腫瘤免疫治療臨床應用及進展-腫瘤生物治療學基礎與臨床,教學目的與要求,熟悉腫瘤免疫治療的策略和方法認識免疫治療在腫瘤綜合治療中的地位和作用了解腫瘤免疫治療的最新進展,一、腫瘤的免疫治療,基本原理：提高腫瘤抗原免疫原性，激發和增強機體抗腫瘤免疫應答，提高腫瘤對抗瘤免疫效應的敏感性，在體內外誘生腫瘤特異性效應細胞和分子等。抗腫瘤免疫治療包括主動免疫治療、被動免疫治療。,1、干擾素1）I型干擾素：由單核巨噬細胞、病毒誘導的成纖維細胞、轉化的B細胞產生種類：IFN-、IFN-、IFN-、IFN-等作用：抑制腫瘤細胞周期、誘導細胞凋亡調節免疫反應感染腫瘤血管生成其它作用：抗病毒2）II型干擾素：由活化的T細胞、原始的Th0細胞和NK細胞產生種類：IFN-作用:激活巨噬細胞、NK細胞等直接殺傷癌細胞延長細胞周期、抑制腫瘤細胞的生長和增殖促進MHC-I、II類分子和抗原遞呈細胞尚共刺激分子的表達在干擾素的調節下，IFN-可誘導Th0向Th1分化，抑制向Th2分化，增強細胞免疫和CTL的殺傷活性臨床藥物：基因工程產品，已國產化。干擾靈、賽若金、因特芬、派羅欣。,（一）細胞因子治療,適應癥：干擾素主要用于治療晚期毛細胞白血病、腎癌、黑色素瘤、kaposi肉瘤、慢性粒細胞性白血病和中低度惡性非霍奇金淋巴瘤，其他曾用于骨肉瘤、乳腺癌、多發性骨髓瘤、頭頸部癌和膀胱癌等。對慢性乙、丙型肝炎也有效。用法：第1周300萬單位，皮下注射，每周23次，第2周每次加到500600萬單位，第3周加到9001000萬單位連續6周，共8周為1療程。干擾素亦可局部注射（瘤周浸潤）、腔內注射（癌性胸腹腔積液）或膀胱內灌注。毒副作用：高劑量干擾素具有一般生物制劑的反應即發熱、流感樣癥狀，肌肉酸痛等，其次是輕度骨髓抑制。一般對肝腎功能無影響，少數有轉氨酶、血肌酐升高。,2、白細胞介素-2（IL-2)來源：主要由激活的T淋巴細胞分泌和表達，此外NK、轉化的B細胞和LAK細胞也可產生作用：促進T細胞增殖及相應的細胞因子分泌刺激NK生長并增強其殺細胞活性誘導LAK、NK、TIL擴增及細胞因子的分泌促進B細胞分化、增殖和產生抗體參與機體的炎癥反應、抗腫瘤免疫反應和移植排斥反應臨床藥物：基因工程IL-2欣吉爾、德路生、遠策欣。,適應癥：用于腎細胞癌、黑色素瘤、乳腺癌、膀胱癌、肝癌、直腸癌、淋巴瘤、肺癌等惡性腫瘤的治療。用于癌性胸腹水的控制。用于手術后、放療及化療后的腫瘤治療，可增強機體免疫功能。也用于自身免疫性疾病和病毒性、細菌性疾病的治療，如乙肝、結核病。用法：1）胸腹腔注射100-200萬IU/次，每周1-2次，2-4周為一療程。2）局部注射根據癌灶大小決定劑量，每次每個病灶不少于610萬IU，隔日1次，4周為一療程。3）皮下注射60-100萬IU/m3，每日1次，每周5次，4周為一療程。4）靜脈滴注40-80萬IUIU/m3，每日1次，緩慢滴注，每周5次，4周為一療程。,毒副作用：治療中常見副反應為發熱、寒戰、乏力、惡心、輕度食欲下降等。其他少見的副反應包括局部反應、皮疹、血壓下降、水潴留、轉氨酶升高等。這些副反應多為輕度、易耐受，停藥后可自行緩解。必要時可給與消炎痛或給予升壓等措施對癥處理。,3、IL-12主要是由抗原呈遞細胞（如單核巨噬細胞、樹突細胞及B淋巴細胞產生）作用：誘導Th0分化為Th1，增強細胞免疫應答促進NK、T細胞增殖，誘導LAK、TIL產生，并增強上述細胞的殺傷功能誘導Th1、NK分泌IFN-促進巨噬細胞分泌一氧化氮，殺傷腫瘤細胞抑制腫瘤血管的生成增強腫瘤細胞表達MHC-III類分子，提高腫瘤細胞對免疫效應細胞的易感性增加抗原遞呈細胞對腫瘤抗原的遞呈功能,動物試驗：應用基因工程技術，將IL-12基因導入腫瘤細胞、樹突細胞、成纖維細胞等，制成腫瘤疫苗，使IL-12在局部分泌，誘發機體的抗腫瘤免疫。臨床試驗：重組人(rHu)IL-12治療慢性乙型肝炎，效應與劑量相關，但較大劑量較易有不良反應，IL-12能恢復由實體瘤轉移患者PBMC獲得的NK細胞活性，IL12還能增強毛細胞白血病患者NK細胞活性，IL-12抗腫瘤作用,4、IL-4主要由活化的T淋巴細胞（特別是Th2細胞）產生。