發布日期欄目標題作者部門正文內容20040929化藥藥物評價 非臨床安全性和有效性評價膽囊炎發病機制與模型的建立高建平1膽囊炎發病機制與模型的建立審 評 一 部 高 建 平膽囊炎是最常見的膽系疾病之一，其和膽囊結石二者互有聯系，膽囊炎的主要類型為結石性膽囊炎，而膽囊結石通常又有炎癥的表現。膽囊炎按其發病的緩急分為急性膽囊炎和慢性膽囊炎。急性膽囊炎是外科領域中常見的急腹癥，其發病率僅次于急性闌尾炎，占炎性急腹癥的第二位。急性膽囊炎有結石性膽囊炎和非結石性膽囊炎兩大類。約 95% 的急性膽囊炎是因膽囊結石阻塞膽囊管并繼發感染而引起的。 非結石性膽囊炎盡管臨床比例較低，但由于這類膽囊炎發病隱匿、臨床癥狀不典型、病情重且進展快，易于發生膽囊壞死與穿孔，必須引起高度重視。慢性膽囊炎是指膽囊因長期或間斷地受到刺激而產生的明顯的慢性炎癥改變及或功能障礙， 其中急性膽囊炎癥消退后遺留下來的病理狀態，是慢性膽囊炎的常見類型。由于病因及病理變化的不同，一般將本病也可分成慢性結石性膽囊炎和慢性非結石性膽囊炎，而85%-95% 為結石性膽囊炎 1-2 。精品資料一. 病因1. 結石性膽囊炎結石性膽囊炎的病因多以膽囊排空受阻開始，結石機械損傷，膽汁淤積引發膽囊內高壓，代謝障礙、細菌感染及神經因素等，其中結石造成膽囊管梗阻是最常見的病因1-2 。 膽囊管梗阻結石嵌頓，膽囊管過長、扭曲，膽囊管螺旋瓣的異常，炎性水腫或纖維化，腫瘤內堵外壓，膽道寄生蟲病等多種情況可引起膽囊管或膽囊頸的阻塞。細菌感染急性膽囊炎時膽囊膽汁的細菌培養陽性率高達80%-90% ，包括需氧菌與厭氧菌感染，其中腸源性革蘭氏陰性桿菌為最常見的致病菌。細菌的來源主要通過十二指腸上升性途徑、經淋巴或血運、經腸肝循環途徑以及由鄰近臟器細菌感染所波及。細菌在酶的作用下使結合膽汁酸轉變成有毒的游離膽汁酸，也可加重組織損傷和炎癥。 化學刺激膽汁成分之一的膽汁酸（尤其是細菌作用后的游離膽汁酸）、逆流的胰液和溶血卵磷脂，對細胞膜有毒性作用和損傷作用，對膽囊黏膜的局部刺激可造成炎癥。其中由肝臟與胰液中的磷脂酶作用于膽汁成分卵磷脂而生成的溶血卵磷脂，對細胞膜的損傷尤為嚴重。研究證實結石性膽囊炎的炎癥發生主要是結石刺激膽囊上皮細胞釋放溶酶體磷脂酶，該酶是炎癥發生和發展過程中的中介物質，而且能促使卵磷脂轉化為溶血卵磷脂，直接損傷細胞膜，膽囊在各種炎癥因子的綜合作用下，發生充血、水腫、炎性細胞滲出和出血，甚至細胞壞死等病理變化，使結石性膽囊炎得以形成。另外高濃度膽鹽，飽和膽汁，以及膽汁中的膽固醇結晶和前列腺素等也對細胞膜產生損害作用。 神經因素手術創傷或長期禁食等造成的內臟神經功能紊亂，可導致膽汁郁積、膽囊局部血供障礙等變化，從而導致膽囊炎癥。2. 非結石性膽囊炎非結石性膽囊炎的病因可能與下列因素有關：膽囊壁局部血供障礙；膽汁淤滯及其成分變化；感染及免疫功能低下、使用抗生素過敏等1-2 。二. 病理生理的改變急性膽囊炎的早期多以化學性炎癥為主，隨著膽囊內膽汁的滯留瘀積，膽囊內壓增加，膽囊壁血供受累，膽囊壁組織的抵抗力不斷降低而繼發細菌感染。慢性膽囊炎病理變化包括壁層小血管硬變與栓塞、單核細胞浸潤和纖維組織增生， 黏膜上皮糜爛潰瘍或萎縮，肌層下肉芽組織、腺體腺管的淤積增生1。