實用文檔1 培養基 MS培養基（Sigma公司） B5培養基（pH 5.5） Content mg/L Content mg/L Content mg/LKNO32500 ZnSO4.7H2O 2.0 Nicotinic 1 CaCl2.2H2O 150 H3BO3 3.0 Thiamine HCl 10 MgSO4.7H2O250 KI 0.75 Pyrindoxine 1 NaH2PO4.H2O150 Na2MoO4.2H2O0.25 m-Inositol 100 FeSO4.7H2O 27.8 CoCl2.6H2O 0.025 Glycine 200 MnSO4.H2O 10 Na2EDTA 37.3 Kinetin 0.1 CuSO4.5H2O0.025 IAA0.1-1改良的1/4 Hoagland 培養液（mM, pH6.0）： Content mM Content mM KNO31.25 ZnSO40.002 Ca(NO3)21.50 H3BO30.050 MgSO40.75 KCl 0.050 KH2PO40.5 (NH4)6Mo7O240.075 FeSO40.072 CuSO40.0015 Na2EDTA 0.072 Na2SiO30.1 2 植物材料的常規種植 擬南芥種子均勻地播撒于1/3 B5液體培養基浸潤的蛭石上，塑料膜遮蓋至種子萌發，揭開膜，讓其自然生長，適當間苗，烤苗至蛭石表面干燥后加水。置于23 oC，16/8 h的光照培養間中生長。 3 擬南芥種子的表面滅菌處理1）擬南芥種子在4 C下春化3-5天。2）在超凈臺上用70%酒精處理種子2-5分鐘。3）棄去酒精，用無菌水洗1-2次。4）將種子用15% Bleach （KAO公司） 處理15分鐘，間歇振蕩。5）用無菌水洗4-6次，每次充分振蕩混勻。6）將種子懸浮在滅菌的0.1% Agar中。7）均勻地將種子播撒在B5培養基平皿中。4 植物材料的水培體系 擬南芥種子經表面滅菌處理后均勻播撒于1/2 MS固體培養基上， 10-15粒/皿，生長2周后，小心地將其轉入水培體系中。 水培體系是由培養皿及起支撐作用的錫箔紙組成。培養皿中盛適當的液體培養基（通常用上述改良的1/4 Hoagland培養液）；錫箔紙上留出相距適當的小洞后，蓋于培養皿之上。將擬南芥幼苗的根小心地經由錫箔紙上的小洞浸入培養液中。塑料膜覆蓋，2-3天后揭去。整個體系置于光照培養間中生長，每3-6天更換一次培養液。 5 擬南芥T-DNA插入突變體的篩選方法到網站/tdnaprimers.html輸入salk號設計引物LP、RPT-DNA LB： LBb1: GCGTGGACCGCTTGCTGCAACT LBa1: TGGTTCACGTAGTGGGCCATCG用于PCR擴增。采用雙引物法，分別用LPRP，BPRP擴增基因組DNA。方法：1) 將擬南芥突變體種子播種于MS培養基平皿中，生長2周后，將其轉入蛭石中，待長至抽苔期準備DNA的提取。2) DNA提取緩沖液的配制：成分終濃度Tris-HCl (pH 8.0)10 mMEDTA-Na2312.5 mMSLS （月桂酰肌氨酸鈉）1 %PVPP （polyvinylpolypyrollidone）1 %3) 剪取一片葉于1.5 ml Eppendorf管中，液氮充分研磨。4) 加40 ml 提取緩沖液，渦旋充分混勻。5) 95中水浴20分鐘，間或混勻幾次。6) 12,000 rpm離心15分鐘。7) 吸取上清于一新的Eppendorf管，取10 ml稀釋50倍。然后取稀釋后的DNA用于PCR擴增。PCR擴增體系為（25 ml體系）：模板1 mlrTaq0.2 ml10rTaq buffer2.5 mldNTP(2.5 mM)2 mlLP或L