海洋微生物抗生素的開發方案摘要：海洋微生物種類約為陸生微生物的20倍以上。海洋微生物由于其高鹽、高壓、低溫、低光照和寡營養的特殊的生存環境，從而可合成一些結構新穎的陸生微生物所不具備的抗生素。高質量的海洋微生物菌種庫及其天然產物庫是新藥開發的重要來源。開發海洋微生物資源并從中篩選出有效的新抗生素具有重要的意義。【1】本文中將介紹篩選抗生素的國內外研究進展，并詳細介紹海洋微生物進行菌株鑒定、抗生素的篩選分離提取，活性成分化學顯色的初步研究的實驗方法及所涉及的相關技術。關鍵詞：海洋微生物，抗生素，篩選，提取分離純化，結構鑒定1.立題背景1.1 海洋微生物抗生素研發意義: 海洋微生物抗生素的研究源于二十世紀上半葉對陸生微生物資源開發的巨大成就。自從1929年發現青霉素以來，迄今已有超過120種的陸生微生物的次生代謝產物用作臨床上的抗生素藥物。抗生素(Antibiotics)最初是指由微生物產生，具有相對選擇毒性，在極低濃度下能抑制病原微生物(或癌細胞)生長繁殖的物質。眾所周知，半個世紀以來，陸棲微生物早已成為抗生素、酶抑制劑等生物活性物質的重要資源，一度形成了輝煌的抗生素時代。隨著抗生素的廣泛應用，在臨床上引起兩個問題：一是細菌耐藥性逐年增加，致使一些抗生素的療效降低，甚至無效；另一問題是一些不致病的細菌成為條件致病菌，在臨床上造成一定的威脅。因而需要不斷篩選新結構和新的抗菌作用機制的新抗生素以滿足臨床需要。然而對陸生微生物的長期研究已使得陸地這一古老資源日趨枯竭，因此，拓寬尋找新藥的途徑迫在眉睫。據研究發現，約27的海洋微生物都能產生抗菌活性物質。已經成為篩選新型抗生素的重要來源。【2】1.2 背景:從海洋微生物研究抗生素的歷史可以追溯到19世紀末。1889年，De Giaxa發現海水對炭疽桿菌和霍亂弧菌的生長具有抑制作用，指出海洋微生物可能產生抑制細菌生長的物質”1966年Burkholder等從波多黎各海域分離到的食溴假單胞菌產生的含溴吡咯類抗生素硝吡咯菌素(Pyrolnitrin)”，標志著從海洋微生物分離抗生素物質的開始。【3】1.3 現狀:20世紀70年代中期，海洋微生物抗生素研究進入了加速發展期。東京大學微生物研究所率先開展了卓有成效的系統研究，在此后十幾年間該研究所對海洋細菌，特別是海洋沉集物中的放線菌進行了深入的研究，奠定了海洋微生物抗生素研究的基礎。美國加利佛尼亞大學Scripps海洋研究所Fenical教授領導的科研小組，對海洋微生物同樣進行著長期不懈的研究。從1988年開始，該小組先從蝦卵表面以及一種絲狀藍藻表面的共生細菌入手，這些共生細菌明顯具有分泌拮抗物質抵御病原體入侵共生體的作用。1989年報道從1000 m的深海中分離到一株嗜鹽的革蘭陽性菌，產生一系列新的細胞毒性和抗真菌的大環內酯AF，作為主要的代謝產物，大環內酯A，還對單純皰疹病毒和HIV病毒有抑制效果。目前Fenical研究小組共報道獲得14種新的抗生素。美國的其它一些實驗室，德國、法國、加拿大、西班牙等國的研究機構也都在開發新的海洋微生物抗生素，已發現了26種新抗生素。1.4 國內外研究進展:1.4.1 來源于海洋細菌和放線菌的抗生素。 Bell從硬磷魚(Ostracion CUbicus)的毒液中分離純化出副溶血弧菌，分離得到吲哚類衍生物Vibrindole A，對金黃色葡萄球菌、白色葡萄球菌和枯草桿菌有一定的抑制活性。