小鼠肝臟過氧化氫酶 的 制備與測定 小組成員 李 朋 10011140010 邱方洲 10011140016 武 浩 10011140020 謝 黎 10011140022 2010 級一大班法醫 2012 年 1 月 3 日 小鼠肝臟過氧化氫酶的制備與測定 過氧化氫酶 Catalase 是一種廣泛存在于生物體內的氧化還原酶 尤其在動物的肝臟 腎臟 紅細胞中含量較多 其生物學功能是催化細胞內 H2O2 分解 防止過多 H2O2 對細 胞的危害 人工制備的過氧化氫酶可廣泛應用于食品與乳制品業 造紙與印染業 農業與 環保業 以及醫療衛生業等多領域 小鼠肝臟過氧化氫酶分子量約為 238KD 結構上由 4 個具有相同多肽鏈的亞基組成 是以 鐵卟啉為輔基的結合酶 在 407nm 波長下有特征性的吸收 溶于水 幾乎不溶于乙醇 氯仿 乙醚等有機試劑 酸性環境下溶解度低易析出 最適溫度為 37 最適 pH 值約為 7 8 本 實驗以小鼠肝臟為原料 根據過氧化氫酶溶解性和大分子等特性 通過組織勻漿 鹽析 透析 分子篩層析等步驟 提取純化過氧化氫酶 并對制備的過氧化氫酶進行蛋白濃度 分子量 米氏常數等測定 小鼠肝臟過氧化氫酶的制備與測定小鼠肝臟過氧化氫酶的制備與測定 實驗方案實驗方案 實驗目的實驗目的 熟悉并掌握生化四大技術 離心 層析 比色 電泳 熟悉并掌握分離純化小鼠過氧化氫酶和測定其含量的技術和方法 實驗原理實驗原理 勻漿原理 勻漿原理 分離純化某一種蛋白質時 首先要把蛋白質從組織或細胞中釋放出來并保持原 來的天然狀態 不喪失活性 所以要根據所提取蛋白質的性質采用適當的方法將組織和細 胞破碎 過氧化氫酶在乙醇 氯仿等有機溶劑中溶解度很小 而脂質在有機溶劑中溶解度 較大 通過加入有機溶劑可實現過氧化氫酶與脂質的分離 過氧化氫酶在乙醇 氯仿等有機 溶劑中穩定性好 不易變性 而某些雜蛋白在有機溶劑中穩定性差 容易變性 根據上述 制備過氧化氫酶 勻漿 鹽析 透析 過氧化氫酶測定 米氏常數值測定 Lineweaver Burk雙倒數作圖法 蛋白含量測定 lowry法 純度及分子量測定 SDS PAGE 層析 制備過氧化氫酶 勻漿 鹽析 透析 過氧化氫酶測定 米氏常數值測定 Lineweaver Burk雙倒數作圖法 蛋白含量測定 lowry法 純度及分子量測定 SDS PAGE 米氏常數值測定 Lineweaver Burk雙倒數作圖法 蛋白含量測定 lowry法 純度及分子量測定 SDS PAGE 層析 原理選擇 0 05mol L pH4 0 醋酸 乙醇緩沖液以及氯仿作為勻漿緩沖液 通過勻漿法破碎肝 組織細胞 勻漿液離心后脂質分配到有機相中 部分雜蛋白則沉淀下來 而過氧化氫酶主 要存在于上清液中 分離出上清液即獲得過氧化氫酶的粗提液 鹽析原理 鹽析原理 蛋白質在高濃度鹽溶液中由于水化膜被破壞而溶解度降低 通過向過氧化氫酶 粗提液中加入適當濃度的中性鹽 使過氧化氫酶呈鹽析狀態 而部分雜蛋白呈鹽溶狀態 離心 后過氧化氫酶主要存在于沉淀中 棄去上清收集沉淀 即可實現過氧化氫酶與部分雜蛋白 的分離 透析原理 透析原理 采用 20 乙醇 0 1mol L pH4 7 醋酸緩沖液 0 1mol L NaCl 溶液為透析液 對 產物進行透析處理 在該透析條件下 