作用：促進休止期的B細胞活化，促進B細胞分泌IgE，增加B細胞的抗原遞呈功能，促進體液免疫應答。維持胸腺細胞和活化T細胞的生長，誘導Th2產生，抑制Th1分泌細胞因子。誘導NK細胞增殖。激活巨噬細胞，促進其抗原遞呈和殺傷腫瘤細胞的作用。誘導外周血單個核細胞分泌M-CSF和G-CSF，增強中性粒細胞介導的吞噬、殺傷功能和抗體依賴性細胞介導的細胞毒效應（ADCC）應用：主要用于DC細胞的誘導、擴增。,5、腫瘤壞死因子TNF1）TNF-：主要來源于LPS、細菌DNA等抗原分子激活的單核巨噬細胞、其它細胞如T淋巴細胞、B淋巴細胞等產生的。作用：影響免疫反應過程影響非免疫細胞促進細胞因子分泌調控細胞凋亡全身反應2）TNF-：主要由Th1、CD8T細胞和早期的B細胞產生作用：是炎癥過程的重要組成成分,6、集落刺激因子是一種低分子量糖蛋白，能夠在體內外選擇性刺激造血干細胞增生、分化成某一譜系的細胞分類：G-CSF,M-CSF,GM-CSF,IL-3,EPO,SCF,7、胸腺素分為兩族作用：1）具有免疫增強作用，可促進T細胞、NK、LAK等細胞的增殖及殺傷活性2）參與細胞骨架的形成，通過對肌動蛋白的調節，參與某些腫瘤的轉移,（二）腫瘤的主動免疫治療,應用腫瘤抗原或模擬腫瘤抗原的疫苗刺激機體免疫系統，激發或增強機體的抗腫瘤特異性免疫應答，阻止腫瘤生長、擴散和復發。,腫瘤疫苗,腫瘤疫苗與傳統疫苗在概念上不同，它主要不是用于腫瘤的預防，而是通過瘤苗的接種來刺激機體對腫瘤的免疫應答來治療腫瘤。該法應用的前提是腫瘤抗原能刺激機體產生免疫反應。對手術后清除微小轉移瘤灶和隱匿瘤、預防腫瘤轉移和復發有較好的效果。,1、腫瘤細胞疫苗,即通過自體腫瘤細胞粗提取物，經物理化學或生物手段處理后抑制其生長能力，保持其免疫原性，需加入佐劑如卡介苗等以增強免疫原性。,2、腫瘤基因工程疫苗,腫瘤基因工程疫苗通過基因重組技術，將目的基因導入受體細胞而制備的疫苗。,2、腫瘤基因工程疫苗,1)、提高機體抗腫瘤能力,將外源基因導入免疫細胞，其表達產物作用于免疫細胞，促進免疫細胞生長、分化，從而提高機體的抗腫瘤能力。目前研究較多的是細胞因子基因的轉導，如IL-2、IL-4、IL-6、IL-12、IL-15、IL-18、IFN-以及GM-CSF等。實驗顯示，在各種細胞因子中，以GMCSF基因修飾的腫瘤細胞疫苗效果最好，這與其誘導DC成熟有關。,2)、增強腫瘤免疫原性,通過表達腫瘤所缺乏的某些分子，以增強其免疫原性。如將B7基因導入具有腫瘤抗原的腫瘤細胞，不僅能恢復腫瘤特異性免疫反應，也可增強IL-2的抗瘤活性。一些腫瘤相關抗原（TAA）基因的轉導研究，顯示也可以增強其免疫原性，如CEA、AFP、gp100、MART-1。,3)、基因產物直接殺傷瘤細胞,如TNF基因導入腫瘤細胞可使局部持續分泌TNF、從而直接殺傷腫瘤細胞。,3、肽疫苗,8-10個氨基酸的多肽是T細胞識別的基礎肽疫苗主要包括以下二種：1）、癌基因、抑癌基因突變肽疫苗目前已合成的p21-K-Ras-125突變肽、EGFRvIII突變肽和Her2/neu肽等。2）、病毒相關疫苗如EB病毒與鼻咽癌、Burkitt淋巴瘤，HBV與肝癌，人類T細胞白血病病毒與成人T細胞白血病。,Oncophage(Vitespen),通過加工、純化自體腫瘤細胞的gp96等熱休克蛋白HSP，獲得大量腫瘤抗原。一項III期臨床研究中728腎癌術后隨機分為觀察組和治療組結果：復發率觀察組治療組P值全部27.3%25.0%0.384I+II期27.0%15.2%0.056III+IV27.5%32.0%0.686中危患者*30.9%16.3%0.004中危患者*:I/II期低分化/III期高分化俄羅斯2008-4-9批準Oncophage用于中危腎癌的輔助治療。Lancet.2008(9633):145,4、核酸疫苗,核酸疫苗是由能引起保護性免疫反應的抗原基因片段及其載體構建而成。包括DNA疫苗和RNA疫苗。