【4】Fenical研究組從鏈霉菌中得到4種稀有的吩嗪衍生物卜異鼠李糖酯類化合物，具有很強的廣譜抗菌作用。【5】方金瑞等對海洋底棲菌進行活性篩選的過程中發現耐鹽嗜堿放線菌2B，產生的抗菌物質2B-B經研究是氨基糖苷類的丁酰苷菌素。該研究開辟了氨基糖苷類抗生素化學結構修飾的新途徑。【6】1.4.2 來源于海洋真菌的抗生素。Kobayashi研究組從琉球紅藻門植物Ceratodictyon 體表分離到的真菌的發酵液中得到五環蕙環類衍生物Ser agaki none A。【7】Wi lkinson等從來自印度洋的曲霉菌的培養液分離到一種新型環縮二氨酸Gl i ot oxi n。Albaugh等報道從我國深圳潮間帶紅樹上分離到一株海洋真菌Hypoxylon oceanicum LL-15G256。1.5 海洋抗菌活性物質研究的難點及解決的方法 開發海洋藥物則有許多因難，其關鍵在于藥源難以解決。事實上，絕大多數海洋生物活性物質含量極微。這一特征表明，對大部分活性物質來說，直接利用海洋生物作原料進行分離提取，是很難滿足需求的。今后一段時期內有關海洋微生物的生物活性物質的研究重點將主要集中在以下幾個方面：(1)擴大篩選范圍，尋找新的具有藥用價值的微生物資源，并建立適合海洋生物活性物質的大規模篩選技術。(2)繼續深入開展對海洋微生物的分離提取和培養方法的研究。(3)結合現代發酵工程技術，研究適合于海洋微生物的發酵工藝條件和修飾方法，加快利用海洋微生物生產海洋藥物及保健品的工業化進程。(4)結合現代生物工程技術，提高海洋生物產物的質和量，重視可再生資源的研究與開發，保證海洋生物資源持續有效的被利用。2.海洋微生物抗生素研究方案(提取精制流程） 本課題的基本思路是通過菌株篩選分離，抗生素活性篩選，通過高效液相色譜分析，薄層色譜分析及自顯影技術來確定抗生素的分子組成。對已經構建的海洋微生物天然產物庫進行質量評價，建立活性篩選模型，設計了引物，通過PCR 擴增的方法對海洋微生物庫進行序列篩選。2.1 海洋微生物抗生素的分離及純化2.1.1抗真菌活性的測定 采用瓊脂塊法。將分離到的海洋微生物涂布于海洋微生物分離培養基上，30 培養5d，用無菌打孔器打下一塊，分別輕貼于表面涂布有指示菌的指示培養基平板上，30培養1-2d，觀察并測量抑菌圈直徑。也可以采用紙片擴散法測定, 細菌測定培養基為肉膏瓊脂( pH7. 0) , 37 度培養過夜; 真菌測定培養基為沙氏瓊脂( 自然pH ) , 28 度培養約24 48h 后測量抑菌圈直徑。21.2 代謝產物的提取分離純化 抗生素的分離純化，目的在于從發酵液或培養液中分離純化具有一定純度的代謝產物。按常規的稀釋涂平板法涂平板，30 培養3-5 d，挑單菌落接種于對應的培養基斜面，30培養3-5d。抗生素的一般分離純化方法為：微生物發酵液的預處理，其目的不僅在于分離菌體和其他懸浮顆粒。還著眼于除去部分可溶性雜質和改變濾液的性質，以利于提取和精制后續各工作的順利進行。雜質主要包括：可溶性膠體物體，其中主要是雜蛋白、多糖和核酸，含有高價金屬離子的無機鹽。這些雜質不僅使發酵液粘度增大，降低液固分離速度，還會影響到后續的提取與純化工作產品質量。因此應通過預處理的方法，盡可能的去除這些雜質。