）選擇性強（3）試樣量少和方法簡單（4）提供比較多的物理參數,.,36,熒光分析法的弱點是它的應用范圍小。因為本身能發熒光的物質相對較少，用加入某種試劑的方法將非熒光物質轉化為熒光物質進行分析，其數量也不多；另一方面，由于熒光分析的靈敏度高，測定對環境因素敏感，干擾因素較多。,2.定量分析方法（1）校準曲線法（2）比較法,3.應用（1）元素的熒光測定（2）有機化合物的熒光測定。,.,37,2.定性分析任何熒（磷）光都具有兩種特征光譜：激發光譜與發射光譜。它們是熒（磷）光定性分析的基礎。,1）激發光譜改變激發波長，測量在最強熒（磷）光發射波長處的強度變化，以激發波長對熒光強度作圖可得到激發光譜。激發光譜形狀與吸收光譜形狀完全相似，經校正后二者完全相同！這是因為分子吸收光能的過程就是分子的激發過程。激發光譜可用于鑒別熒光物質；在定量時，用于選擇最適宜的激發波長。,.,38,2）發射光譜,發射光譜即熒光光譜。一定波長和強度的激發波長輻照熒光物質，產生不同波長的強度的熒光，以熒光強度對其波長作圖可得熒光發射光譜。由于不同物質具不同的特征發射峰，因而使用熒光發射光譜可用于鑒別熒光物質。如右圖所示。,.,39,四、磷光分析法,分子磷光與分子熒光光譜的主要差別是磷光是第一激發單重態的最低能層，經系間跨越躍遷到第一激發三重態，并經振動弛豫至最低振動能層，然后躍遷回到基態發生的。與熒光相比，磷光具有如下三個特點：（1）磷光輻射的波長比熒光長分子的T1態能量比S1態低。（2）磷光的壽命比熒光長由于熒光是S1S0躍遷產生的，這種躍遷是自旋許可的躍遷，因而S1態的輻射壽命通常在10-710-9s，磷光是T1S0躍遷產生的，這種躍遷屬自旋禁阻的躍遷，其速率常數要小，因而輻射壽命要長，大約為10-410s，,.,40,（3）磷光的壽命和輻射強度對于重原子和順磁性離子敏感。,低溫磷光分析中，液氮是最常用的合適的冷卻劑。因此要求所使用的溶劑，在液氮溫度（77K）下應具有足夠的粘度并能形成透明的剛性玻璃體，對所分析的試樣應具有良好的溶解特性。試樣的剛性可減少熒光的碰撞猝滅。溶劑應易于提純，以除去芳香族和雜環化合物等雜質。溶劑應在所研究的光譜區域內沒有很強的吸收和發射。最常用的溶劑是EPA，它由乙醇、異戊烷和二乙醚按體積比為2：5：5混合而成。使用含有重原子的混合溶劑IEPA（由EPA：碘甲烷=10：1組成），有利于系間跨越躍遷，可以增加磷光效應。,1.低溫磷光由于激發三重態的壽命長，使激發態分子發生T1S0這種分子內部的內轉化非輻射去活化過程以及激發態分子與周圍的溶劑分子間發生碰撞和能量轉移過程，或發生某些光化學反應的幾率增大，這些都將使磷光強度減弱，甚至完全消失。為減少這些去活化過程的影響，通常應在低溫下測量磷光。,.,41,含重原子的溶劑，由于重原子的高核電荷引起或增強了溶質分子的自旋-軌函耦合作用，從而增大了S0T1吸收躍遷和S1T1系間跨越躍遷的幾率，有利于磷光的發生和增大磷光的量子產率。這種作用稱為外部重原子效應。當分子中引入重原子取代基，例如，當芳烴分子中引入雜原子或重原子取代基時，也會發生內部重原子效應，導