,4、核酸疫苗,5、抗獨特型抗體疫苗,腫瘤抗原可誘導抗體(Ab1)產生，該抗體可變區的獨特型決定簇具有免疫源性，可誘導抗體Ab2產生，稱為抗獨特性抗體。也是一種抗抗體。在這些Ab2中，有的可模擬原來的抗原結構誘導抗原的特異性免疫反應，可作為腫瘤疫苗應用。,這種疫苗的特點是，它既不是天然抗原的本身，也不是人工合成的抗原自身，而是抗原本身的“摸擬物”，當用這種疫苗接種時，機體雖然沒有直接接觸抗原，卻能產生對相應抗原的免疫應答具有抗原放大效應,已進入、期臨床的抗獨特型抗體：卵巢癌相關抗原CA125的獨特型疫苗：AcA125黑色素瘤的獨特性疫苗：BEC2、TriGem等淋巴瘤的獨特性疫苗：Id-KLH乳腺癌的獨特性疫苗：1E10結直腸癌的獨特性疫苗：105AD7,6、樹突狀細胞（DC）疫苗,腫瘤抗原屬于內源性抗原，機體主要依靠CTL免疫應答殺傷腫瘤細胞。但腫瘤細胞表面的MHC-抗原肽段復合物表達水平低，需要經體內抗原提呈細胞加工、處理，提供誘導T細胞活化的第二信號，才能激發腫瘤特異性CTL的產生。由于DC在誘導體液免疫應答和細胞免疫應答中的重要功能，目前認為，DC在啟動抗腫瘤免疫的抗原呈遞中發揮重要作用。,Dendriticcellsconnectinnateimmunityandadaptiveimmunity,人DC至少有三條來自于不同前體細胞的發育途徑：1）CD34+細胞分化為DC2）外周血單核細胞分化為DC3）淋巴樣DC前體細胞分化途徑,臨床應用治療惡性淋巴瘤,腫瘤抗原可以基因、多肽、蛋白、甚至完整細胞的形式負荷給DC，因此DC疫苗的制備明顯比基因修飾的腫瘤細胞疫苗容易，因而促進了DC疫苗進入臨床試驗。1996美國斯坦福大學的Hsu等首先采用抗獨特型抗體負荷的DC疫苗治療了4例B細胞型淋巴瘤，3例獲部分緩解。,抗原沖擊DC治療乳腺癌（I/II期臨床）,病人：高表達HER2的轉移性乳腺癌病人16例方法：HER500沖擊的自體APC2108to5109，二周一次，共三次。副作用：主要為寒戰和發熱，沒有3-4級的毒副反應結果：12個可評價的病人，1例PR結論：HER500沖擊的自體DC使用安全，有一定療效，但效率仍不夠高。J.W.Kylstra,etal.ASCO2003,治療轉移性腎癌（I/II期臨床）,病人：轉移性腎癌15例方法：腫瘤細胞溶解物沖擊的DC3.95106淋巴結內注射副作用：無明顯的毒副作用結果：7例進展，7例穩定，1例部分退縮(14.4106細胞)結論：腫瘤細胞溶解物沖擊的DC，即使在有大負荷腫瘤時也有效，在大劑量使用時更有效，無毒副作用。MartenA,etal.CancerImmunolImmunother.2002,PROVENGE(sipuleucel-T),Provenge是PA2024(GM-CSF和PAP的融合蛋白)與自身樹突狀細胞孵育后獲得的自體DC細胞疫苗。III期研究設計:127例無癥狀激素治療無效的轉移性前列腺癌患者，以2:1比例接受sipuleucel-T(2周1次，連續3次)或安慰劑治療，3月后曲線分離。JClinOncol.2006:3089,DCVax-Brain,患者DC細胞經自體腫瘤細胞刺激后獲得。膠質瘤手術聯合放化療的MS為14.6個月，TTP為6.9個月。NEnglJMed,2005:987I期和I/II期研究中發現膠質瘤經DCVax-Brain治療后（皮下注射）后，3年存活率為53%，95%的患者MS超過14.6個月，TTP超過6.9個月。,由于大多數腫瘤抗原未被識別，因此腫瘤細胞溶解物負荷的DC疫苗可使更多的患者接受此種方法治療。直接攜帶腫瘤抗原的DC作用更為直接，可以活化靜息的T細胞，誘導強烈的抗腫瘤免疫反應。,（三）腫瘤的被動免疫治療,1、單克隆抗體靶向治療又稱之為生物導彈技術，通過補體系統和自然殺傷細胞起抗腫瘤作用。,嵌合型單抗達到95以上人源化,減少了異種免疫原性。