蛋白質工程 活動1 如果想讓某一個生物的性狀在另外一個生物的身上表達 常用的方法有哪些 基因工程成果豐碩 植物方面提高植物的抗蟲 抗病 抗逆性改良植物的品質動物方面提高動物生長速度改善畜產品的品質用轉基因動物生產藥物用轉基因動物作器官移植的供體研制藥物基因治療 科學家面臨新的問題 在已研究過的幾千種酶中 只有極少數可以應用于工業生產 絕大多數酶都不能應用于工業生產 這些酶雖然在自然狀態下有活性 但在工業生產中沒有活性或活性很低 干擾素是由效應t細胞產生的糖蛋白 可阻斷細胞分裂間期 抑制dna復制 從而可用于治療疾病 但干擾素在體外很難保存 玉米中賴氨酸的含量比較低 在已研究過的幾千種酶中 只有極少數可以應用于工業生產 絕大多數酶都不能應用于工業生產 這些酶雖然在自然狀態下有活性 但在工業生產中沒有活性或活性很低 這是因為工業生產中每一步的反應體系中常常會有酸 堿或有機溶劑存在 反應溫度較高 在這種條件下 大多數酶會很快變性失活 提高蛋白質的穩定性是工業生產中一個非常重要的課題 一般來說 提高蛋白質的穩定性包括 延長酶的半衰期 提高酶的熱穩定性 延長藥用蛋白的保存期 抵御由于重要氨基酸氧化引起的活性喪失等 干擾素是一種抗病毒 抗腫瘤的藥物 將人的干擾素的cdna在大腸桿菌中進行表達 產生的干擾素的抗病毒活性為106u mg 只相當于天然產品的十分之一 雖然在大腸桿菌中合成的 干擾素量很多 但多數是以無活性的二聚體形式存在 為什么會這樣 如何改變這種狀況 研究發現 干擾素蛋白質中有3個半胱氨酸 第17位 31位和141位 推測可能是有一個或幾個半胱氨酸形成了不正確的二硫鍵 研究人員將第17位的半胱氨酸 通過基因定點突變改變成絲氨酸 結果使大腸桿菌中生產的 干擾素的抗病性活性提高到108u mg 并且比天然 干擾素的貯存穩定性高很多 例如 玉米中賴氨酸含量比較低 天冬氨酸激酶 352位的蘇氨酸 二氫吡啶二羧酸合成酶 104位的天冬酰胺 天冬氨酸激酶 異亮氨酸 二氫吡啶二羧酸合成酶 異亮氨酸 玉米中賴氨酸含量可提高數倍 蛋白質工程的概念 蛋白質工程是指以蛋白質分子的結構規律及其與生物功能的關系作為基礎 通過基因修飾或基因合成 對現有蛋白質進行改造或制造一種新的蛋白質 以滿足人類對生產和生活的需求 前提 了解蛋白質的結構和功能 原理 改造基因 基因修飾或基因合成 目的 定向改造或制造蛋白質 基因表達流程圖 蛋白質工程流程圖 從預期的蛋白質功能出發設計預期的蛋白質結構推測應有的氨基酸序列找到相應的脫氧核苷酸序列 討論 1 怎樣得出決定這一段肽鏈的脫氧核苷酸序列 請把相應的堿基序列寫出來 活動2某多肽鏈的一段氨基酸序列是 丙氨酸 色氨酸 賴氨酸 甲硫氨酸 苯丙氨酸 丙氨酸 gcu gcc gca gcg色氨酸 ugg賴氨酸 aaa aag甲硫氨酸 aug苯丙氨酸 uuu uuc 每種氨基酸都有對應的三聯密碼子 只要查一下遺傳密碼子表 就可以將上述氨基酸序列的編碼序列查出來 但是由于上述氨基酸序列中有幾個氨基酸是由多個三聯密碼子編碼 因此其堿基排列組合起來就比較復雜 至少可以排列出16種 同學們可以根據學過的排列組合知識自己排列一下 首先應該根據三聯密碼子推出mrna序列為gcu 或c或a或g uggaaa 或g auguuu 或c 再根據堿基互補配對規律推出脫氧核苷酸序列 cga 或g或t或c accttt 或c tacaaa 或g 2 確定目的基因的堿基序列后 怎樣才能合成或改造目的基因 dna 可以通過人工合成的方法獲取或基因的定點誘變技術來改變 