紙層析法測定葉綠素摘要：紙層析是用濾紙作為載體的一種色層分析法，其原理主要是利用混合物中各組分在；流動相和固定相的分配比（溶解度）的不同而使之分離。濾紙上吸附的水為固定相（濾紙纖維常能吸20%左右的水），有機溶劑如乙醇等為流動相，色素提取液為層析試樣。把試樣點在濾紙的濾液細線位置上，當流動相溶劑在濾紙的毛細管的作用下，連續不斷地沿著濾紙前進通過濾液細線時，試樣中各組份便隨著流動相溶劑向前移動，并在流動相和固定相溶劑之間連續一次有一次的分配。結果分配比比較大的物質移動速度較快，移動距離較遠；分配比較小的物質移動較慢，移動距離較近，試樣中各組分分別聚集在濾紙的不同的位置上，從而達到分離。關鍵詞：紙層析，葉綠素，分離，速度前言：初步掌握提取和分離葉綠體中色素的方法。葉綠體中有幾種色素。胡蘿卜素、葉黃素、葉綠素a、葉綠素b隨層析液在濾紙上擴散速度不同，可以分出四條色素帶。材料和方法：（1） 材料：用具：剪刀一把、干燥的定性濾紙、50ml的燒杯及100ml的燒杯各3個、白紙3張、試管架一個、研缽一個、玻璃漏斗一個、尼龍布或紗布、毛細血管一只、藥勺一個、10ml量筒一只，天平一只，試管3支、紙板一塊、棉塞3個、培養皿3個、刻度尺、注射器一只、蓋玻片 試劑：丙酮、無水乙醇、層吸液（20份石油醚、2份丙酮、1份苯配置而成）、二氧化硅、碳酸鈣、碳酸鈉 材料：新鮮的菠菜葉、青菜葉（2） 方法和步驟： 1提取綠色葉片中的色素 （1）取幾片綠色的葉片，去掉葉柄和主脈，用天平稱取 5g 葉片，剪碎，放 入研缽中。 （2）向研缽中放入少許二氧化硅和碳酸鈣，進行充分的研磨。用量筒量取 5 ml 丙酮，倒入研缽中，迅速充分研磨。 （3） 將研磨液迅速倒入小玻璃漏斗中進行過濾。 將濾液收集到一個小試管中， 及時用棉塞將試管目塞緊。 2制備濾紙條 取一塊預先干燥處理過的定性濾紙，將濾紙剪成長 10 cm、寬 1cm 的濾紙 條，在距濾紙條一端 1cm 處用鉛筆畫一條細的橫線。 3畫濾液細線、 用毛細吸管吸取少量濾液，沿鉛筆線均勻地畫出一條細而直的濾液細線。待 濾液于后，再畫 23 次。 4分離葉綠體中的色素 將 3 mL 層析液倒入燒杯中，將濾紙條（有濾液細線的一端朝下）略微料靠著 燒杯的內壁，輕輕地插入到層析液中，隨后用培養皿蓋蓋上燒杯；（注意，不能讓濾紙上的濾液細線觸到層析液。紙層析法中所用的有機溶劑如丙酮等，一般有揮發性、并有一定毒性，使用時要注意密封層析，避免吸入過多有害揮發物。）結果： 經過1015分鐘后，觀察分離后色素帶的分布。最上端橙黃色為胡蘿卜素，其次黃色為葉黃素，再下面藍綠色為葉綠素a，最后的黃綠色為葉綠素b。討論與分析：分析：紙層析法依據極性相似相容原理，是以濾紙纖維的結合水為固定相，而以有機溶劑作為流動相。由于樣品中各物質分配系數不同，因而擴散速度不同，從而達到分離的目的。一般用于葉綠體中色素的分離，葉綠體中色素主要包括胡蘿卜素、葉黃素、 1葉綠素a、葉綠素b，它們在層析液中的溶解度不同，溶解度大的隨層析液在濾 紙上擴散地快，反之則慢；含量較多者色素帶也較寬。最后在濾紙上留下4條色素帶，所以利用紙層析法 能清楚地將葉綠體中的色素分離。討論：1、 葉綠素等是脂溶性的有機分子，根據相似相溶的原理，葉綠素等色素分子溶于有機溶劑而不溶于有極性的水。故在研磨和收集葉綠色素時要用丙酮或乙醇等有機溶劑而不用水。 2、 葉綠素分布于基粒的片層薄膜上，加入少許二氧化硅是為了磨碎細胞壁、質膜、葉綠體被膜和光合片成，使色素溶解于丙酮中。 3. 破碎的細胞中含有草酸等有機酸，葉綠素分子中含有的Mg元素處于不穩定化合態，鎂離子與有機酸結合將導致色素分子破壞。加入少許碳酸鈣使得鈣離子與有機酸結合，減少鎂離子的轉移，防止研磨時葉綠體色素的破壞。所以在研磨時加入適量的碳酸鈣，同時加入碳酸鈉的道理亦如此。 4、 在過濾時選用脫脂棉或紗布，而不用濾紙。原因主要有下：（1）色素分子比較大，不容易透過濾紙； （2）濾紙有較強的吸附性而使色素吸附在濾紙上，從而降低色素濃度，影響實驗效果；（3）葉綠素是脂溶性，根據相似相容的原理，脫脂棉可以減少實驗過程中色素的流失，增強實驗效果。 5、 根據物理學中的毛細現象，畫濾紙細線前濾紙必須經過干燥處理，是為了阻止水分子堵塞濾紙中的毛細管而影響層析液的擴散。但如果用火烤的話，會使濾紙纖維變形同時破壞啦毛細管，而影響層析液的擴散。 6、 由于液面的不同位置表面張力不同，紙條接近液面時，其邊緣的表面的張力較大，層析液沿濾紙邊緣擴散過快，而導致色素帶分離不整齊的現象。故而，在插入層析液的濾紙條一端剪去兩個角。 7、 為了防止濾紙條倒入層析液中而使層析實驗失敗。同時，防止因液體表面張力引起層析液沿濾紙條向上的“壁流”而導致色素溶解。 8、 色素分離的原理：紙層析是用濾紙作為載體的一種色層分析法，其原理主要是利用混合物中各組分在；流動相和固定相的分配比（溶解度）的不同而使之分離。濾紙上吸附的水為固定相（濾紙纖維常能吸20%左右的水），有機溶劑如乙醇等為流動相，色素提取液為層析試樣。把試樣點在濾紙的濾液細線位置上，當流動相溶劑在濾紙的毛細管的作用下，連續不斷地沿著濾紙前進通過濾液細線時，試樣中各組份便隨著流動相溶劑向前移動，并在流動相和固定相溶劑之間連續一次有一次的分配。結果分配比比較大的物質移動速度較快，移動距離較遠；