,1）抗腫瘤單克隆抗體直接體內應用很多進入臨床治療試驗，包括抗白細胞分化抗原CD19、CD20、CD22、CD33，表皮生長因子受體（EGFR），MUC1，前列腺特異性抗原（PSA），前列腺特異性膜抗原（PSMA），癌基因cerbB2產物，神經節苷酯GD3、GM2等抗原的單抗。,2）抗腫瘤單克隆抗體與抗腫瘤藥物、生物毒素、細胞因子或放射性核素偶聯：生物毒素，如假單胞菌毒素或蓖麻毒素；放射線同位素，如131I、186Re、177Lu、90Y、212Bi、67Cu、等單抗作為導向物可增加毒素、放射性同位素等在腫瘤局部的濃度，增加對腫瘤的殺傷力或誘導腫瘤局部的免疫反應。,3）基因工程抗體-毒素（或酶）融合蛋白直接殺瘤4）抗腫瘤單克隆抗體和抗效應細胞表面分子的抗體組成雙特異性抗體，可引導殺瘤效應細胞向腫瘤灶集中5)胞內抗體在腫瘤細胞內表達，特異性作用于致瘤的癌基因產物或端粒酶,2、腫瘤過繼性免疫治療向腫瘤患者體內輸注具有抗瘤活性的免疫細胞，直接殺傷腫瘤細胞或激發機體抗腫瘤免疫效應。回輸的效應細胞包括：在體外用腫瘤抗原或淋巴因子激活的淋巴細胞（CIK、TIL等）、導入外援細胞因子基因并表達相應產物的淋巴細胞等。,11)LAK細胞,LAK細胞是在1980年由美國國立癌癥研究所Rosenberg發現，并在1982年由Grimm等命名的。這是一類由IL-2激活的能夠殺傷NK抵抗的新型免疫細胞，是一種強烈的，廣譜的，具有殺瘤活性的細胞。隨后臨床上廣泛應用于腫瘤等疾病治療。但由于LAK細胞活性的維持需要IL-2，而IL-2副作用大，而且在以后的臨床總結中發現LAK細胞療效較低，現已基本不用。,2)CD3AK細胞,是在LAK細胞基礎上，用抗CD3單抗和IL-2聯合誘導的殺瘤細胞。由于使用了抗CD3單抗刺激，減少了IL-2的用量，降低LAK治療的毒副作用，且CD3AK的抗腫瘤活性大大高于LAK細胞。對晚期惡性腫瘤患者輸注自體CD3AK細胞1個療程后,實體瘤組治療有效率為25.45%,臨床獲益率為74.54%;淋巴瘤組有效率為83.33%,臨床獲益率為91.67%。,在利用外周血淋巴細胞制備免疫效應細胞的研究中，為增加效應細胞的數量和殺瘤活性，常添加一些激活劑如抗CD3單抗，植物血凝素PHA等，以提高免疫治療療效。實驗顯示PHA預刺激雖能促進IL-2激活的殺傷細胞的增殖，但對殺傷活性并無明顯改善，而培養15天以上，經PHA預刺激的P-LAK和P-CD3AK細胞殺傷活性顯著提高，且PHA與抗CD3單抗有協同效應。,3)TIL細胞（腫瘤浸潤的淋巴細胞）,腫瘤浸潤的淋巴細胞，是從新鮮的腫瘤組織中分離出來，體外經IL-2，抗CD3單抗，TNF等刺激，經20-45天培養，獲得的具有一定特異性的抗腫瘤細胞。其局限在于分離困難，體外培養時間過長。,我們于1997-1998年選擇21例癌性胸腹水患者，其中肺癌4例，乳腺癌5例，腸癌4例，骨癌7例，胰腺癌1例。所有病例均經病理學和細胞學診斷。共抽取33次胸腹水做TIL細胞培養，抽取胸水2502200ml，腹水量12004400ml。21例患者中14例經16次的TIL胸腹腔回輸治療。回輸期間隔天皮下注射IL-250萬單位。14例患者回輸治療結果顯示總有效率為78.57%，其中3例胸腹水消失，并觀察1個月無復發，1個月后檢查胸腹水無瘤細胞；8例胸腹水有明顯減少，并控制1個月以上；3例僅控制12周。,4)TAK細胞,TAK是由可溶性腫瘤抗原，抗CD3單抗和IL-2共同誘導的殺瘤細胞。用可溶性腫瘤抗原誘導細胞識別腫瘤，以提高殺瘤親和性；用抗CD3單抗誘導所有T細胞活化，培養出以CD8+T細胞為主的殺瘤細胞。TAK細胞不僅增加了殺瘤的特異性，且體外增殖快，IL-2用量低。用胃癌可溶性抗原（TSA），聯合抗CD3單抗和IL-2共同刺激正常人的外周血單核細胞，培養10天后，經流式細胞儀表型分析，表明其免疫效應細胞以CD8+T細胞為主，其細胞增殖速度，增殖水平與CD3AK和LAK相比明顯升高，且對抗原來源的胃癌細胞具有極強的殺傷活性（98.5%），高于CD3AK（82.1%）和LAK（62.05%）。,我們于1996-1998年，采用靜脈或口服化療和免疫效應細胞輸注為主體的化學免疫療法，治療晚期原發性肝癌18例。