2013年9月,一種新的膀胱癌原位移植瘤動(dòng)物模型的建立Anewmethodofestablishingorthotopicbladdertumorinmiceforexperimentaltherapies,一、研究目的和意義,膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，術(shù)后高復(fù)發(fā)率是臨床治療失敗的主要原因。根據(jù)膀胱癌易復(fù)發(fā)的特點(diǎn)，行術(shù)后藥物膀胱灌注可以達(dá)到清除殘余瘤體，預(yù)防復(fù)發(fā)的目的。,因此尋找一種能有效清除膀胱癌術(shù)后殘余瘤體的藥物具有重要意義。研究藥物在動(dòng)物體內(nèi)對(duì)膀胱癌術(shù)后復(fù)發(fā)的預(yù)防效果，首先必須建立一種簡(jiǎn)便、穩(wěn)定、可靠的膀胱癌原位移植瘤動(dòng)物模型。,原位膀胱癌動(dòng)物模型的制備方法,目前常用的制備膀胱癌原位移植瘤動(dòng)物模型的方法按接種方法不同可分為四種：1.將致癌劑注入膀胱腔內(nèi)引發(fā)腫瘤。缺點(diǎn)：腫瘤多發(fā)，且定位不確定。2.將化學(xué)物質(zhì)（酸、堿或酶）注入膀胱腔內(nèi)造成膀胱粘膜損傷后再注入腫瘤細(xì)胞。缺點(diǎn)：成瘤率低、操作繁雜，損傷面積大，可能造成嚴(yán)重并發(fā)癥，對(duì)動(dòng)物損傷非常大。3.經(jīng)腹部膀胱壁內(nèi)注射腫瘤細(xì)胞。缺點(diǎn)：需要手術(shù)，操作復(fù)雜，對(duì)動(dòng)物損傷嚴(yán)重，且腫瘤細(xì)胞易漏入盆腔和腹腔。,原位膀胱癌動(dòng)物模型的制備方法,4.用機(jī)械方法造成膀胱粘膜損傷后再灌注腫瘤細(xì)胞該方法對(duì)動(dòng)物損傷小；腫瘤細(xì)胞可以定植在損傷部位，因此成瘤部位確定；且該模型與臨床膀胱腫瘤病理過(guò)程相似，能準(zhǔn)確反應(yīng)出腫瘤的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)。,原位膀胱癌動(dòng)物模型的制備方法,（1）楊慎敏等采取腹正中切口，暴露膀胱，自尿道插入動(dòng)脈穿刺套管針套管，插入針芯，在直視下用小鑷子提起膀胱并輕輕移動(dòng)，使針芯劃傷膀胱左側(cè)壁23次，退出針芯，注入腫瘤細(xì)胞。缺點(diǎn)：需要進(jìn)行手術(shù)，操作復(fù)雜，對(duì)動(dòng)物損傷嚴(yán)重。（2）BissonJF等將自制的摩擦裝置通過(guò)套管經(jīng)尿道置入膀胱，感覺(jué)針頭抵達(dá)膀胱壁后用針芯旋轉(zhuǎn)損傷膀胱粘膜，然后注入腫瘤細(xì)胞。缺點(diǎn)：未對(duì)針芯旋轉(zhuǎn)的程度給予限制，造成的膀胱粘膜損傷無(wú)可控性。,我們采用偏角針膀胱粘膜損傷方法，成功建立了膀胱癌原位移植瘤動(dòng)物模型，為膀胱癌防治研究提供了一種有實(shí)用價(jià)值的膀胱癌動(dòng)物模型的制備方法。應(yīng)用該造模方法成功驗(yàn)證了我們研制的一種膀胱灌注液（蘇復(fù)寧洗液）預(yù)防膀胱癌術(shù)后復(fù)發(fā)的作用效果。,材料與方法,1.偏角針的制備,24#靜脈留置針，取出針芯，在距針尖15mm處將針芯折約5-7度的偏角，旋轉(zhuǎn)針芯時(shí)針尖處可形成=2.613.66mm的圓。,24#靜脈留置針,2.細(xì)胞株及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇,小鼠膀胱癌細(xì)胞株BTT，由山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)院泌尿外科楊曉峰教授惠贈(zèng)。