過氧化氫酶溶解度變小 以沉淀形式析出 但不變 性 透析過夜后離心 過氧化氫酶主要存在于沉淀中 但沉淀中也可能含有少量變性的雜 蛋白 選擇 0 1mol L pH7 8 磷酸緩沖液復溶沉淀 則過氧化氫酶溶解 而變性的雜蛋白不 能溶解 從而實現過氧化氫酶與部分雜蛋白的分離 層析原理 層析原理 凝膠層析法主要根據混合物中分子大小不同的各種物質 隨流動相流經作為固 定相的凝膠層析柱時 各種物質分子擴散移動速度不同使混合物中各種物質得到分離的技 術 采用 sephadexG 200 葡聚糖凝膠層析柱可以實現過氧化氫酶與其他分子量雜蛋白的分 離 通過監測洗脫液在 407nm 過氧化氫酶特征性吸收波長 和 280nm 波長下的光吸收值 變化 合并收集 OD407nm 和 OD280nm 重疊峰值管 即可獲得純化后的過氧化氫酶 米氏常數測定原理 米氏常數測定原理 底物濃度與反應速率之間的關系可用 V 表示 圖形為矩形 max SK SV m 雙曲線如下 將此式取倒數可得 以和作圖可得一直線 1 max SV SK V m V 1 1 S 由圖可知該直線與橫軸的截距為 找出一系列的點 將點還原為直線 即可求出 Km m K 1 點的取法 設置不同的底物濃度 加入酶的量相同 反應相同的時間 找出反應后過氧化 氫的量 分解的底物可以求得 用它來表示反應速率 剩余的過氧化氫用高錳酸鉀滴定 2KMnO4 5H2O2 3H2SO4 2MnSO4 K2SO4 5O2 8H2O 蛋白質濃度測定原理 蛋白質濃度測定原理 蛋白質中的酪氨酸等與酚試劑之磷鉬酸 磷鎢酸作用產生藍色化合 物 其顏色深淺與蛋白質含量成正比 Lowry 法測定蛋白質可分為兩個步驟 1 在堿性溶液中 蛋白質與銅離子發生反應 Cu2 蛋白質 Cu 蛋白質 2 Cu 蛋白質使試劑中的磷鎢酸 磷鉬酸還原成為藍色化合物 測定光吸收值就可以推算出 蛋白質的含量 試劑中的碳酸鈉有緩沖作用 使溶液的 pH 始終保持在 10 左右 顯色最深 福林 酚法的靈敏度高 蛋白質濃度測定范圍是 25 250 g ml 但此法實際上是蛋白質中酪 氨酸和色氨酸等與試劑的反應 因此他受蛋白質氨基酸組成的影響 即不同蛋白質中氨基 酸組成的不同會使顯色強度有所差別 此外 樣品中酚類及檸檬酸的干擾會使結果偏高 低濃度的尿素 約 0 5 左右 胍 約 0 5 左右 硫酸鈉 1 硝酸鈉 1 三氯醋 酸 0 5 乙醇 5 丙酮 0 5 對顯色無影響 上述物質濃度高時必須做校正曲線 SDS PAGE 測定分子量原理測定分子量原理 在聚丙烯酰胺凝膠系統中加入陰離子去污劑十二烷基磺酸鈉 SDS 則蛋白質分子電泳的遷移率主要取決于分子量大小 Mr 而與本身所帶的電荷量和形 狀無關 具體公式 lgMW A B Rf 實驗步驟 實驗步驟 一 組織勻漿法制備過氧化氫酶粗提液 1 頸椎脫臼處死 6 只小鼠 取肝臟約 6g 2 加入預冷勻漿緩沖液 51ml 用組織搗碎機勻漿 3min 取 200 L 勻漿液留樣放入冰 箱 20 保存 3 冰浴下緩慢加入 3ml 氯仿 再次勻漿 1min 勻漿液離心 4 7500rpm 30min 棄 沉淀 收獲上清液 44ml 于錐形瓶中 4 取勻漿上清液 120 L 加入 40 L 4 電泳上樣 Buffer 