收治的38例晚期原發性肝癌病人中，18例采用化學免疫療法（甲組），同期收治的晚期肝癌患者，除對癥處理外，單用靜脈化療或肝動脈插管化療20例，列為對照組（乙組）。總緩解率（CR+PR）：甲組22.22%（4/18）乙組0%無1例緩解,5)CIK細胞,是將人外周血單個核細胞經體外用各種細胞因子共同刺激培養所獲得的免疫細胞。由于同時表達CD3和CD56分子，故又稱為NK樣T細胞，CIK細胞兼具有T淋巴細胞強大的抗瘤活性和NK細胞的非MHC限制性殺瘤特點，其抗腫瘤活性遠大于LAK和TIL。因此被認為是新一代腫瘤過繼細胞免疫治療的首選方案。刺激因子除了抗CD3單抗、IL-2外，還需用IFN-和IL-1等細胞因子。,CIK細胞殺傷機制,、識別由于CIK的細胞殺傷作用是非MHC限制性的，故CD4、CD8在其識別腫瘤細胞或病毒感染的細胞過程中并非必不可少。細胞表面粘附分子LFA-1ICAM-1在CIK細胞識別過程中起關鍵作用。對正常細胞無毒性作用。,、殺傷細胞對腫瘤細胞或感染細胞的直接殺傷：CIK細胞在受到外源性抗原或敏感靶細胞刺激時會釋放具有細胞毒性的胞漿顆粒物到膜外空間，其中細胞可產生最大的顆粒釋放量。這些胞漿顆粒物對靶細胞具有直接殺傷作用。炎性細胞因子的殺傷活性：培養的細胞可以分泌多種細胞因子，如、（腫瘤壞死因子）、等，不僅對靶細胞有直接抑制作用，還可通過調節機體免疫系統反應性間接殺傷靶細胞。誘導腫瘤細胞凋亡：細胞在培養過程中表達（型跨膜糖蛋白），一方面增強了其對腫瘤細胞引發的凋亡的抵抗性，還可通過對（型跨膜糖蛋白）腫瘤細胞誘導凋亡行使其對腫瘤細胞的慢性殺傷作用，保證抗瘤活性的長期持久。,CIK細胞的殺瘤特點,1、增殖速度快CIK細胞中的效應細胞CD3+CD56+細胞在正常人外周血中極其罕見，僅1%5%，在體外經多因子培養2830天，CD3+CD56+細胞迅速增多，較培養前升幅可達1000倍以上。且所占百分比也大幅上升，細胞毒活性亦達峰值。2、殺傷活性高、殺瘤譜廣CIK細胞的總殺傷單位（TLU）為LAK細胞的73倍甚至更高，CIK細胞的瘤細胞抑制Log指數為2.53.5，較LAK細胞的瘤細胞抑制指數高2個Log。其抗病毒活性大大增強。因沒有T淋巴細胞殺傷時的MHC限制性，故對于多種腫瘤細胞系和新鮮腫瘤組織均表現出強大的殺傷活性。3、對多重耐藥腫瘤細胞同樣敏感CIK細胞對化療藥物敏感的親本細胞和不敏感的轉化細胞均具有強大的殺傷活性，兩者比較無差別。4、殺瘤活性不受CsA、FK506等免疫抑制劑的影響免疫抑制劑CsA（環孢霉素A）和FK506（普樂可復）不影響靶細胞誘導的CIK細胞脫顆粒，并且CIK細胞對靶細胞的殺傷活性不會因此降低。5、對正常骨髓造血前體細胞毒性很小CIK細胞對正常髓系克隆生成幾乎沒有影響，對GM-CFU（粒細胞巨噬細胞集落形成單位）僅有不足1級的抑制。6、能抵抗腫瘤細胞引發的效應細胞Fas-FasL凋亡CIK細胞內有抗凋亡基因表達，并檢出多種保護基因，如Bcl-2等和survivin的轉錄水平上調。CIK細胞具備合成FasL的能力，CIK細胞可以對抗體內FasL陽性腫瘤所引發的效應細胞活性下降。,CIK制備,采集：外周血單個核細胞。分離：PBMNC經淋巴細胞分離液分離、洗滌后懸浮于含10%AB血清的RPMI1640中。培養：第一天培養加入-IFN1000U/ml，24小時后加入IL-21000U/ml，在37，5%CO2孵箱中培養。以后每3天更換培養液補加IL-21000U/ml；培養710天。無菌檢測：細菌霉菌培養陰性；熱源檢測陰性。收獲：收集細胞，加入含1%白蛋白的生理鹽水洗滌。回輸：洗滌后的細胞懸浮于1%白蛋白生理鹽水中，將CIK細胞通過輸血器經靜脈輸給患者。療程：培養的第8-10天開始，分八袋回輸，每次間隔1-2天。自回輸CIK細胞前一天起,可每日靜脈輸注IL-2，每日劑量為100萬單位直到回輸結束。,臨床應用,體內回輸CIK細胞,可以在沒有損傷機體免疫系統結構和功能的前提下,直接殺傷腫瘤細胞,并可調節和增強機體的免疫功能。