免疫膠體金技術 1 免疫膠體金技術Immunecolloidalgoldtechnique 2 免疫膠體金技術 膠體金標記技術的相關定義 免疫膠體金技術是以膠體金作為示蹤標志物應用于抗原抗體的一種新型的免疫標記技術 膠體金標記實質上是蛋白質等高分子被吸附到膠體金顆粒表面的包被過程 3 免疫膠體金技術 膠體金技術的發展DevelopmentofImmunecolloidalgoldtechnique 1939 雛形Kausche等把煙草花葉病毒吸附到金顆粒上在電子顯微鏡下觀察金離子呈高電子密度 1971 作為標記物應用于免疫組織化學研究Faulk等首先將兔抗沙門菌抗血清與膠體金顆粒結合 用直接免疫細胞化學技術檢測沙門菌的表面抗原 1974 實現間接免疫金染色法Romano將膠體金標記到馬抗人的IgG上 實現了間接免疫金染色法 4 免疫膠體金技術 膠體金技術的種類及優點 快速免疫金滲濾法 immuogoldfiltrationassay IGFA 即穿流式 flowthrough 的固相膜免疫測定 主要由兩部分組成 膜滲濾裝置和標記結合物 前者為一塑料小盒 其中填滿吸水性物質 面上緊貼放置一片吸附有抗體 以雙抗體夾心法測抗原為例 的硝酸纖維膜 標記結合物為免疫金 A 金標記抗體B 標本中的抗原C 包被抗體D NC膜E 吸水材料F 塑料盒 5 免疫膠體金技術 免疫層析法 immunochromatogra phy ICA 是繼IGFA之后發展起來的另一種固相膜免疫測定 與IGFA利用微局限性膜的過濾性能不同 免疫層析法中滴加在膜一端的樣品溶液受膜的毛細管作用 基于層析作用的橫流 lateralflow 向另一端移動 移動過程中被分析物與固定在膜上某一區域的受體 抗原或者抗體 結合而被固相化 無關物質則越過該區域而被分離 然后通過標記物顯色來判定試驗結果 以膠體金為標記物的實驗稱為膠體金免疫層析試驗 6 免疫膠體金技術 免疫膠體金技術的特點 優點 檢測方法簡單而快速 數分鐘即可得出結果 不需儀器設備 操作人員不需特殊訓練 試劑穩定 適用于單份測定 無污染 GICA的特點是單一試劑 一步操作 小型實驗室即有條件開發生產 干燥包裝的試劑可在室溫保存一年以上 成為目前 病人身邊檢驗 point of caretesting POCT 中廣為應用的方法 7 免疫膠體金技術 最近由于原料的精選和制作工藝的改進 已能制備出可用于定量測定的GICA試劑 Roche公司生產的用于急性心肌梗死診斷的肌鈣蛋白和肌紅蛋白的GICA試劑和匹配的簡便測讀器CardiacReader 其精密度和準確性均符合定量測定要求 不足 金免疫測定中應用的是單份試劑 難于進行質量控制 即使是同一批生產的試劑 也很難保證每個試劑的同一性 因此金免疫測定一般只能用于定性試驗 其定量檢測和靈敏度的提高還有賴于新原料和新材料的開發與應用 8 免疫膠體金技術 ColloidalGoldSynthesis SolutioncolorvariesextensivelywithparticlesizeUsuallyadeepred butalsodarkbrown purpletolightorange yellowColloidsizecanbecontrolledbyAu CitrateratiosAnywherebetween1nm 100nm CitrateiseasilysubstitutedbyothermoreAu philicmolecules i ethiols H2O 100OC H2AuCl4 Turkevich et al DiscussionsFaradaySoc 1951 No 1155 75 9 免疫膠體金技術 10 免疫膠體金技術 ProcedureofColloidalGoldSynthesis Add100mLof1 0 HAuCl4toa200mLErlenmeyerflaskonastirringhotplate Addamagneticstirbarandbringthesolutiontoaboil Totheboilingsolution add1 5mLofa1 solutionoftrisodiumcitratedihydrate Na3C6H5O7 2H2O Stopheatingwhenadeepredcolorisobtained 11 免疫膠體金技術 Synthesisandpropertiesofdifferentparticlesize 12 免疫膠體金技術 TEMImagesofColloidalAu Averageparticlesize 17nm Goodgoldcolloidsandbad unstable goldcolloids 劣質金外形不均一 且非球形 有凝集現象 顆粒間變異系數較大 13 免疫膠體金技術 Howaretheantibodiescoupledtothegold Conjugationofantibodiestogoldparticlesdependsuponthreeseparatebutdependentphenomena a ionicattractionbetweenthenegativelychargedgoldandthepositivelychargedproteinb hydrophobicattractionbetweentheantibodyandthegoldsurfacec Sulfurbinding CysteineandMethionine Strongestbindingsuggestedtobethesulfur hinge joiningthethetwoFcregions 14 免疫膠體金技術 膠體金顆粒帶電情況抗體和金顆粒的耦聯 圖出處 IVDTechnology 15 免疫膠體金技術 SAMPLEGOLDCONJUGATIONPROTOCOL AdjustthegoldcolloidtotheproperpH Determinedtheminimumamountofprotein FinalconjugationPurification 16 免疫膠體金技術 AdjustthegoldcolloidtotheproperpH 膠體金與蛋白質的結合成功與否 取決于pH值 一般只有在蛋白質等電點 PI 略偏堿的條件下二者才能牢固地結合 因此 標記之前須將膠體金溶液的pH值調至待標記蛋白質的等電點略偏堿 需要提高膠體金的pH值時可用0 1molK2CO3 