博士學位論文 ac s 轉座子標簽在水稻中的應用 摘要 通過構建三個雙元載體的質粒p d s e p d s g 和p a c 和農桿菌介導的t d n a 轉基因 發展了一個帶有基因捕獲器和增強子捕獲器的a c d s 轉座子系統作為插 入序列標簽來研究水稻基因組 主要研究結果如下 1 通過農桿菌介導的t d n a 轉基因 共獲得1 1 8 8 株獨立可育的轉基因水稻植 株 其中來自只本睛的轉基因水稻為5 2 6 株包括n a c 轉p a e 5 1 株 n e 轉 p d s e 3 6 1 株 n o 轉p d s g 1 1 4 株 來自中花一1 1 號的轉基因水稻為6 6 2 株 包括c a c 轉p a c 1 7 6 株 c e 轉p d s e 3 2 0 株 c g 轉p d s g 1 6 6 株 潮霉素 抗性試驗表明t d 1 q a 在水稻染色體中平均插入位點數為1 3 個 通過 s o u t h e r n 雜交分析 t d n a 在水稻基因組中的平均拷貝數為1 8 個 2 t d n a 插入到水稻基因區的g c 含量分布與插入到基因組d n a 的分布基 本一致 通過對1 2 6 個t d n a 插入位點兩側5 0 0 b p 水稻序列g c 含量分析 表明插入位點處水稻基因組d n a 平均g c 含量為4 2 5 8 3 的t d n a 插 入子落在水稻g c 含量為3 0 5 0 的基因組區域 有5 0 個t d n a 4 0 插入 到水稻的基因區 3 t d n a 在水稻基因組d n a 的插入 既有準確的插入 又有不準確的插入 在1 8 2 個t d n a 與水稻的結合序列析中 只有6 9 個序歹t j 3 8 中沒有 f i l l e r d n a 的存在 而存在f i l i e r d n a 的序列有1 1 3 個 占總數的6 2 長 度從l b p 到數百b p 不等 通過對6 1 個大于5 0 b p 的f i l l e r d n a 分析 發現來 自t d n a 內部的d n a 序列是f i l l e r d n a 的主要來源 總共有4 9 個占總數 的8 0 有8 個 1 3 是來自于t d n a 以外的雙元載體主干序列 另有4 個 7 與水稻序列和載體序列都沒有同源性 在1 5 8 個右邊界旁鄰序列中有7 7 個保持了特征序列t g a 而左邊界序列的變化比較大 沒有發現在某一特定 核苷酸斷裂的現象 在t d n a 左邊界與水稻基因組d n a 直接相聯的序列中 發現有1 8 個堿基的同源序列存在 另外還發現有1 6 例t d n ar b l b 的直接串聯 4 d s 元件附近的基因組d n a 結構對跳躍頻率有影響 p c r 分析表明 來自1 1 個d s 親本總共2 0 個f 2 群體其d s 跳躍頻率變化范圍為o 4 0 而親本眈 元件拷貝數對d s 的跳躍頻率影響不大 s o u t h e m 雜交結果表明 d s 在f 2 群體中的重新插入頻率和獨立插入頻率都保持在7 0 以上 有d s 插入但沒 有a c 元件而穩定插入的f 2 植株頻率變化范圍在1 4 3 3 之問 5 d s 在水稻基因組d n a 中有插入到基因區的傾向 在2 9 個d s 插入位點旁鄰 v f 博士擘位論文 ac 9 s 轉座子標簽在水稻申的應用 序列的分析中 有1 7 個 5 9 插入到了基因區 其中有6 個在啟動子區域 7 個在外顯子區域 有4 個在內含子區域 另外還有1 0 個序列位于非基因區 域 瓜插入位點的兩側會形成8 b p 水稻堿基的正向重復 6 在d s 獨立插入的f 2 水稻植株的葉 根 化和種予中 增強子捕獲器的g u s 活性的檢出率為2 8 基因捕獲器的g u s 活性檢出率為2 2 關鍵詞 水稻 t d n a f i l i e r d n a a c d s 轉座子 基因捕獲器 增強子 捕獲器 v i i 博士學位論文 ac d s 轉座子標簽在水稻中的應用 a b s t r a c t b yc o n s t r u c t i n gt h r e eb i n a r yv e c t o r s p d s e p d s ga n dp a c a n dt d n a t r a n s f o r m a t i o nm e d i a t e db y a g r o b a c t e r i u m w ed e v e l o p e da l l a c d ss y s t e mh a r b o r i n g g e n et r a pa n de n h a n c e rt r a pf o rg e n et a g g i n gi nr i c e t h ef o l l o w i n gr e s u l t sa r e o b t a i n e d 1 t h r o u g ha g r o b a c t e r i u m m e d i a t e dt d n at r a n s f o r m a t i o n 118 8i n d e p e n d e n t f e r t i l et r a n s g e n i cr