沸水浴 5min 備用于 SDS PAGE 檢測 20 保存 另取 200 L 勻漿后上清液 20 保存 二 鹽析與透析法初步純化過氧化氫酶 1 冰浴攪拌狀態下向肝臟勻漿上清液緩慢滴加 7mlNa2SO4 繼續用玻璃棒手動冰浴攪 拌 1h 2 將鹽析溶液離心 4 7500rpm 10min 棄上清保留沉淀 3 用 24ml 磷酸緩沖液溶解沉淀 15min 離心 4 5000rpm 10min 棄沉淀保留上 清液 4 取鹽析后上清液 120 L 用 40 L 4 電泳上樣 Buffer 沸水浴 5min 備用于 SDS PAGE 檢測 20 保存 5 將透析袋至于沸水浴 5min 清洗晾涼后備用 6 將上清液放入透析袋中 置于透析液中兩周 中途更換一次透析液 7 兩周后取透析袋中渾濁溶液離心 4 7500rpm 10min 棄上清保留沉淀 8 用 3ml 磷酸緩沖液溶解沉淀 15min 離心 4 4000rpm 10min 棄沉淀保留上清 液 9 取上清液 120 L 用 40 L 4 電泳上樣 Buffer 制樣沸水浴 5min 備用于 SDS PAGE 檢測 于 20 保存 10 將透析袋至于沸水浴 5min 清洗晾涼后備用 11 將收獲的上清液放入處理后的透析袋中置于 75 的甘油中包埋濃縮 2h 待樣品濃 縮至 1 2ml 收樣 置于 20 保存 三 凝膠層析法進一步純化過氧化氫酶 1 凝膠的處理 預先處理好 2 裝柱 取一支層析柱 于底部填塞薄棉 將層析柱垂直夾于鐵架臺 于柱中加入 緩沖液 5cm 使用前將凝膠混勻順玻璃棒緩慢注入柱中 待其自然下沉 凝膠床 至少 2 3 柱高 3 平衡 磷酸緩沖鹽溶液流洗 控制流速 5 10 滴 min 4 濃縮樣品 5 加樣 用吸管吸取待分離的濃縮液 1 2ml 在接近凝膠床表面處沿柱壁緩慢加入 6 洗脫 用磷酸鹽緩沖液保持流速 7 收集及檢測 樣品下降至底部 5cm 開始用試管收集流出液 每管收集 2ml 收集管 依次在 407nm 和 280nm 波長下測吸光度值 繪制洗脫曲線 如圖 如圖 1 8 收獲純化產物 收集 OD407nm 和 OD280nm 重疊峰值管 9 取 2ml 純化后存樣于 20 保存 備于蛋白質濃度和 Km 值測定 10 取層析樣品 60 L 用 20 L 4 電泳上樣 Buffer 制樣 沸水浴 5min 備用于 SDS PAGE 檢測 于 20 保存 四 Lowry 法測定純化的過氧化氫酶濃度 1 選擇標準蛋白 選擇與待測樣品 層析后的純化樣品 相同或組成類似的蛋白質作 為標準蛋白溶液 2 標準蛋白溶液的配制 將標準蛋白經凱氏定氮法準確測定其蛋白質含量 再用無離 子水配制成 0 1mg ml 的儲存液 3 實驗結果表 1 所示配成不同濃度的標準蛋白組 編上號碼 以第一管為空白管 在分光光度計上測定 650nm 處的光密度值 4 以各標準溶液濃度為橫坐標 各管的光密度值為縱坐標作圖 繪制標準曲線 如圖 如圖 2 5 測定樣品蛋白 取試管兩支 一支放 1ml 稀釋的層析后純化樣品和 1ml 試劑 AB 混 合液 另一支放 1ml 生理鹽水和 1ml 試劑 AB 混合液 兩者均混勻后在 50 水浴 保溫 10 分鐘 冷卻 再各加入試劑 C 3ml 立即混勻 