對急性非結石性膽囊炎的病理生理特點研究發現，發燒、高血壓、壞疽樣膽囊、g- 菌性敗血癥、多器官衰竭、黃疸以及堿性磷酸酶的不成比例升高是其常見表現，而內臟動脈灌注不足和敗血癥是急性非結石性膽囊炎的主要病理生理過程，膽囊炎癥、膽汁淤積及繼發的細菌侵入導致多發性壞疽是非結石性膽囊炎的終末階段3。而對急性結石性膽囊炎研究表明，患者血液中的一氧化氮（no ）和過氧化脂質含量顯著升高，維生素c(p-vc) 含量、超氧化物歧化酶（sod ）、過氧化氫酶（ cat ）、谷胱甘肽酶 (e-gsh-px) 活性顯著降低 4-6 。血清中 il-6 水平的高低可以反應全身性炎癥程度 6，在急性膽囊炎患者血清及膽汁中的il-6 的濃度顯著高于膽囊癌、慢性膽囊炎和正常膽囊。另外，急性膽囊炎、膽囊結石的血清、膽汁中淀粉酶及同工酶水平均升高7。膽囊收縮素 (cck) 是膽囊收縮的主要調節肽。研究表明，健康的膽囊cck 誘導的收縮是由cck-a 受體介導而可被前列腺素減弱。而膽囊中膽石的存在與前列腺素介導的cck 收縮膽囊作用的消失有關。然而在膽囊炎后期，5-羥色胺的過量釋放使膽囊響應cck 的收縮作用正?；Ｌ崾灸懩已椎牟煌A段會影響一系列對cck 改變膽囊運動有重要影響的炎癥介質8 。膽汁中的高膽固醇通過下調膽囊cck-r 表達而導致膽囊收縮功能障礙，降低膽汁高膽固醇水平可以促進膽囊動力功能的恢復 9。三模型的建立對于膽囊炎發病原因和病理的研究，可以指導膽囊炎模型的建立。而在實驗過程中對模型的選擇，可根據藥物的功能主治的側重點，選擇適宜的動物模型。 根據膽囊炎的發病原因及機制，膽囊炎和膽結石的模型常見的主要有以下幾種：（一）化膿性膽道感染模型1、內毒素造模法：細菌感染是膽囊炎發病的主要原因之一。急性膽囊炎時膽囊膽汁的細菌培養陽性率高達80%-90% ，膽道感染以g-菌為主，特別是大腸桿菌較多。故常采用大腸桿菌誘發動物的膽道感染。研究證實內毒素（大腸桿菌脂多糖）引發負鼠（opposum ）膽囊局部缺血性損傷模型類似于非結石性膽囊炎。對負鼠靜脈注射0.005mg/kg的內毒素導致黏膜表面的破損和大面積的出血；高劑量的內毒素導致黏膜凝固壞死，出血，大面積纖維蛋白沉積，廣泛的黏膜的缺失，與急性缺血性損害一致。內毒素可消除膽囊平滑肌條對cck 及電刺激反應而造成膽囊淤積10 。2、細菌感染加膽石膽囊內注射11結石機械損傷， 造成膽囊管梗阻是膽囊炎的另一主要病因。 以一定量的臨床常見膽道感染細菌加膽石混懸液注射于動物的膽囊或膽管內使之形成化膿性感染模型。此方法結合了臨床的膽囊炎的最主要的致病因素，更貼近于臨床。造模成功的動物，膽汁流量減少，oddi 氏括約肌張力增加，組織學檢查肝與膽囊、膽管有炎癥反應。藥效可根據用藥后膽流量，oddi 氏括約肌張力及組織學檢查來確定模型的成功和藥物的療效。（二）總膽管結扎模型：總膽管結扎（ cbdl ）可制作有急性膽囊炎癥的非結石性膽囊炎的模型，通過降低平滑肌的收縮性和降低神經介導的收縮。而神經介導的收縮性的改變是由于膽堿能神 經的功能障礙和一氧化氮介導的對平滑肌收縮性的抑制作用的提高12-13 ?？偰懝芙Y扎合并膽道細菌感染是常用的方法之一11 。結扎動物膽總管發生部分性狹窄和膽汁淤積。在膽管結扎上部注射細菌，一周內即可形成化膿性炎癥反應。通常采用家兔，麻醉后開腹部，經十二指腸乳頭插入塑料導管至肝門以上肝膽管。在膽總管中段內襯導管下結扎肝總管，造成部分性狹窄。從導管注入兔大腸內容物的混懸液2ml ，然后用線將針孔結扎，關閉腹腔，術后分籠常規飼養。