需要降低膠體金的pH值時可用0 1NHCl 測定金溶液的pH可能損害pH測定計的探頭 因此 一般用精密的pH試紙測定其pH即可 17 免疫膠體金技術 蛋白與膠體金結合的最佳pH測定 取若干1 5ml的試管 分別加入1ml膠體金用K2CO3將pH分別調為3 4 5 6 7 8 9 10 去96孔培養板 按pH從高到低分別將上述膠體金分別取100ul加入孔中 重復三次 每孔分別加入20ul濃度為10 的NaCl溶液 混合 室溫下放置10min 觀察膠體金顏色變化 記錄保持紅色的最低pH 18 免疫膠體金技術 AdjustthegoldcolloidtotheproperpH 常用幾種蛋白質標記時膠體金所用的pH值 19 免疫膠體金技術 Determinedtheminimumamountofprotein 1 光電比色法 制備一系列不同濃度的等體積蛋白質溶液 1ml 分別加入5ml膠體金中 迅速混勻 然后 各加入1ml10 NaCl溶液 搖勻 靜置5min后測各管 根據膠體金顆粒的大小 OD在520 580nm之間測定 以OD值為縱坐標 蛋白質用量為橫坐標作一曲線 取曲線最先與橫軸相接近的那一點處的蛋白質用量為最適穩定量 圖5 2中10nm的膠體金溶液中蛋白質的最適穩定量為45 g ml 20 免疫膠體金技術 2 目測法 以目測法確定膠體金與待標記蛋白質用量比例 將標記的蛋白質逐級稀釋后 由5 g 45 g另設對照管 各取等體積順序加入一系列裝有1ml膠體金的試管中 5min后 在上述各管內分別加入0 1ml10 氯化鈉 依表5 5順序進行 21 免疫膠體金技術 1 Pipette1mlofcolloidintoeachofaseriesof3mlcleanplastictubes 2 Adjusttheantibody 0 1ug ul totheproperpHwith100nMK2CO3or100mMHC1 3 Addtheantibodytoeachtubeinaseriesfrom0 150ul ie0 15uginstepsof0 1 2 3 15ug 4 Shakeeachtubeandleaveforapproximately5minutestoconjugate 6 Toeachtubeadd100ulof10 NaC1andagitatefor1minute 7 TheTubecontainingtheminimumamountofproteinrequiredtostabilizethegoldsolisindicatedbytheoneinwhichthecolorofthegoldsoldoesnotchangefromredtoblueupontheadditionofNaCl 22 免疫膠體金技術 Finalconjugation IgG Take100mlofgoldsolandadjusttoPh9Adjustthedialyzedandcentrifugedantibodysolution 0 1ug ul topH9 2AddthedeterminedamountofantibodysolutiondropwisetothegoldwhilestirringrapidlyAfter5minutesadd10mloffiltered10 BSAatpH9andstirgentlyfor10minutes 23 免疫膠體金技術 Purification Thegoldconjugatemustbepurifiedfromexcessantibodyandanysmallclustersremovedbeforeconcentratingandstoring Spinthegoldconjugateatspeedsaccordingtogoldparticlesize Thegoldconjugatewillformalooseprecipitateatthebottomofthetube Discardtheclearsupernatantandresuspendthepelletwithproperbuffer Thegoldconjugate ifcorrectlymade willbestableat4 forseveralmonths Iflongtermstorageisrequiredisshouldbealiquotedinto1mlvolumesand20 glyceroladded Itmaythenbefrozenandkeptat 20 foryears 24 免疫膠體金技術 膠體金免疫層析法試劑的組成 25 免疫膠體金技術 樣品墊 Samplepad 玻璃纖維 聚酯膜 纖維素濾紙 無紡布等多種材質 多種規格 批間穩定 樣品墊的作用 減緩樣品滲透速度 有利于樣品在結合墊上均勻分布 去除樣品中雜質顆粒 調節樣品液pH值或粘度等 樣本墊可使用化學物質進行浸漬處理 從而減少樣本差異 提高試驗的靈敏度 通常可以將洗滌劑 粘性增強劑 阻滯劑及鹽滲入樣本墊然后加以干燥 該工藝可避免使用復雜辨識劑 追跡緩沖液的麻煩 使檢測一步完成 26 免疫膠體金技術 結合墊 Conjugatepad 玻璃纖維 聚酯膜 纖維素濾紙 無紡布等多種材質 多種規格 批間穩定 結合墊的作用主要為 吸附一定量的金標結合物顆粒 吸附并持續不斷的將樣品轉移到NC膜上 保持金標結合物顆粒的穩定性 保證金標結合物顆粒定量完全釋放等 27 免疫膠體金技術 硝酸纖維素膜 Nitrocellulose 推薦使用Millipore MDI S S whatman等國外公司的硝酸纖維素膜 NC膜的作用 在檢測線和對照線條帶區域固定抗體 樣品在NC膜上流動并與試劑混合發生免疫反應 反應在NC膜上顯色 讀檢測結果NC膜的重要參數 孔徑 對稱性 層析速度 表面活性劑 蛋白結合力 強度 表面質量 厚度 批間均一性等 28 免疫膠體金技術 硝酸纖維素膜與蛋白結合的原理主要有兩種假說 1 首先兩者靠靜電作用力結合 然后靠H鍵和疏水作用來維持長時間結合 2 首先兩者靠疏水作用結合 然后靠靜電作用來維持長時間結合 兩條假說 都表明其結合過程分為兩步 首先結合和后面長時間結合 由于結合原理的不明確性 導致在這方面的工作非常依賴實踐經驗 29 免疫膠體金技術 硝酸纖維膜的選擇 膜的分類標準 m和s m 指的是膜孔徑 s 以秒為單位的定義為 每4cm膜 水的層析時間是 s 換算情況大致為 8um 135s 6um 180s不同秒數的膜對反應的影響通過速度越