特別適應于那些對手術、放療、化療已無適應證的晚期腫瘤患者,因而成為治療腫瘤的重要輔助治療方法,為預防腫瘤復發、改善生存質量提供了新途徑。一般在放療、化療后間隔24周,機體免疫力有所恢復時,輸入CIK細胞,可提高腫瘤患者的緩解率并在清除微小殘留病灶方面發揮重要作用。,6)DC-CIK,將外周血來源的CIK細胞和同源DC細胞共培養一段時間后發現,DC和CIK細胞的增殖能力明顯增強,共培養14d后CIK細胞的增殖倍數比共培養7d時高出2倍左右。共培養24h后,DC細胞白細胞介素12的分泌量為單獨培養時的6.93倍,與DC細胞共培養的CIK細胞對腫瘤細胞的殺傷活性顯著提高。,DC-CIK制備流程,7)NK細胞,自然殺傷細胞(naturalkillercell,NK)細胞不經致敏可直接殺傷敏感的腫瘤細胞,是宿主抗腫瘤的第一道防線。,自然殺傷細胞(黃色)在它們嚴重破壞機體之前識別并殺死癌細胞(粉紅色)或病毒感染的細胞,NK細胞受體和配體,中國腫瘤臨床2013,40卷,90例食管癌中晚期患者（TNMIII-IV期）接受枯息性手術后，分為單純化療組40例、化療聯合NK細胞治療MCIA陰性組（簡稱聯合MICA-組）25例及化療聯合NK細胞治療MCIA陽性組（簡稱聯合MICA+組）25例。,中國腫瘤生物治療雜志2013,20卷,體細胞免疫治療聯合腫瘤常規治療的基本方案,惡性腫瘤,手術治療,可手術,放化療敏感（常規放化療）放化療間隙聯合細胞免疫治療（卵巢癌、乳腺癌、小細胞肺癌和鼻咽癌等）,放化療不敏感（腎癌、前列腺癌、黑色素瘤和肝癌等）,放化療敏感（常規放化療）放化療間隙聯合細胞免疫治療（卵巢癌、乳腺癌、小細胞肺癌和鼻咽癌等）,細胞免疫治療,疾病穩定期,細胞免疫治療聯合內分泌或靶向治療，細胞因子治療,專科治療（微創介入）,不能手術（期，期）復發者,細胞免疫治療,疾病穩定期,化療不敏感（原發性肝癌、腎癌、前列腺癌和黑色素瘤等）,細胞免疫治療聯合專科治療,CIK輸注不良反應,免疫活性細胞回輸后患者可出現一過性類流感樣癥狀，如發熱（體溫37.539.5），輕度頭痛、乏力、關節酸痛，持續時間均不超過12h，可自行緩解，所有患者均能很好耐受治療。,3、過繼性免疫效應細胞治療的優點(1)免疫細胞在體外處理，可繞過體內腫瘤免疫障礙的種種機制，從而選擇性地操作抗腫瘤免疫反應:如新鮮分離的腫瘤浸潤性淋巴細胞（tumorinfiltratinglymphocyte，TIL）往往缺乏抗腫瘤效應，而在體外一定條件下培養一段時間后可恢復特異性抗腫瘤作用；在體外培養條件下，腫瘤抗原特異性耐受的免疫細胞可被逆轉。,(2)免疫細胞的活化及效應過程往往由一些細胞因子介導，而目前基因工程可大量克隆不同的細胞因子，也可大量克隆腫瘤抗原或多肽，這使體外活化擴增大量的抗腫瘤免疫細胞更為可行方便。,(3)免疫細胞的體外活化擴增可避免一些制劑體內大量應用帶來的嚴重毒副作用，如:IL2、TNF、IL4、IL7、IL12等具有抗腫瘤作用，抗CD3單克隆抗體(MabCD3)的體內應用可激活T淋巴細胞，但這些制劑由于其復雜的多種作用，在體內大量應用可導致嚴重的甚至致死性副作用，這也是這些因子難以被批準臨床使用的重要原因，而在體外操作可避免這些副作用。,(4)目前已能在體外大量擴增自體或異基因的抗腫瘤免疫細胞，其數量大于腫瘤疫苗在體內激活的效應細胞數，一些體外培養的免疫細胞已進入臨床治療試驗。實驗顯示腫瘤疫苗在體內應用可增加體內的腫瘤特異性CTL數量，但到一定時候，體內的CTL到達平臺期而不再增加，這主要由體內存在的特異性及非特異性免疫調節網絡限制了CTL克隆的擴增。而在體外培養可突破此調節網絡，大量擴增免疫效應細胞。,理想的過繼性免疫細胞治療應具有以下特點:(1)可大量獲得，實驗室研究及臨床實踐顯示，臨床治療量的免疫細胞應在11010以上(2)為腫瘤特異性(3)抗腫瘤活性強(4)體內應用可耐受(5)可聚集在腫瘤灶(6)可在體內存活、增殖,二、免疫治療的作用,腫瘤免疫治療即能夠直接清除體內的殘存腫瘤細胞，又能夠提高機體的整體免疫功能，還具有將患者個體化的腫瘤抗原信息遞呈給體內腫瘤免疫殺傷細胞的獨特作用。