術后兔不愛吃食，膽道梗阻嚴重的可出現黃疸，剖檢時組織學檢查肝、膽，可發現有炎癥、壞死等。藥效可根據兔肝膽系統的病變程度評價。（三）化學物質誘發膽囊炎模型：1、石膽酸誘發膽囊炎的模型：口服石膽酸（lithocholic acid, lca）可對肝臟產生毒性，使肝細胞變性和壞死、肝細胞功能下降、膽汁代謝障礙、內源性-葡萄糖醛酸酶（-gcd ）活性明顯增高、 ca2+ 等增多，在諸多因素共同作用下，最終誘發動物膽 囊炎或結石形成。給豚鼠按300mg/kg 體重灌服石膽酸，每日一次，連續15 天，即可造模成功。模型成功的動物，剖檢時膽囊內可發現有懸浮物或若干泥沙樣結石，藥效可根據成石動物數、肝與膽汁-gcd 活性、酸性粘多糖及膽汁成分的變化、肝膽組織學檢查等來評價。2、黃疸型膽囊炎模型：林可霉素可引起黃疸和轉氨酶的升高，采用皮下注射鹽酸林可霉素可制造黃疸型膽囊炎模型14 ，采用該方法可引起豚鼠膽囊的黏膜水腫、滲血、乳頭增生、固有膜腺體向下浸潤、炎細胞浸潤等反應。（四）、結石模型結石嵌頓造成膽囊管梗阻是誘發膽囊炎的最常見的病因。因此，根據膽囊炎的發病原因，如果是由于膽囊結石所造成的膽囊炎，則動物試驗可以采用結石模型來研究藥物對結石型膽囊炎的治療作用。結石型膽囊炎主要有以下幾種：1、膽固醇結石模型正常膽汁中含有一定濃度的膽汁酸鹽和磷脂，與膽固醇、蛋白質等組成膠性微粒懸浮于膽汁中而不析出，長期以高膽固醇剝奪維生素c 的飲食使體內膽固醇升高，膽汁酸和磷脂含量相對或絕對降低，各成分比例失調，致使膽汁中膽固醇過飽和、 鈣離子增多而形成膽固醇結石。用含 1% 雙氫膽固醇的飼料喂養家兔，2 6 周可誘發結石造模成功的動物，可在膽囊內找到直徑約1mm 的多發性結石， 有較多膽固醇結晶塊，部分呈放射狀結晶排列。2、膽色素結石模型膽色素結石好發于高碳水化合物膳食的人群，患者膽汁成分與正常人相比，其磷脂含量明顯增高。給豚鼠飼以低蛋白飼料造成肝臟及膽汁中- 葡萄糖醛酸酶活力增高，促使結合膽紅素水解成游離膽紅素，與鈣離子結合形成不溶于水的膽紅素鈣鹽，在其它因素的影響下進一步形成膽色素結石。豚鼠每日喂以致石飼料 50g （其中 2%酪蛋白、 3% 蔗糖、 2%豬油、 2% 纖維素、 0.04% 膽酸、 0.1% 膽固醇）喂養 1.5-3 個月。造模成功的動物，尸檢時，肉眼可見膽囊或外膽管內有結石顆?；虬瑴啙嵝鯛钗铩?、膽色素混合結石模型之一將人不同類型的結石或蛔蟲碎片以及其它異物直接植入動物膽囊內，以此為核心會誘發大量的結晶析出。脫落的膽道上皮細胞、細菌尸 體、蛔蟲碎片等均可為結石形成提供核心，使之增大。此方法可采用兔或狗，造模成 功的動物，尸檢時膽囊內，在異物表面沉積大量黏液和膽色素等成分，也可見由數個 異物黏合成團的較大結石或黑色膽砂。藥效可根據成石動物數、結石重量變化、膽汁成分、肝膽組織學檢查等作為檢測指標。4、膽色素混合結石模型之二以一定量的細菌注入膽總管引起感染時，大腸桿菌 產生 -葡萄糖醛酸酶， 可使水溶性膽紅素水解為游離膽紅素，后者再與鈣結合形成不溶性膽紅素鈣，在粘液物質的凝聚下形成膽色素結石而析出，加上膽總管被結扎，膽道梗阻，更導致細菌繁殖加快和促使感染加重，可誘發膽色素混合結石。操作方法為在近肝門處結扎麻醉大鼠的膽總管，然后向膽總管內注入 1.5 106 菌數 /ml 的大腸桿菌菌液 0.1ml/10g ，一般經 38 周可誘發膽色素混合結石。 