由微生物產生的產物，大都處于細胞內部，要分離和提取這些產物，則首先需要收集菌體，進行細胞破碎。破碎細胞的主要方法有：機械法有高壓勻漿法、高速珠磨法及超聲波法。非機械法有化學滲透法、酶解法、凍結一融化法、干燥法等。然后對發酵液進行固液分離，常用的方法有過濾和離心。2.1.3抗生素的主要的分離方法： 抗生素常用的分離純化方法主要有溶媒萃取法、吸附法、離子交換法、沉淀和結晶、色譜分離等。在提取時，可根據抗生素分離的難易，單獨或同時使用上述方法。 2.1.3.1溶媒萃取法是用一種溶劑將物質從另一種溶液中提取出來的方法，這兩種溶劑不能互溶或只部分互溶，能形成便于分離的兩相。 單級萃取只有一個混合器和一個分離器的萃取。多級錯流萃取是由數個萃取器串聯組成，料液經萃取后的萃余液依次流人下一萃取器用新鮮萃取劑繼續萃取。多級逆流萃取由多個萃取器串聯組成，其特點是料液與萃取劑分別由兩端加入，溶劑與料液互成逆流接觸。 2.1.3.2吸附法:附法是利用吸附劑與抗生素之間的分子引力而將抗生素吸附在吸附劑上。常用的吸附劑有活性炭、氧化鋁、大孔吸附樹脂等.大孔吸附樹脂適合于吸附各種抗生素，它不僅可吸附脂溶性化合物，而且可以吸附水溶性化合物.例如，姬生寶等藤黃灰鏈霉菌發酵液中的抗真菌活性成分SLl03采用X一5型吸附樹脂對活性物質進行分離純化，對吸附飽和的X一5樹脂柱用去離子水沖洗，然后用50的甲醇洗去雜質和色素，再用50的乙醇4mLmin的流速下進行洗脫，合并活性高的洗脫液，濃縮后靜置48h得到SLl03的粗結晶。通過對結晶進行分析，實驗結果表明，此結晶純度可達95以上；經過質譜分析，得知其為一種小分子量的抗生素，分子量為6625。2.1.3.3 離子交換法是利用某些生物藥物能在溶液中形成帶電粒子，與合成離子交換樹脂之間結合力的差異來進行分離的方法。帶電粒子與離子支換樹脂間的作用力是靜電力，它們的結合是可逆的。對強堿性產物宜選用弱酸性樹脂。對弱堿性產物宜選用強酸性樹脂；同理，弱酸產物宜用強堿性樹脂，強酸性產物宜用弱堿性樹脂。對樹脂的選擇還應要求對產物與主要雜質的吸附力有足夠的差異。由于抗生素分子體積較大，一般選擇大孔網狀樹脂。 2.1.3.4 沉淀法和結晶法：沉淀法廣泛用于蛋白質等大分子的提取中。它主要起濃縮作用，純化的效果較差，通常作為初步分離的一種方法。沉淀法分為5種類型：1)鹽析：加入高濃度的鹽使蛋白質沉淀，其機理為蛋白質分子的水化層被除去，而相巨吸引。2)加入有機溶劑：其機理為加入有機溶劑會使溶液的介電常數降低，從而使水分子的溶解能力降低，在蛋白質分子周圍，不易形成水化層。缺點是有機溶劑常會引起蛋白質失活。3)調pH至等電點：此法沉淀能力不強，常加入有機溶劑，使沉淀完全。4)加入非離子型聚合物：如PEG等。結晶抗生素工業中常用的結晶方法有以下4種：蒸發結晶，化學反應結晶，過飽和冷卻結晶和鹽(溶)析結晶等。2.1.3.5色譜法色譜法是基于混合物各組分在兩相(固定相和流動相)之間的不均勻分配進行分離的一種方法。其基本原理是由于混合物中的各個單一組分對兩相不同的親和力和向兩相不均勻擴散的可能性而導致在同定相和移動相之間的不均勻分配，從而得到分離。按兩相所處的狀態分；液相色譜 以液體作為流動相，可分為液固色譜及液液色譜； 氣相色譜，以氣體作為流動相，可分為氣固色譜及氣液色譜。