i c el i n e sw e r ep r o d u c e d i nj a p o n i c an i p p o n b a r e 5 2 6l i n e s w e r eo b t a i n e di n c l u d i n g51n a cl i n e st r a n s f r o m e dw i t hp a c 3 6 1n el i n e s t r a n s f r o m e dw i t hp d s ea n d1 1 4n gl i n e st r a n s f r o m e dw i t hp d s g i n j a p o n i c a z h o n g h u a 11 6 6 2l i n e sw e r eo b t a i n e di n c l u d i n gt 7 6c a c l i n e st r a n s f o r m e dw i t h p a c 3 2 0c el i n e st r a n s f o r m e dw i t hp d s ea n d16 6c gl i n e st r a n s f o r m e d v i m p d s gh y g r o m y c i nr e s i s t a n c et e s t sr e v e a l e dt h a tt r a n s g e n i cp l a n t sc o n t a i na n a v e r a g eo f1 3l o c io f t d n a i n s e r t s s o u t h e r nb l o ta n a l y s i so f t r a n s g e n i cp l a n t s i n d i c a t e dt h a tt h e yc o n t a i na v e r a g e1 8t d n ac o p i e si nr i c eg e n o m e 2 t h ed i s t i l b u t i o no fg cc o n t e n to fr i c eg e n er e g i o ni n s e r t e db yt d n aw a sv e r y s i m i l a rw i t ht h a to ff l e eg e n o m ed n a t h r o u g hg cc o n t e n ta n a l y s i so f5 0 0 b p r i c eg e n o m i cd n a f l a n k i n gi n s e r t i o ns i t e i n1 2 6l i n e s w ef o u n dt h a tt h ea v e r a g e g cc o n t e n to ft h ei n s e r t i o ns i t ew a s4 2 5 a n d8 3 o ft h et d n ai n s e r t i o nl i n e s l o c a t ei nag e n o m i cd o m a i nr a n g i n gf r o m3 0 t o5 0 i nt e r m so fg cc o n t e n t f i f t y 4 0 o u to ft h et o t a l12 6t d n ai n s e r t i o nl i n e sw e r ei nt h eg e n er e g i o no f r i c e 3 b o t hp r e c i s ei n s e r t i o na n di m p r e c i s ei n s e r t i o ne x i s t e dw h e nt d n ai n t e g r a t e d i n t or i c eg e n o m i cd n a a m o n gt o t a l18 2t d n a r i c ed n a j u n c t i o n s o n l y6 9 3 8 w e r ef o u n dw i t hn of i l i e r d n a w h e r e a st h er e m a i n i n g1 13 6 2 c o n t a i n e df i l l e r d n af r o ml b pt os e v e r a lh u n d r e db a s ep a i r s b ya n a l y s i so f 6 1 f i l l e r d n al a r g e rt h a n5 0 b p w ef o u n dt h a t4 9 8 0 呦w e r ef r o mt h es e q u e n c e w i t h i nt d n a e i g h t 1 3 o ft h e mw e r ef r o mb a c k b o n es e q u e n c eo fb i n a r y v e c t o ro u to ft d n a i na d d i t i