基因會發生突變 突變可以自發 也可以誘發 這是每個稍有生物學知識的人都知道的常識 但在加拿大生物化學家m 史密斯 1932 2000 發明定點突變法之前 突變株的產生必須經由自然界或用化學等方法誘使基因體突變 這類方法屬于隨機突變 突變株必須在生物性狀上有所改變 才能確定有突變發生 但除非用分子生物方法或遺傳方法找到此突變處 否則無法確定突變位置 也就是說 這種突變是盲目的 而史密斯發明的定點突變法卻是有目的的 該法可經由設計好的寡核苷酸 在任何一個基因片段上進行隨意或設計好的突變 也就是說 這種突變是預先設定好的 所以也有人將該法稱為 反遺傳法 有意思的是這一給生命科學研究及應用領域帶來革命性突破的方法竟然是史密斯和其同事在喝咖啡時閑聊出來的 現在 幾乎每個生物實驗室都會用定點突變法來研究基因或蛋白質的功能 蛋白質工程的主要步驟通常包括 1 從生物體中分離純化目的蛋白 2 測定其氨基酸序列 3 借助核磁共振和x射線晶體衍射等手段 盡可能地了解蛋白質的二維重組和三維晶體結構 4 設計各種處理條件 了解蛋白質的結構變化 包括折疊與去折疊等對其活性與功能的影響 5 設計編碼該蛋白的基因改造方案 如定點突變 6 分離 純化新蛋白 功能檢測后投入實際使用 二 蛋白質改造工程舉例1 水蛭素改造水蛭素是水蛭唾液腺分泌的凝血酶特異抑制劑 它有多種變異體 由65或66個氨基酸殘基組成 水蛭素在臨床上可作為抗栓藥物用于治療血栓疾病 為提高水蛭素活性 在綜合各變異體結構特點的基礎上提出改造水蛭素主要變異體hv2的設計方案 將47位的asn 天冬酰胺 變成lys 賴氨酸 使其與分子內第4或第5位thr 蘇氨酸 間形成氫鍵來幫助水蛭素n端肽段的正確取向 從而提高凝血效率 試管試驗活性提高4倍 在動物模型上檢驗抗血栓形成的效果 提高20倍 2 生長激素改造生長激素通過對它特異受體的作用促進細胞和機體的生長發育 然而它不僅可以結合生長激素受體 還可以結合許多種不同類型細胞的催乳激素受體 引發其他生理過程 在治療過程中為減少副作用 需使人的重組生長激素只與生長激素受體結合 盡可能減少與其他激素受體的結合 經研究發現 二者受體結合區有一部分重疊 但并不完全相同 有可能通過改造加以區別 由于人的生長激素和催乳激素受體結合需要鋅離子參與作用 而它與生長激素受體結合則無需鋅離子參與 于是考慮取代充當鋅離子配基的氨基酸側鏈 如第18和第21位his 組氨酸 和第17位glu 谷氨酸 實驗結果與預先設想一致 但要開發作為臨床用藥還有大量的工作要做 3 胰島素改造天然胰島素制劑在儲存中易形成二聚體和六聚體 延緩胰島素從注射部位進入血液 從而延緩了其降血糖作用 也增加了抗原性 這是胰島素b23 b28氨基酸殘基結構所致 利用蛋白質工程技術改變這些殘基 則可降低其聚合作用 使胰島素快速起作用 該速效胰島素已通過臨床實驗 4 治癌酶的改造癌癥的基因治療分二個方面 藥物作用于癌細胞 特異性地抑制或殺死癌細胞 藥物保護正常細胞免受化學藥物的侵害 可以提高化學治療的劑量 皰疹病毒 hsv 胸腺嘧啶激酶 tk 可以催化胸腺嘧啶和其它結構類似物磷酸化而使這些堿基3 oh缺乏 從而阻斷dna的合成 殺死癌細胞 hsv tk催化能力可以通過基因突變來提高 從大量的隨機突變中進行篩選出一種酶 在酶活性部位附近有6個氨基酸被替換 催化能力20倍以上 蛋白質工程的發展很快 研究工作很多 以上僅介紹了幾個例子 蛋白質工程除了用于改造天然蛋白質或設計制造新的蛋白質外