1.2基因工程的基本操作程序,1,基因工程基本操作的四個步驟,1、目的基因的獲取,2、基因表達載體的構建,3、將目的基因導入受體細胞,4、目的基因的檢測與鑒定,2,一、目的基因的獲取,(一)、目的基因主要是_,編碼蛋白質的結構基因,請舉出三個以上的例子,（二）、獲取目的基因的常用方法有哪些?,1、從基因文庫中獲取,2、利用PCR技術擴增,3、人工合成,請閱讀P9第一和二兩段,3,限制酶,基因組DNA,基因重組,轉化細菌,體外包裝,1)基因組文庫(Genomiclibrary),是指將某種生物體的全部基因組DNA用限制性內切酶或機械力量切割成一定長度范圍的DNA片段，再與合適的載體在體外重組后，導入受體菌的群體中儲存，這個群體就稱為該生物基因組文庫。其目的是分離有用的目的基因和保存某種生物的全部基因。,一、目的基因的獲取,（一）從基因文庫中直接獲取,1.基因文庫,4,一、目的基因的獲取,（一）從基因文庫中直接獲取,1.基因文庫,cDNA(互補DNA)：是由生物的某一特定器官或特定發育時期細胞內的mRNA經體外反轉錄后形成的互補DNA片段，與載體連接后儲存在一個受體菌群中，這個受體菌群就叫做這種生物的cDNA文庫,2)cDNA文庫(cDNAlibrary),基因重組,反轉錄酶,mRNA,cDNA,5,一、目的基因的獲取,（一）從基因文庫中直接獲取,按照外源DNA片段的來源：從特定組織提取的染色體基因組DNA-基因組DNA文庫（總）mRNA反轉錄成的cDNA拷貝-cDNA文庫（部分）,基因文庫的目的,為了在不知目的基因序列的情況下，便于獲得所需的目的基因。,基因文庫的分類,6,2.基因文庫的構建方法,：直接分離法,供體細胞中的DNA,許多DNA片段,運載體,限制酶,受體細胞,產生特定性狀,導入,外源DNA擴增,目的基因,分離,(鳥槍法),一、目的基因的獲取,（一）從基因文庫中直接獲取,多用于原核生物,7,逆轉錄法,目的基因的信使RNA,目的基因,化學合成法,肽鏈氨基酸序列,信使RNA序列,基因的核苷酸序列,目的基因,合成,逆轉錄,2.基因文庫的構建方法,一、目的基因的獲取,（一）從基因文庫中直接獲取,人工合成法（真核生物）,推測,推測,單鏈DNA,合成,8,基因組文庫的構建,（2）.基因文庫的構建方法,通過對受體菌的培養而儲存基因,9,cDNA文庫的構建-反轉錄法：以目的基因轉錄成的信使RNA為模板，反轉錄成互補的單鏈DNA，然后在酶的作用下合成雙鏈DNA，從而獲得所需的基因。,目的基因的mRNA,單鏈DNA,反轉錄酶,DNA聚合酶,雙鏈DNA(目的基因),10,基因組文庫和部分基因組文庫(cDNA文庫)比較,11,怎樣從基因文庫中得到我們所需的目的基因呢?,12,依據：目的基因的有關信息。如：根據基因的核苷酸序列基因的功能基因在染色體上的位置基因的轉錄產物mRNA基因翻譯產物蛋白質等特性,從基因文庫中得到目的基因的方法,13,2、利用PCR技術擴增目的基因,14,概念：PCR全稱為_，是一項在生物_復制_的核酸合成技術,條件：_、_、_、_.等,原理：_,方式：以_方式擴增，即_（n為擴增循環的次數）,結果：,聚合酶鏈式反應,體外,特定DNA片段,DNA復制,四種脫氧核苷酸,一對引物,DNA聚合酶,指數,2n,使目的基因的片段在短時間內成百萬倍地擴增,要有一段已知目的基因的核苷酸序列（前提條件）,15,過程：,a、DNA變性（90-95）：雙鏈DNA模板在熱作用下，_斷裂，形成_,b、退火（復性55-65）：系統溫度降低，引物與DNA模板結合，形成局部_。,c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用下，合成與模板互補的_。