按操作形式分柱色譜，將固定相裝在柱內，使混合物溶液沿一個方向移動而得以分離；紙色譜，用濾紙作為固定相載體，混合物溶液點樣后，用流動相展開，以達到分離鑒定的目的；薄層色譜，在玻璃板上涂布固體粉末薄層為固定相，點樣后用流動相展開，以達到分離鑒定的目的。本實驗中采用薄層色譜(Thin Layer Chromatography) 常用TLC表示，又稱薄層層析，屬于固一液吸附色譜。用硅膠G薄板(20cm15era0025cm)分離海洋細菌菌株產生的抗真菌物質，展開劑用甲苯：乙酸乙酯：90甲酸(VvV)=6：3：1可得到不同真菌活性物質，采用硅膠G薄板以正丁醇：乙酸：水(VVV)=3：1：1為展層劑進行操作，通過生物顯影技術，確定分離的為單一組分的抗生素。也可采用高效液相色譜9HPLC)分離方法，參考孫強等人所做的實驗，用反相色譜柱SinochromODSBPC1(8300mm46mm id，5“m)對放線菌菌株MY02發酵液中的抗真菌活性物質SN06進一步純化，以甲醇一水系統(80：20，VV)為流動相，流動相流速為04mLrain，柱溫30，紫外檢測波長304nm。8044min和17347min兩個吸收峰的收集液具有明顯的活性，純度較高。【5】在本實驗中可依次采用上述方法中的大孔吸附樹脂吸附法,薄層色譜法(TLC),正相硅膠柱層析法,反相柱層析法,高效液相色譜法等各種手段結合來完成。從而達到有效分離純化抗生素的目的，得到所需的活性化合物2.2 抗菌活性物質組分的確定 所用的試驗方法如下：TLC生物自顯影（將樣品溶解，點樣于TLC板上，用展開劑展開。取滅過菌的培養皿加入融化的固體培養基10 mL，水平放置使之凝固作為底層。將上述TLC板正面朝上貼放其上，將20 mL剛滅菌的上層培養基冷至40左右，加入50l培養24 h的指示菌懸液，混勻，將含菌培養基小心澆注到TLC板表面，形成約3 mm厚的覆蓋層。將培養皿置4C冰箱中倒置12 h，待TLC板上成分充分擴散到培養基中。培養皿置于37培養箱中培養24 h后，在培養基表面加噻唑藍(MTT)溶液12 mL(MTT水溶液為橙黃色，濃度5 mgmL-1)，染色23 min，吸去多余染色液，于37培養1 h，觀察及拍照。） 首先對菌株擴大培養,配制光合細菌液體培養基，然后通過大孔吸附樹脂聯用提取菌液中的活性物質，對固相萃取物進行TLC分析，并且制備薄層層析活性追蹤，對活性條帶進行TLC分析及生物自顯影，最后對活性條帶及H103樹脂本底HPLC分析，同時采用紫外光譜，質譜，核磁共振譜，紅外光譜等分析方法對組分結構進行分析即可確定該活性化合物的分子組成。2 研究發現培養基的不同對海洋微生物菌種多樣性及活性菌株的發現幾率有很大關系，提示我們要增加培養基的多樣性來提高活性菌的發現幾率。3. 總結 發酵液中分離純化抗生素，是抗生素新藥研發的難點。根據抗生素性質的差異建立的分離純化方法各不相同，因此采用合理有效的分離純化技術路線是新型抗生素研究成功與否的關鍵。本實驗采用了各種常用的分離純化抗生素的方法從海洋微生物提取有抗菌活性的抗生素并希望通過對各種方法進行優化處理找到更好的分離純化方法以在獲得新抗生素資源的同時獲得較高的產率。參考文獻【1】焦炳華，穆軍，許強芝，繆輝南，抗感染藥學Anti- infection pharmacy 2004年6月第1卷第1期海洋微生物來源新抗生素的研究【2】謝則平，海洋厭氧細菌SRB