o n 4 7 h a dn os i m i l a r i t yw i t hr i c eo rv e c t o r s e q u e n c e s t h r e es i g n a t u r en u c l e o t i d e st g ao ff i g h tb o r d e rr e p e a tw e r ek e p ti n 7 7o u to f15 8t d n ai n s e r t i o n s n os p e c i f i cn u c l e o t i d ew h e r et h et d n al e f t b o r d e rb r o k e nw a sf o u n dw h e nt d n ai n t e g r a t e di n t o r i c eg e n o m i cd n a m i c r o h o m o l o g o u sf r a g m e n t sf r o mlt o8 b pw e r eo b s e r v e di nt h es e q u e n c e sn e x t v 博士學位論文 a a d s 轉座子標簽在水稻中的應用 t ot h el e f tb o r d e ro ft d n ai n s e r t i o n s s i x t e e nd i r e c tl i g a t i o no ft d n a r i g h t b o r d e rt ol e f tb o r d e rw e r eo b s e r v e di no u re x p e r i m e n t s 4 t h es t r u c t u r eo fg e n o m i cd n aa ti n s e r t i o ns i t ea f f e c t e dd st r a n s p o s i t i o n f r e q u e n c yg r e a t l y d se x c i s i o nf r e q u e n c yv a r i e df r o m0 t o4 0 i n2 0f 2 p o p u l a t i o n sd e r i v e df r o m l1d i f f e r e n td sp a r e n t sw i t hp c ra n a l y s i s i tw a s f o u n dt h a td sc o p yn u m b e rh a dl i t t l ei n f l u e n c eo nd st r a n s p o s i t i o nf r e q u e n c y s o u t h e r nb l o ta n a l y s i sr e v e a l e dt h a tm o r et h a n7 0 o f d se l e m e n tr e i n s e a e di n t o r i c eg e n o m i cd n aa n dm o s to ft h e m 7 0 w e r ei n d e p e n d e n ti nf 2p o p u l a t i o n 1 4 3 3 o f d sr e i n s e r t i o nf 2p l a n t sw e r es t a b l ew i t h o u t a ce l e m e n t 5 d si si n c l i n e dt oi n t e g r a t ei n t og e n er e g i o no fr i c eg e n o m i cd n a s e v e n t e e no u t o ft o t a l2 9 5 9 f l a n k i n gs e q u e n c e so fd se l e m e n t sw e r ei d e n t i f i e dt ob ew i t h i n g e n er e g i o no fr i c eg e n o m i cd n a i n c l u d i n g6i np r o m o t e r 4i ne x o na n d7i n i n t r o n a n o t h e r1 0f l a n k i n gs e q u e n c e so f d se l e m e n t sw e r ep r o v e dt ob ew i t h i n i n t e r g e n i cr e g i o n s 8 b pd u p l i c a t i o no fr i c eg e n o m i cd n aa p p e a r e da ti n s e r t i o n s i t eo f d se l e m e n t 6 a m o n gt h ef 2p l a n t sw i t hi n d e p e n d e n td si n s e r t i o n s a p p r o x m a t e l y2 8 o f e n h a