腫瘤免疫治療已成為臨床上繼手術、化療、放療之后的第四種最有效的腫瘤治療方法。在腫瘤綜合治療方案中，免疫治療成為提高腫瘤治愈率和有效率的一個關鍵措施。,三、免疫治療的臨床地位,免疫治療是最有前途的抗腫瘤手段之一目前尚未起主導作用定位于手術、放化療后清除殘留病灶目標是預防復發關鍵是抗原在體內有效地被遞呈并激活T淋巴細胞,四、免疫治療的原則,雖然目前免疫治療的方法還不是很有效的，只能配合其他療法作為一種輔助手段。但從腫瘤免疫的理論看，它涉及的是腫瘤發生發展的內部因素和內部矛盾性。隨著它的迅速發展，為腫瘤的免疫治療提出了廣泛的可能。從宿主與腫瘤相互斗爭這一矛盾出發，從增強宿主對腫瘤的免疫能力，以及消除腫瘤對免疫功能的抑制兩個方面入手，并繼續在增強機體非特異性免疫能力方面進行研究，腫瘤的免疫治療是大有希望的。,1、增強宿主對腫瘤的免疫能力：1）提純改造抗原，提高抗原的免疫作用2）發揮細胞免疫的作用進行過繼免疫治療3）利用細胞因子激活抗腫瘤免疫4）抗體導向治療2、消除腫瘤對免疫的對抗如何清除免疫抑制因子的作用，是腫瘤免疫治療很有希望的一個方面。,五、免疫治療的評價,1、臨床評價：病灶變化-臨床查體和影像學檢查（CT、MRI、B超、等）內鏡檢查腫瘤標志物肝功、腎功、血象等的改善其他,腫瘤標志物（tumormarkers,TM),1978年NCI提出1979年確認并開始使用TM是表示腫瘤存在并反映其一定的生物特性的生化物質TM主要是指那些在血液、體液及組織中可檢測到的與腫瘤相關的物質，這些物質達到一定的水平時能揭示某些腫瘤的存在。TM的臨床意義：（1）診斷（2）復發（3）判斷療效（4）預后,常用腫瘤標志物,甲胎蛋白（AFP）癌胚抗原（CEA）糖類抗原（CA50、CA125、CA15-3、CA199、CA242、CA72-4）2-微球蛋白（2-MG）鐵蛋白（Ft）細胞角質素片段抗原21-1（CYFRA21-1）神經元特異性烯醇化酶（NSE）鱗狀上皮癌相關抗原（SCC-Ag）前列腺特異抗原（PSA）前列腺酸性磷酸酶（PAP）核基質,2、免疫監測-觀察CTL的反應、認定CTL反應的細胞類型、等，從而評價機體對免疫治療的反應1）遲發超敏試驗（DTH）-體內抗原特異性免疫監測技術2）機體免疫功能檢測體液免疫指標：定量分析抗原特異性抗體的數量和功能檢驗科細胞免疫功能：FCM技術檢測淋巴細胞表面標志CD3、CD4、CD8、CD19、CD28、CD16/CD56、CD25、HLA-DR、等等。實驗室Th1、Th2類因子檢測：應用FCM-CBA技術，采用磁珠微陣列技術，同時測定血清中46種免疫相關因子的水平實驗室,3）T細胞增殖反應-3H測定法4）T細胞毒性檢測：51Cr釋放試驗LDHMTT（WST-1）5）T細胞限制性稀釋分析法（LDA）-分析未知頻率的淋巴細胞克隆、定量檢測外周血中最初抗原T特異性淋巴細胞的數目或頻率。操作復雜，被ELISPOT等新技術所取代,6）細胞因子檢測-測定T淋巴細胞分泌的因子ELISA（酶聯免疫技術）-檢測T淋巴細胞分泌于細胞外的因子ELISPOT（酶聯免疫斑點技術）-檢測T淋巴細胞分泌于細胞外的因子FCM（流式細胞術）-檢測T淋巴細胞胞內細胞因子,7）其他P-MHCtetramer技術-檢測細胞表面受體（TCR）與MHC分子遞呈的多肽的相互作用定量PCR技術-檢測細胞因子基因、T細胞受體復合物基因等表達水平，反應T淋巴細胞功能狀態,六、腫瘤免疫治療的新進展,1、免疫卡控點抑制劑CheckpoimtinhibitorCTLA4、PD-1、PD-L12、TCR-T和CAR-T,T,B7,CD28,MHC-I,Ag,TCR,TCR,Ag,MHC-I,IL-2,APC,Tumor,T,T,T,T,T,耐受,激活,CD28,協同刺激分子作用示意圖,T,1、T細胞免疫卡控點治療,有兩種受體存在于T細胞表面B7CD28低親和力受體CTLA-4高親和力受體B7傳遞陽性或陰性信號決定于T細胞上的配基B7-CD28結合:產生陽性信號，增強免疫反應。