T739近交系小鼠，雌性，46周齡，SPF級(jí)，購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號(hào)：SCXK(京)2009-0004。人膀胱癌細(xì)胞株T24，購(gòu)自中科院上海生命科學(xué)研究院。BALB/c-nu-nu裸鼠，雌性，46周齡，SPF級(jí)，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK(京)2009-0017。,3.腫瘤細(xì)胞原位接種方法,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,下腹部常規(guī)消毒,經(jīng)尿道口緩慢插入膀胱腔內(nèi),一手固定套管，另一手轉(zhuǎn)動(dòng)針芯5周,偏角針緩慢插入套管中,麻醉,戊巴比妥鈉60mg/kg,24#靜脈留置針套管外涂以液體石蠟,抽出尿液,拔出針芯,注入腫瘤細(xì)胞懸液0.1ml（含有1107個(gè)細(xì)胞）,待動(dòng)物自然蘇醒,拔出套管,實(shí)驗(yàn)組,對(duì)照組,圖1膀胱粘膜未損傷與損傷后的小鼠膀胱（充盈）（左：膀胱粘膜未損傷；右：膀胱粘膜損傷）,4.觀察方法,接種后動(dòng)物常規(guī)飼養(yǎng)，觀察動(dòng)物的活動(dòng)、體重變化，記錄動(dòng)物生存時(shí)間，動(dòng)物自然死亡后解剖，觀察兩種方法造模后膀胱腔內(nèi)有無(wú)腫瘤形成、腫瘤轉(zhuǎn)移及血尿形成，剖取膀胱，并對(duì)膀胱及有腫瘤轉(zhuǎn)移的臟器以10%甲醛溶液固定后作病理檢查。,表1偏角針損傷與不損傷膀胱粘膜的膀胱原位移植瘤成瘤率比較,結(jié)果,1.腫瘤形成情況,圖2膀胱早期與晚期腫瘤(左：早期膀胱腫瘤；右：晚期膀胱腫瘤),早期腫瘤較為表淺，晚期腫瘤充滿整個(gè)膀胱。,圖3原位膀胱癌肝轉(zhuǎn)移與腎轉(zhuǎn)移(左：肝臟轉(zhuǎn)移；右：腎臟轉(zhuǎn)移),2.腫瘤轉(zhuǎn)移情況,T739小鼠接種后有23%的動(dòng)物肉眼可見(jiàn)肝臟、腎臟、腸系膜、腹膜等處有轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移灶可為多處或單處，同時(shí)伴有血性腹水，腹腔內(nèi)有粘連現(xiàn)象。BALB/c-nu-nu裸鼠只有一只可見(jiàn)腎臟轉(zhuǎn)移。,圖4T739小鼠與Balb/C-nu-nu裸鼠生存時(shí)間圖(左：T739小鼠；右：Balb/C-nu-nu裸鼠),3.動(dòng)物生存時(shí)間,表3膀胱原位移植瘤模型動(dòng)物平均生存時(shí)間,圖5膀胱腫瘤及肝腎轉(zhuǎn)移病理學(xué)形態(tài),A正常膀胱(100),C晚期原位膀胱腫瘤(100),B早期原位膀胱腫瘤(100),D腎臟轉(zhuǎn)移(200),4.病理學(xué)檢查結(jié)果,討論,偏角針旋轉(zhuǎn)可以在膀胱粘膜上形成一個(gè)均衡的損傷。接種早期即可有大量的腫瘤細(xì)胞定植，在較短時(shí)間內(nèi)就可形成腫瘤并發(fā)生臟器轉(zhuǎn)移。制備偏角針?biāo)捎玫?4#靜脈留置針為標(biāo)準(zhǔn)的醫(yī)用器械，易于獲得且標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一偏角針的制備方法簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單，對(duì)