n c e rt r a pa n d2 2 o fg e n et r a pi n s e r t sd i s p l a y e dg u s a c t i v i t yi nl e a v e r o o t s f l o w e r sa n ds e e d s k e yw o r d s r i c e o r y z as a t i v al t d n a f i l l e r d n a a c d s t r a n s p o s o n g e n et r a p e n h a n c e rt r a p x 博士學位論文 ac b s 轉座子標簽在水稻中的應用 致謝 本研究是在導師吳平教授悉心指導下完成的 研究傾注著導師無數的心血 在此謹向導師表示最誠摯的謝意 導師開闊的眼界 廣博的知識 敏銳的思維 嚴謹求實的治學態度 對事業和人生信念的執著追求 百折不撓永不停息的奮斗 精神時刻激勵著我 催我奮進 將使我受益終生 在攻讀博士學位論文期間 承蒙傅承興老師 蔣德安老師 朱誠老師 易可 可老師 吳運榮老師 姜華武博士 李靖老師 陳漢民老師 劉非燕老師的多方 幫助和指導 感謝中國水稻研究所的孫宗修老師 傅亞萍老師在轉基因技術上的 幫助和提供p d s b a r l 3 0 0 p u b i t s 載體 感謝農業與生物技術研究所的毛碧增 老師提供p c a m b i a l 3 0 0 載體 感謝傅向東博士提供p a h c 2 5 質粒 感謝課題組 成員張帆 陳雙燕 汪明怡 周沽 汪少敏 徐敏 段瑞君同學的大力協助 感 謝侯興亮 劉洪家 佃蔚敏 吳忠長 毛傳藻 鄭炳松 楊玲 王首鋒 杜黎明 張麝龍 朱世華 黃幗 齊曉朋 王芳 樊葉楊等同學在平時學習和工作中給我 的幫助 感謝所有關心幫助過我的同學和朋友 在此我要特別感謝我的妻子葉紈芝對我的理解與支持 感謝我的父親 母親 岳父 岳母 哥哥 姐姐的關心與愛護 是他們使我能夠全身心地投入到學習和 研究當中 會維正 2 0 0 3 年5 月于杭州華家池 v 博士學位論文 a c n s 轉座子標簽在水稻中的應用 縮寫 a b r c a c d s a d a d h a l s a s b a c b p c o d a d n a e n i e s t g f p g u s h p t h y g l a a h i p c r l u c n a a n a m n o s n p t l i o s e x p p a c p e g p p t t a l l p c r t d n a t e t i t i r x g l u c y a c 縮略詞表 a b b r e v i a t i o n 英文 t h e a r a b i d o p s i sb i o l o g i c a lr c s o u r c ec e n t e r a c t i v a t o r d i s s o c i a t i o n a r b i t r a r yd e g e n e r a t ep r i m e r a l c o h o ld e h y d r o g e n a s e a c e t o l a c t a t es y n t h a s e a c e t o s y r i n g o n e b a c t e d a la r t i f i c i a lc h r o m o s o m e s b a s ep a i r c y t o s i n e d e a m i n a s e d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d e n h a n c e r ll n h i b i t o r e x p r e s s e ds e q u e n c et a g g r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n 8 一g l u c u r o n i d a s e h y g r o m y c i np h o s p h o t m n s f e r a s e h y g r o m y c i n i n d o l e a c e t a m i d eh y d r o l a s e l n v e r s ep c r l u c i f e r a s e n a p h t h a l e n ea c e t i ca c i d n a p h t h a l e n ea c e t a m i d e n o p a l i n es y n t h a s e n e o m y c i np h o s p h o t r a n s f e m s e e x p a n s i n p l d e r i v e da r t i f i c i a lc h r o m o s o m e s p o l y e t h y l e n eg l y c o l p h o s p h i n o t h r i c i n t h e r m a la s y m m e t