封閉CD28依賴的T細胞激活，下調免疫反應。B7-CTLA-4結合:產生陰性信號，下調免疫反應。封閉CTLA-4促進抗腫瘤反應。,TheBiologyofCancer,抗CTLA-4抗體治療黑色素瘤肺轉移患者,Ipilimumab治療復治轉移性黑色素瘤(fullyhuman,IgG1monoclonalantibody,anti-CTLA-4),結果提示：Ipilimumab能夠延長轉移性黑色素瘤患者的總生存，故2011年通過FDA批準用于治療轉移性黑色素瘤。,入組標準：二線治療（化療或細胞因子治療失敗）；HLA-A*0201排除標準：既往CTLA-4抗體或疫苗治療；免疫抑制劑或自身免疫疾病；腦轉移、脈絡膜黑色素瘤,EarlyResponsetoTherapy,CancerInvestigation,30:712720,2012,Gradual/DelayedResponse,CancerInvestigation,30:712720,2012,2011年，Nature雜志指出：“腫瘤免疫治療的時代已經來臨”。,抗PD-1抗體治療黑色素瘤肺、肝轉移患者,Thenewenglandjournalofmedicine,CD8+,RECIST，為38%（44/117例）,CheckpointInhibitor:Nivolumab(BMS-936558)(fullyhuman,IgG4monoclonalantibody,anti-PD-1),DurableORwasobservedinpatientswithmelanoma,NSCLCandRCC.,該研究中NSCLC患者的給藥濃度分別為1mg/kg、3mg/kg和10mg/kg；76例可評價療效NSCLC患者的ORR達18%；鱗癌與非鱗癌患者的ORR分別為33%(6/18)和12%(7/58)。,2、TCR-T和CAR-T,基本概念,1、T細胞（抗原）受體（Tcellreceptor,TCR）TCR為所有T細胞表面的特征性標志，以非共價鍵與CD3結合，形成TCRCD3復合物。TCR的作用是識別抗原。2、TCR-TTCR基因轉染的T細胞免疫治療3、嵌合抗原受體(CAR)是通過基因改造的T細胞抗原受體，賦予T細胞HLA非依賴的方式識別腫瘤抗原的能力，CAR的基礎設計中包括一個腫瘤相關抗原（tumor-associatedantigen，TAA）結合區（通常來源于單克隆抗體抗原結合區域的scFV段），一個胞外鉸鏈區，一個跨膜區和一個胞內信號區。目標抗原的選擇對于CAR的特異性、有效性以及基因改造T細胞自身的安全性來講都是關鍵的決定因素。4、CAR-T全稱是ChimericAntigenReceptorT-CellImmunotherapy，嵌合抗原受體T細胞免疫療法。經過CAR改造的T細胞相較于天然T細胞表面受體TCR能夠識別更廣泛的目標。,TCR轉染CTL細胞治療,轉導識別特異性腫瘤抗原的TCR基因至T細胞，強制性其表達獨特性TCR，經大量擴增，成為具備特異性殺傷活性的CTL，識別并殺傷攜帶相應腫瘤抗原的腫瘤細胞。,InaHLA-dependentway,嵌合體抗原受體（CAR）改造的CTL細胞治療,嵌合抗原受體(CAR)是將識別腫瘤相關抗原(TAA)的單鏈抗體和T細胞的活化序列結合為一體，通過基因轉導方法轉染T淋巴細胞，使其能特異性地識別和殺傷腫瘤細胞。,nonHLA-dependentway,TCR與CAR的結構比較,4-1BB，OX-40,受MHC限制性,不受MHC限制,aCD19,Fig2.Completeremissions(CRs)ofchemotherapyrefractorylarge-celllymphomasinpatientsreceivinganti-CD19chimericantigenreceptorTcells.(A)Positronemissiontomography(PET)/computedtomography(CT)scansshowCRofche