造模成功的動物， 尸檢時可見其發生梗阻性黃疸，肝內外膽管有不同程度淤塞與擴張，在膽囊及膽管內可見黃褐色或深褐色的混合結石。四、 關于試驗指標的選擇對于不同的膽囊炎模型，根據其病理生理的改變，可以選擇相應的指標作為評價藥效學的依據。 膽囊的炎性改變是多數膽囊炎的共同表現。膽囊、肝或肝外膽管有無炎癥病變及病變程度，是反映治療膽道感染、膽石病中藥新藥療效的最直觀的指標，因此對膽囊進行病理組織學的檢查是最常采用和非常重要的指標。（2） 化膿性膽道感染的動物數或感染程度是反映治療膽道感染中藥療效的常用的觀察指標，同時還可以進行感染動物外周血紅細胞計數、白細胞總數及其分類的測定，對膽汁中菌落的測定。（3） 膽囊中有無結石即成石動物數、結石的定性可以反應對于結石性膽囊炎是否有療效的中藥的主要觀察指標。 其他可供分析的指標： 血液生化學指標檢查：總膽固醇、甘油三酯、天門冬氨酸轉換酶、丙氨酸氨基轉換酶； 膽汁流量； 膽汁成分的分析：、膽汁酸、總膽紅素、游離膽紅素、 膽固醇、鈣離子含量； 肝臟或膽汁中- 葡萄糖醛酸酶 （-gcd ）活力，內源性的 -gcd 過增能在結石形成中起主導作用，膽囊產生炎癥時該酶的活性增高；膽道動力學變化：如oddi 括約肌的張力或膽囊功能。在過飽和膽汁作用下，膽囊管阻力增高和膽囊排空障礙會促進結石形成； 血液的胃動素或膽囊收縮素的水平。五. 小結與討論動物模型作為人類疾病的替身在藥物療效評價上擔當著非常重要的角色。而動物模型的選擇首先考慮的就是相似性的原則，即復制的動物模型要與人類的疾病相似，模型在制作方法上應盡量靠近疾病發病的根本原因。而模型的診斷標準也要盡量向臨床人的診斷標準靠近， 檢測指標的選擇上應根據疾病的病理生理的改變盡量選擇與本病相關性高、 特異性強并且比較穩定可行的指標來評價模型的成功與否以及藥物的作用效果。通過對膽囊炎病因總結， 為膽囊炎模型的建立提供很好的參考;而通過對膽囊炎的病理生理學變化特點的分析，為檢測指標的選擇提供了依據?？傊?，膽囊炎的動物模型有多種，在選擇上，應根據模型的特點以及所研究的藥物的特點，選擇適宜的動物模型。參考文獻1. 朱培庭主編 . 實用中醫膽病學 s. 北京：人民衛生出版社.，1999 2 張啟宇 . 實用膽道病學 s.江蘇：江蘇科學技術出版社，19973 mcchesney ja, northup pg, bickston sj. acute acalculous cholecystitis associated with systemic sepsis and visceral arterial hypoperfusion: a case seriesand review of pathophysiologyj. dig dis sci， 2003 ，48(10):1960-1967 4 施小燕，陳鵬，周君富等. 急性結石性膽囊炎與一氧化氮、氧化和脂質過氧化關系的研究 j. 中華急診醫學雜志 . 2001 ， 10（ 2）： 101-1035. zhou jf, cai d, zhu yg, et al. a study on relationship of nitric oxide, oxidation., 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