r i ci n t e r l a c e dp c r t r a n s f e r r e dd n a t r a n s p o s o ne l e m e n t t u m o 卜i n d u c i n g t e r m i n a li n v e r t e dr e p e a t 5 b r o m o 4 c h l o r o 3 i n d o l y l 1 3 dg l u c u r o n i d e y e a s ta r t i f i c i a lc h r o m o s o m e s v 中文 擬南芥生物資源中心 激活子 分離子 隨機簡并引物 乙醇脫氫酶 乙酰乳酸合成酶 乙酰丁香酮 細菌人一l 染色體 堿基對 胞嘧啶脫胺酶 脫氧核糖核酸 增強子 抑制子 表達序列標簽 綠色熒光蛋向 1 3 d 葡糖醛酸糖苷酶 潮霉素磷酸轉移酶 潮霉素 吲哚乙酰胺水解酶 反向p c r 熒光索酶 祭乙酸 荼乙胺 胭脂堿合成酶 新霉素磷酸轉移酶 水稻膨脹素 p 1 人l 染色體 聚乙二醇 草j 膦 熱不對稱交錯p c r 轉移d n a 轉座子元件 腫瘤誘導 t i 質粒 末端倒轉重復 5 溴 4 一氯 3 吲哚1 3 d 葡糖醛酸 酵母人i 染色體 博士學位論文 a c d s 轉座子標簽在水稻中的應用 第一章文獻綜述 1t d n a 作為插入序列標簽的研究進展 1 1 農桿菌介導的t d n a 遺傳轉化 t d n a 作為轉基因載體用于植物的遺傳轉化始于2 0 世紀八十年代 農桿菌 介導的t d n a 轉基因首先成功于雙子葉植物 隨著技術的進步與突破 特別是 在單子葉植物的轉化技術獲得突破成熟之后 利用t d n a 作為載體在單子葉植 物中的遺傳轉化也成為一種常規技術 因為這種方法簡便 成本低 穩定性好而 受到廣泛的青睞 目前t d n a 用作外源目的基因導入植物的載體 已經成為植 物遺傳育種 品種改良的一種有效先進的工具 因為t d n a 在轉基因植物基因組中比較隨機的分靠 所以無論是在雙予葉 還是單子葉植物中都已經被用作研究植物本身基因功能一種很好的插入序列標 簽 大大加快了植物基因功能的研究 1 1 1t d n a 的發現與應用 s m i t h 年l t o w n s e n d 發現植物冠嬰瘤病 c r o w ng a l ld i s e a s e 是農桿菌引發的 之 后對農桿菌的研究就廣泛的丌展起來了 冠嬰瘤病曾在法國 東歐和澳大利亞的 葡萄樹 核果樹和堅果樹上有大面積的發生 造成很大的危害 w h i t e 年u b r a u n 發現冠嬰瘤組織能在 f 常細胞不能生長的無激素培養基上無限制生長并且不需 要細菌的存在 l i n k 和e g g e r s 發現冠嬰瘤組織能產生生長素 發現細胞分裂素在 冠嬰瘤組織中大量存在 b r a u n 提出 腫瘤誘導因子 t u m o r i n d u c i n gp r i n c i p l e 假說 盡管這一假說對這一因子的本質不清楚 但推測染色體外存在一種遺傳物 質d n a 能使處于靜止狀態的植物細胞轉變為分裂活躍的細胞 隨著分子生物學技術的出現 s c h i l p e r o o r t 等發現無菌培養的冠嬰瘤含有細菌 來源的d n a 盡管在當時這一結論是有爭議的 但至l j 7 0 年代 科學家發現用高 溫培養的方法可以使農桿菌失去致瘤能力 并分離鑒定出一種與致瘤能力完全相 關的t i 質粒 t u m o r i n d u c i n gp l a s m i d v a nl a r e b e k e 等1 9 7 4 v a nl a r e b e k e 等1 9 7 5 z a e n e n 等1 9 7 4 這使得研究的范圍縮小到t i 質粒上 最終通過s o u t h e r n 雜交的方 式確定了轉移到植物細胞中的只是t i 質粒的一部分即t d n a t r a n s f e r r e dd n a c h i l t o n 等1 9 7 7 c h i l t o n 等1 9 7 8 d e p i c k e r 等1 9 7 8 以上內容摘自z u p a n 等 2 0 0 0 的綜述 博士學位論文 ac s 轉座子標簽在水稻中的應用 進一步研究發現 t d n a 兩端左右邊界為2 5 b p 的j 下向重復序列 即邊界序列 b o r d e rs e q u e n c e 分別稱之為左邊界o e f fb o r d e r l b 年u 右邊界 r i g h tb o r d e r r b 邊晃序列為保守序列 5 t g a c a c g a t a l a t t g g c g g g t a a a c 3 在t d n a 右邊界外還有一個2 4 b p 的超級驅動序列 o v e r d r i v es e q u e n c e t a a c t c g c t g t g t a t g t t t g t t t g 對t d n a 的轉移起增強子的作用 見王關 林1 9 9 8 p 1 4 0 利用農桿菌介導的t d n a 轉基因成功報道于1 9 8 3 年 m u r a i 