,氫鍵,單鏈DNA,雙鏈,DNA鏈,16,17,3、人工合成法：,基因較小，核苷酸序列已知，可以利用DNA合成儀人工合成,18,1、原核細胞的基因結構,非編碼區,非編碼區,編碼區,編碼區上游,編碼區下游,與RNA聚合酶結合位點,啟動子,終止子,啟動子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片斷，它是RNA聚合酶識別和結合的部位，有了它才能驅動基因轉錄出mRNA，最終獲得蛋白質終止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷，能終止mRNA的轉錄,19,1、原核細胞的基因結構,非編碼區,非編碼區,編碼區,編碼區上游,編碼區下游,與RNA聚合酶結合位點,啟動子,終止子,RNA聚合酶:能夠識別啟動子上結合位點的一種蛋白質.,20,RNA聚合酶能夠識別調控序列中的結合位點，并與其結合。,轉錄開始后，RNA聚合酶沿DNA分子移動，并以DNA分子的一條鏈為模板合成RNA。,轉錄完畢后，RNA鏈釋放出來，緊接著RNA聚合酶也從DNA模板鏈上脫落下來。,21,不能轉錄為信使RNA，不能編碼蛋白質。,：能轉錄相應的信使RNA，能編碼蛋白質,編碼區,非編碼區,原核細胞的基因結構,有調控遺傳信息表達的核苷酸序列.包括啟動子和終止子,非編碼區,非編碼區,編碼區,編碼區上游,編碼區下游,啟動子,終止子,22,2、真核細胞的基因結構,編碼區,與RNA聚合酶結合位點,內含子,外顯子,能夠編碼蛋白質的序列叫做外顯子,不能夠編碼蛋白質的序列叫做內含子,啟動子,終止子,編碼區上游,編碼區下游,內含子：,外顯子：,23,真核細胞的基因結構,編碼區,非編碼區,外顯子：能編碼蛋白質的序列內含子：不能編碼蛋白質的序列,：有調控作用的核苷酸序列，包括位于編碼區上游的RNA聚合酶結合位點（啟動子）。,非編碼序列：,包括非編碼區和內含子,24,3、原核細胞與真核細胞的基因結構比較,思考,編碼相同數目氨基酸的蛋白質，原核細胞與真核細胞基因結構一樣長嗎？,連續,不連續,編碼區,非編碼,25,二、基因表達載體的構建基因工程的核心,1、目的：所需物質：,使目的基因在受體細胞中穩定存在，并且可以遺傳給下一代，同時使目的基因能夠表達和發揮作用。,它們各自的作用是什么?,26,2、基因表達載體的組成：,復制原點+目的基因+啟動子+終止子+標記基因,它們各自的作用是什么?,27,啟動子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片斷，它是RNA聚合酶識別和結合的部位，有了它才能驅動基因轉錄出mRNA，最終獲得蛋白質終止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷，能終止mRNA的轉錄標記基因的作用是為了鑒別受體細胞中是否含有目的基因，從而將有目的基因的細胞篩選出來,28,載體與表達載體的區別：二者都有標記基因和復制原點兩部分DNA片段。表達載體在載體基礎上增加了目的基因、啟動子、終止子三部分結構用到的工具酶：既用到限制酶切割載體，又用到DNA連接酶將目的基因和載體拼接，兩種酶作用的化學鍵都是磷酸二酯鍵啟動子、終止子對于目的基因表達必不可少目的基因不能單獨進入受體細胞，必需以表達載體的方式攜帶進去。,注意,29,三將目的基因導入受體細胞,（一）轉化：,（二）方法,將目的基因導入植物細胞,將目的基因導入動物細胞,將目的基因導入微生物細胞,農桿菌轉化法,基因槍法,花粉管通道法,顯微注射法,感受態細胞,目的基因進入_內，并且在受體細胞內維持_和_的過程,受體細胞,穩定,表達,30,1、將目的基因導入植物細胞的方法：（1）農桿菌轉化法農桿菌特點：,易感染雙子葉植物和裸子植物，對大多數單子葉植物沒有感染能力,原理：Ti質粒上的T-DNA可以轉移到受體細胞，并整合到受體細胞染色體的DNA上。