置于 50 水浴中保溫 20 分 鐘 冷卻后測定 650nm 波長處的光密度值 五 雙倒作圖法測定純化的過氧化氫酶米氏常數 1 稀釋勻漿后和層析后樣品各 1000 倍 5 L 5ml 2 過氧化氫的濃度再標定 取清潔錐形瓶 2 支 各加 0 04mol L 的過氧化氫溶液 2 0ml 和 25 硫酸 2 0ml 分別用 0 002mol L 高錳酸鉀滴定至微紅 記錄滴定毫升數去 平均值 計算過氧化氫的摩爾濃度 3 反應測速 取干燥的 50ml 錐形瓶 5 只 編號后操作 終止反應 血液加入后立即 計時 10 分鐘 到時立即加入 25 硫酸 2 0ml 邊加邊搖 終止酶促反應 4 滴定 用標準 0 002mol L 高錳酸鉀滴定 記錄各瓶耗高錳酸鉀的 ml 數 5 計算 1 反應瓶中過氧化氫濃度計算 S H2O2摩爾濃度 H2O2的 ml 數 3 0 2 反應速度計算 V H2O2的摩爾濃度 加入 H2O2毫升數 0 002 2 5 消耗 KMnO4的 ml 數 加入的 H2O2的毫摩爾數 剩余的 H2O2的毫摩爾數 3 求 Km 值 如圖 如圖 3 六 SDS PAGE 法測定純化的過氧化氫酶分子量 1 凝膠的制備 預先處理好 2 蛋白質 樣品的處理 將蛋白質溶解在蛋白質樣品溶解液中 在 100 加熱 2 5 分鐘 蛋白質的最后濃度一般為 0 05 1mg ml 3 加樣 4 電泳 5 剝膠和固定 垂直柱形電泳 6 染色和脫色 7 蛋白質的定量 如圖 如圖 4 實驗結果 實驗結果 小鼠肝臟過氧化氫酶分離純化小鼠肝臟過氧化氫酶分離純化 酶活酶活溶液體溶液體 積積 mlml 蛋白濃蛋白濃 度度 mg mlmg ml IU mlIU ml 總酶活總酶活比活比活 IU m g 回收率回收率 KmKm 分子量分子量 勻漿產勻漿產 物物 4444 2 7 層析產層析產 物物 2 20 2051010202048 7848 78 0 0795 57 891 圖 1 試驗中的幾個注意事項試驗中的幾個注意事項 1 使用離心機要注意平衡 平穩 對稱 牢固 緩慢 以防止損傷離心機 2 手動玻璃勻漿器助溶時 要注意緩慢旋轉推移 時間稍微長一些 使溶解的更充 分 3 使用分光光度計前 要記得調零 圖 2 圖 3 圖 4 4 裝柱時 避免出現斷層 干膠 實驗必須保證試管 量筒 吸管等的清潔 以避 免試劑之間的污染 影響實驗結果 5 勻漿制備中快慢交替 防止溫度過高對過氧化氫酶產生影響 6 洗脫速度不可過快 以防樣品帶擴散 結果誤差分析結果誤差分析 本次實驗結果與理論數值基本符合 但稍有誤差 可能因為 1 使用的儀器內有雜質 儀器老化 2 滴加的試劑與酶沒有充分接觸 3 酶因為操作時溫度稍高部分會失活 4 拿出離心管時稍微晃動使沉淀與上清液混合 5 層析時收集的液滴大小不均造成吸光度測量誤差 6 滴定時計時不準確 滴定終點人為判斷不一致 7 滴定前過氧化氫分解或稍被硫酸污染 8 周圍環境中的雜蛋白影響 可能因為實驗時間過長造成酶活性降低 實驗討論實驗討論 1 鹽析時 為什么要在冰浴攪拌的狀態下 且要緩慢滴加 答 常溫下 酶的活性有損傷 攪拌和緩慢滴加 是防止局部鹽濃度過高 使雜蛋白 析出 2 為什么勻漿 透析中用醋酸緩沖液 而鹽析 凝膠層析中用的都