等將種子貯藏蛋 白基因成功轉到向同葵和煙草并得到表達 之后利用農桿菌介導的t d n a 轉基因 在雙子葉植物中就成為了一種常規方法 1 1 2 農桿菌介導的t d n a 轉基因技術在單子葉植物中的研究進展 農桿菌介導的t d n a 轉基因在單子葉植物上取得突破之前 主要采用直接 轉化法 直接轉化法就是通過處理的裸露d n a 直接導入植物細胞 實現基因轉 化的一種技術 按技術原理來分 轉基因技術通常可分為物理法和化學法兩種 化學法又可分為聚乙二醇 p e g 介導基因轉化法 脂質體介導基因轉化法 物理 法又可分為電激法 e l e c t r o p o r a t i o n 介導基因轉化法 超聲波介導基因轉化法 顯 微注射 m i c r o i n j e c t i o n 介導基因轉化法 激光微束介導基因轉化法 基因槍轟擊 m i c r o p r o j e c t i l eb o m b a r d m e m 基因轉化法 另外還有萌發種子電泳法 花粉管通 道法 種子浸泡法等 其中z h a n g 和w u 1 9 8 8 首先報道了采用p e g 介導法得到第一例轉基因水稻 植株 t o r i y a m a 等 1 9 8 8 和z h a n g 等 1 9 9 8 炳個研究小組分別報道了水稻原生質 體電激法得到的轉基因水稻植株 但是兩者都需要原生質體的培養 原生質體的 培養本身就是一個復雜而且困難的方法 而且原生質體的再生頻率也不高 因此 這兩種方法在應用上都受到一定的限制 基因槍法由于對轉化受體的要求不高 而且轉化的效率商 兇此方法一經出現 就受到廣泛的應j j 并先后剛這一方法 在大豆 w a n g 等1 9 9 8 玉米 g o r d o n k a m m 等1 9 9 0 水稻 c h r i s t o u 等1 9 9 1 朱 冰等1 9 9 6 小麥 v a s i l 等1 9 9 2 黑麥 s o m e r s 等1 9 9 2 等農作物上獲得了轉基因 植株 農桿菌介導t d n a 在單子葉植物中的轉基因在2 0 世紀9 0 年代取得突破 c h a n 等 1 9 9 2 1 9 9 3 用水稻幼胚為材料獲得一些轉基因水稻植株 并對一株水稻 進行了遺傳分析 s o u t h e r n 雜交證明轉基因t d n a 能夠遺傳到后代中 h i e i 等 1 9 9 4 在水稻中的轉基因工作則以無可辯駁的證據表明農桿菌不但可以轉化單 子葉植物而且還可以和雙子葉植物一樣有效 他們采用水稻成熟胚的盾片愈傷組 織 用乙酰丁香酮 a c e t o s y r i n g o n e a s 誘導農桿菌 l b a 4 4 0 4 e h a l 0 1 f l 盛染愈傷 2 博士學位論文 ac n s 轉座子標簽在水稻中的應用 組織 使轉化頻率大大提高 并獲得了大量的轉基因水稻植株 他們對眾多轉基 因水稻植物進行了詳細的遺傳分析 還有就是獲得了充分的分子證據 包括 s o u t h e r n 雜交和t d n a 邊界序列信息的獲得 之后 d o n g 等 1 9 9 6 在爪哇稻中 轉化成功 a l d e m i t a 等 1 9 9 6 轉化秈稻也獲得了成功 r a s h i d 等 1 9 9 6 在秈稻中 轉化取得了同粳稻中一樣高的轉化效率 這些工作表明農桿菌介導的t d n a 轉 基因在單子葉植物中已經完全的確立起來了 1 2t d n a 在植物基因組d n a 中整合的機制 t d n a 整合到植物基因組中具體機制至今不清 t d n a 在植物中的插入被 認為是隨機的 它可以插入到任何一條植物染色體 但是插入位點通常具有以下 特點 t d n a 優先整合到轉錄活躍的植物基因位點 t d n a 偏愛插入到a t 豐富區 植物d n a 的靶位點與t d n a 有小的同源性 m i c r o h o m o l o g y b r u n a u d 等2 0 0 2 m a y e r h o f e r 等1 9 9 1 t i n l a n d1 9 9 6 s z a b a d o s 等2 0 0 2 目前 主要有 以下幾種關于t d n a 整合到植物基因組d n a 中的模型 1 2 1 雙鏈斷裂修復模型 雙鏈斷裂修復模型首先是植物靶d n a 產生雙鏈斷裂 解旋的靶d n a 與雙 鏈t d n a 退火 單鏈部分被3 一5 外切酶或修復系統中單鏈特異的核酸內切酶 去除 然后進行修復連接 并由此導致了d n a 的整合和缺失 靶d n a 和t d n a 缺失程度由靶d n a 與t d n a 退火時形成的短的d n a 互補順序的位置所決定 m a y e r h o f e r 等1 9 9 1 1 2 2 單鏈缺口修復模型 單鏈缺口修復模型是在靶d n a 上形成一個缺刻 然后由于部分解旋或 5 一3 外切酶消化形成缺口 單鏈t d n a 靠近缺口 出于兩鏈存在短的d n a 互 補順序 于是退火形成異質雙鏈 未配對的3 和5 單鏈部分被除去 t d n a 末 端與靶d n a 連接 在靶d n a 鏈的互補鏈產生缺刻 以游離的3 d n a 末端為引 物修復合成第二條t d n a 鏈 m a y