,31,過程：,優點,32,（2）基因槍法（3）花粉管通道法,33,2、將目的基因導入動物細胞方法：顯微注射法程序：,目的基因表達載體提純取卵（受精卵）顯微注射受精卵新性狀動物,34,3、將目的基因導入微生物細胞原核生物特點：繁殖快、單細胞、遺傳物質少方法：,用Ca2+處理細胞感受態細胞表達載體與感受態細胞混合感受態細胞吸收DNA分子,35,四、目的基因的檢測與鑒定,檢查是否成功,36,（一）、檢測,1、檢測轉基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因,.首先取出轉基因生物的基因組DNA.用含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作標記,以此做探針.使探針和轉基因生物的基因組雜交,若顯示出雜交帶,表明染色體已插入染色體DNA中,（1）方法:,DNA分子雜交,（2）過程:,37,歸納步驟,38,DNA分子雜交示意圖,采用一定的技術手段，將兩種生物的DNA分子的單鏈放在一起，如果這兩個單鏈具有互補的堿基序列，那么，互補的堿基序列就會結合在一起，形成雜合雙鏈區；在沒有互補堿基序列的部位，仍然是兩條游離的單鏈。,P15思考與探究,39,（二）、鑒定（個體生物學水平）,2、檢測目的基因是否轉錄出了mRNA,3、檢測目的基因是否翻譯成蛋白質,抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等,方法:,分子雜交,方法:,抗原抗體雜交,過程:用上述探針和轉基因生物的mRNA雜交,若出現雜交帶,表明目的基因轉錄出了mRNA,40,歸納步驟,41,歸納:基因工程的基本操作程序,獲取目的基因從基因文庫利用PCR化學方法人工合成構建基因表達載體目的基因、啟動子、終止子、標記基因將目的基因導入受體細胞農桿菌轉化法、顯微注射法目的基因的檢測與鑒定檢測：是否插入、轉錄、翻譯鑒定：,42,練習1：(2008理綜山東卷)為擴大可耕地面積，增加糧食產量，黃河三角洲等鹽堿地的開發利用備受關注。我國科學家應用耐鹽基因培育出了耐鹽水稻新品系。（1）獲得耐鹽基因后，構建重組DNA分子所用的限制性內切酶作用于圖中的處，DNA連接酶作用于處。（填“a”或“b”）,43,練習1：(2008理綜山東卷)為擴大可耕地面積，增加糧食產量，黃河三角洲等鹽堿地的開發利用備受關注。我國科學家應用耐鹽基因培育出了耐鹽水稻新品系。（2）將重組DNA分子導入水稻受體細胞的常用方法有農桿菌轉化法和法。（3）由導入目的基因的水稻細胞培養成植株需要利用技術，該技術的核心是和。（4）為了確定耐鹽轉基因水稻是否培育成功，既要用放射性同位素標記的作探針進行分子雜交檢測，又要用方法從個體水平鑒定水稻植株的耐鹽性。,44,答案：（1）aa（2）基因槍法（花粉管通道法）（3）植物組織培養（1分）脫分化（去分化）再分化（4）耐鹽基因（目的基因）一定濃度鹽水澆灌（移栽到鹽堿地中）,45,1）以下說法正確的是（）A、所有的限制酶只能識別一種特定的核苷酸序列B、質粒是基因工程中唯一的運載體C、運載體必須具備的條件之一是：具有多個限制酶切點，以便與外源基因連接D、基因控制的性狀都能在后代表現出來,C,練習,46,2）不屬于質粒被選為基因運載體的理由是A、能復制（）B、有多個限制酶切點C、具有標記基因D、它是環狀DNA,D,練習,47,3）有關基因工程的敘述中，錯誤的是（）A、DNA連接酶將黏性末端的堿基對連接起來B、限制性內切酶用于目的基因的獲得C、目的基因須由運載體導入受體細胞D、人工合成目的基因不用限制性內切酶,A,練習,48,4）有關基因工程的敘述正確的是（）A、限制酶只在獲得目的基因時才用B、重組質粒的形成在細胞內完成C、質粒都可作為運載體D、蛋白質的結構可為合成目的基因提供資料,D,練習,49,5）基因工程是在