e r h o f e r 等1 9 9 1 1 2 3t d n a 串聯重復的形成 t d n a 整合到植物基因組中不單單以單個t d n a 的形式 在很多情況下是 以兩個或兩個以上的t d n a 串聯形式整合到基因組d n a 中的 串聯的形式有 r b r b r b l b 及l b l b 等種類 b u c k 等 1 9 9 9 認為這種t d n a 的串聯是在 t d n a 整合到植物基因組d n a 之前形成的 他們的理由是因為在串聯的t d n a 博士學位論文 ac d s 轉座子標簽在水稻中的應用 交接處沒有發現有植物基因組d n a 的存在 更為復雜的是多個t d n a 的串聯插入 k r i z k o v a 和h r o u d a 1 9 9 8 發現在兩 個相對完整t d n a 串聯重復的交接還有t d n a 的成份存在 他們認為這種整合 方式可能是t d n a 整合時發生的 首先由一條t d n a 與植物染色體d n a 通過 幾個互補堿叢配剝結合 然后另外防條t d n a 鏈通過幾個堿基的互補配對分別 與第一條t d n a 的3 和5 端結合 游離出的t d n a 單鏈分別與染色體d n a 3 端和5 端結合 通過對游離的t o d n a 降解及以t d n a 為模板的d n a 合成而使 多個t d n a 整合到植物基因組中 1 3t d n a 作為插入序列標簽在植物功能基因組學研究中的應用 1 3 1t d n a 在雙予葉植物功能基因組學研究中的應用 t d n a 作為插入序列標簽在雙子葉植物中的應用主要以在擬南芥中為例 擬南芥植株小 種子小而多 一株植株能產生大約1 0 0 0 0 粒種子 生長周期短 基因組小而成為雙子葉植物的模式植物 刪a 插入突變體在擬南芥中早在2 0 世紀9 0 年代初就受到關注 并7 r 始 建立大規模的插入突變體庫 f e l d m a n n l 9 9 1 f o r t s t h o e f e l 等1 9 9 2 k o n c z 等1 9 9 2 為了全世界科研人員研究的方便 早在1 9 9 1 年9 月在美國俄亥俄州立人學就建 立了擬南生物資源中心a b r c t h ea r a b i d o p s i sb i o l o g i c a lr e s o u r c ec e n t e r 以收 集 保存 分發各種突變體 現在a b r c 已經建立了一個龐大的擬南芥插入突 變體庫 包括很大一部分來源于t d n a 插入突變體 并且還在以每年數萬的數 量在增長 通過擬南芥的網站h t t p w w w a r a b i d o p s i s o r g 可獲得擬南芥t d n a 插入突變體 在擬南芥中 已經有大量的基因功能以t d n a 為插入序列標簽得 到研究 1 3 2t d n a 在單子葉植物功能基因組學研究中的應用 t d n a 作為插入序列標簽在單子葉植物功能基因組學研究中的應用比雙子 葉植物中的研究要遲得多 水稻作為單子葉植物是禾本科的模式植物 其大規模 的插入突變體庫見于2 0 0 0 年j e o n 和j e o n g 等在2 0 0 3 年的報道 在我國也有多 家單位正在丌展建立大規模的插入突變體庫 朱j f 歌等2 0 0 1 但是至今沒有 報道利用t d n a 作為插入序列標簽在水稻中克隆新的基因 不過相信在廣大科 研工作者的努力下 必定能很好的利用t d n a 這一工具來研究水稻的基因功能 博士學位論文 a c d s 轉座子標簽在水稻中的應用 2a c d s 轉座子系統作為插入序列標簽的研究進展 2 1a c d s 轉座子系統的研究歷史 轉座子元件t e t r a n s p o s o ne l e m e n t 首先是由b a r b a r am e c l i m o c k 在2 0 世紀 三 四十年代研究玉米籽粒顏色變化時發現的 但一直沒有受到人們的重視 直 到六 七十年代在大腸桿菌g a l 和l a c 操縱子發現了可以轉移的插入序y l j i n s e r t i o n s e q u e n c e m c c l i n t o c k 的轉座子理論才被人們所重新認識和接受 轉座子在d n a 結構上具有一些共同的特點 一 在轉座子的兩端 存在術 端倒轉重復序列 t e r m i n a li n v e r t e dr e p e a t t i r 它們是轉座發生所必需的結構 而且至關重要 二 轉座子編碼轉座酶 t r a n s p o s a s e 其功能是促進轉座子的轉座 發生 三 受體d n a 上很短的一段靶序列 由于轉座子的插入 會在轉座子的 兩側形成正向重復序列 靶序列的正向重復序列長短由轉座子決定 每一類轉座 子造成的正向序列重復其堿基數目是確定的 玉米中的a c d s 轉座子系統 a c t i v a t o r d i s s o c i a t i o n 是研究的比較多的一個系 統 其中a c 是自主性 a u t o n o m o u s 成分 d s 是非自主性 n o n a u t o n o m o u s 成分 爿c 全長4 5 6 5 b p 具有l l b p 的木端倒轉重復序列t c a g g g t g a a a 自主 性爿c 元件還編碼一個的轉座酶基因 a ct r a n s p o s a s e 具有完整結構的爿c 元件能 夠發生自主性轉座 d s 在結構上缺乏編碼完整轉座酶基因的d n a 序列 但是保 留了j e 它血i 未端倒轉重復序列發生轉座作用所必須的結構 岡此d s 不能發小門 主性的轉座 但是在a c 提供轉座酶的情況下州樣能夠發生轉座 a c d s 轉座 f 在玉米 擬南芥和水稻基因組中插入位點處能形成8 b p 的正向重復序列 當彳c 或肪從插入位點割離 e x c i s i o n 割離的發生有可能是精確地發生在轉座子術端倒 轉重復序列兩側 也有可能是不精確的割離 通常會使原來的8 b p 重復序列的一 側或兩側缺少幾個堿基 這樣果會留下a c d s 曾經在此插入過的足跡 f o o t p r i n t 在玉米中 還存在有其它的轉座子系統如e n l 系統 e n h a n c e r i n h i b i t o r p e t e r s o n1 9 5 3 叉稱為s p r r d d s p m 系統 s u p p r e s s o r m u t a t o r m c c l i n t o c k1 9 5 4 自主性e r d s p m 元件長8 3 k b 編碼兩個基因t n p a 和t n p d 它們是轉座所必需 的 非自主性i d s p m 元件通常是有缺陷的e n s p m 元件 無法自身進行轉座 這 一轉座子系統的t i r 為1 3 b p 插入靶位點形成3 b p 的正向重復序列 與a c d s 一樣 不精確的割離會留下足跡 p e r e i r a 等1 9 8 5 利用a c d s 轉座子系統克隆的第一個基因是玉米的b r o n z e 基因 a c d s 作為 外源轉座子系統也已經成功的應用在矮牽牛 擬南芥 番茄 煙草等植物基因的 克隆中 a a r t s 等1 9 9 3 c h u c k 等1 9 9 3 j o n e s 等1 9 9 4 w h i t h a m 等1 9 9 4 特 博士學位論文 a c d s 轉座子標簽在水稻中的應用 別是在擬南芥中許多具有重要功能的基因都是以a c d s 轉座子系統作為序列標 簽進行克隆的 2 2a c i d s 轉座了霸i 突變體庫構矬 1 1 的成川 a c d s 轉座子系統在突變體構建中的應用形式可以有多種多樣 按a c 與d s 是否構建在一起 能否自主性發生轉座 一般分成二元系統與一元系統 下面就 以這兩種系統來說明a c d s 在突變體庫構建中的應用 2 2 1 二元系統 二元系統是將a c 與d s 分開構建到雙元載體t d n a 中 自主性的a c 元件 可以通過基因工程技術將轉座發生所必須的5 和3 末端切除 因此不會發生轉 座 而只提供完整的轉座酶基因 d s 元件含有轉座發生所必須的t i r 結構 而 不含有轉座酶基因 d s 元件的內部則可以做各種修飾 如加報告基因 抗生素 基因 除草劑基因等 在制作突變體庫的時候 首先是獲得a c t d n a 和d s t d n a 的轉基因親本 植株 然后通過雜交的方式產生大量的f 1 種子 f l 自交產生f 2 在f 2 代中對跳 躍的轉座子進行選擇 出于a c 轉座酶的存在 d s 就不會穩定 為了獲得穩定的 d s 插入子 可以通過遺傳分離的方法選擇不帶a c 的d s 插入植株 二元系統另一個優點是可以在雜交自i 選擇a c 與c b 起始植株的拷貝數 并 且通過雜交獲得大量的轉座頻率穩定的同一f 1 種子 這樣通過少數幾個起始轉 基因植株就可以獲得大量的 b 插入突變體 s u n d a r e s a n 等1 9 9 5 i z a w a 等n 9 9 7 首先利用二元系統來創建水稻突變體 n a k a g a w a 2 0 0 0 等對雙元系統在水稻 中的跳躍規律作了比較仔細的分析 2 2 2 一元系統 一元系統是將a c 轉座酶基因與d s 轉座子元件構建在同一個載體中 無須 通過如二元系統雜交的步驟 方便之處就是可以在轉基因植物t l 代中可以分離 篩選到d s 跳躍的植株 一元系統又可以分為a c 自主轉座系統與a c d s t d n a 系統 a c d s t d n a 系統是將a c 轉座酶基因置于d s 轉座元件的外部 當d s 跳到另一位置時 可以 獲得與a c 轉座酶分離而穩定的d s 插入子 這一點與二元系統相類似 a c 自主轉座系統是利用4 c 元件的自主轉座特性 含有完整的轉座結構與轉 座酶基因 轉座酶基因置于轉座子的內部 它的特點是在后代可以進行連續的 跳躍而不能得到穩定的突變體 e n o k i 等 1 9 9 9 利用自主性轉座子爿c 在水稻 6 博士學位論文 ac d s 轉座子標簽在水稻中的應用 中做了詳細的分析 他們認為爿c 自主轉座系統可以應用于水稻功能基因組學的 研究當中 2 3a c d s 轉座子割離 插入的檢測方法 a c d s 轉座子在植物基因組發生的跳躍 既可以發生在體細胞中 這樣的跳 躍稱之為體細胞跳躍 s o m a t i