生物技術制藥復習資料（Biotechnological Pharmaceutics）第一章 緒論一、概述1.概念：生物藥物（生物制藥）是泛指包括生物制品在內的生物體的初級和次級代謝產物或生物體的某一組成部分，甚至整個生物體用作診斷和治療疾病的醫藥品。|采用現代生物技術人為地創造一些條件，借助某些微生物、植物或動物來生產所需的醫藥品，叫做生物技術制藥。2.技術范疇：基因工程、細胞工程、酶工程、發酵工程、生化工程以及后來衍生出來的第二代、第三代的蛋白質工程、抗體工程、糖鏈工程和海洋生物技術等。3.相關學科：有生物學（含微生物學、分子生物學、遺傳學等）、化學、工程學（化學工程、電子工程等）、醫學、藥學、農學等。但從基礎學科來講，生物學、化學和工程學是其主要的學科。4.應用范圍：（1）醫藥；（2）農業；（3）食品；（4）工業；（5）環境凈化；（6）能源。二、生物技術的發展簡史1.傳統生物技術階段主要產品：乳酸、酒精、丙酮、丁酸、檸檬酸、淀粉酶。生產的特點：過程簡單，大多屬兼氣發酵或表面培養，生產設備要求不高，產品化學結構簡單，屬初級代謝產物。2.近代生物技術階段主要產品：抗生素、維生素、甾體、氨基酸；食品工業的工業酶制劑、食用氨基酸、酵母、啤酒；化工業的酒精、丙酮、丁醇、沼氣；農林業的農藥；環境保護業的生物治理污染。生物技術的特點：（1）產品類型多，初級（氨基酸、酶、有機酸）、次級（抗生素）、生物轉化（甾體）；（2）生物技術要求高，純種、無菌、通氣，產品質量要求也高；（3）生產設備規模大；（4）技術發展速度快。3.現代生物技術主要產品：胰島素、干擾素、生長激素等。生物技術的內容包括：（1）重組DNA技術及其它轉基因技術（基因工程）；（2）細胞和原生質體融合技術（細胞工程）；（3）酶或細胞的固定化技術（酶工程）；（4）植物脫毒和快速繁殖技術；（5）動物細胞大量培養技術；（6）動物胚胎工程技術；（7）現代發酵技術；（8）現代生物反應工程和分離工程技術；（9）蛋白質工程技術；（10）海洋生物技術。三、醫藥生物技術的新進展1.基礎研究不斷深入2.新產品不斷出現3.新試劑、新技術不斷出現4.新型生物反應器和新分離技術不斷出現四、我國的醫藥生物技術五、醫藥生物技術的新進展1.利用新發現的人類基因，開發新型藥劑。2.新型疫苗的研制。3.基因工程活性肽。4.其他。如疾病早期診斷，PCR，單克隆抗體。第二章 生物藥物概論第一節 生物藥物的來源、特性、分類與制備一、生物藥物的來源1.生物藥物是指運用生物學、醫學、生物化學等的研究成果，從生物體、生物組織、細胞、體液等，綜合利用物理學、化學、生物化學、生物技術和藥學等學科的原理和方法制造的一類用于預防、治療和診斷的制品。2.生物藥物的原料來源天然的生物材料：人體、動植物、微生物和各種海洋生物。人工制得的生物原料如基因工程技術制得的微生物或細胞。二、生物藥物的特性1.藥理學特性（優點）（1）治療的針對性強。細胞色素C用于治療組織缺氧所引起的一系列疾病；（2）藥理活性高。注射用的純ATP可以直接供給機體能量；（3）毒副作用小，營養價值高。蛋白質、核酸、糖類、脂類等生物藥物本身就直接取自體內；（4）生理副作用常有發生。生物體之間的種屬差異及個體差異，用藥時會發生免疫反應和過敏反應。2.生產、設備中的特殊性（1）原料中的有效物含量低。激素、酶在體內含量極低；（2）穩定性差。生物藥物的分子結構中具有特定的活性部位，該部位有嚴格的空間結構，一旦結構破壞，生物活性也就隨著消失；（3）易腐敗。生物藥物營養價值高，易染菌、腐敗。生產過程中應低溫、無菌；（4）注射用藥有特殊要求。均一性、安全性、穩定性、有效性。3.檢驗上的特殊性由于生物藥物具有生理功能，故生物藥物不僅要有理化檢驗指標，更要有生理活性檢驗指標。三、生物藥物的分類1.（生物制藥的研究內容）按生物工程學科范圍分為四類分類：（1）發酵工程制藥；（2）基因工程制藥：（3）細胞工程制藥；（4）酶工程制藥。2.按藥物的結構分類：（1）氨基酸及其衍生物類藥物；（2）多肽和蛋白質類藥物；（3）酶和輔酶類藥物；（4）核酸及其降解物和衍生物類藥物；（5）糖類藥物；（6）脂類藥物；（7）細胞生長因子；（8）生物制品類。3.按來源分類：（1）人體組織來源。療效好、無副作用、來源有限。（2）動物組織來源。動物臟器，來源豐富、價格低廉、可以批量生產。（3）植物組織來源。中草藥，酶、蛋白質、核酸。（4）微生物來源。抗生素、氨基酸、維生素、酶。（5）海洋生物來源。動植物、微生物。4.按生理功能和用途分類：（1）治療藥物。腫瘤、艾滋病、心腦血管疾病等。（2）預防藥物。傳染性強的疾病，疫苗、菌苗、類毒素。（3）診斷藥物。速度快、靈敏度高、特異性強。免疫診斷、酶診斷、基因診斷試劑。（4）其它。生化試劑、保健品、化妝品、食品、醫用材料。四、生物藥物的制備過程1.生物藥物原料的選擇、預處理與保存方法（1）原料選擇原則有效成分含量高，原料新鮮，來源豐富、易得，產地較近，原料中雜質含量少，成本低。（原料 粗提 精提）生物技術 單元操作（2）預處理與保存預處理：就地采集后去除結締組織、脂肪組織等不用的成分，將有用成分保鮮處理，收集微生物原料時，要及時將菌體與培養液分開，進行保鮮處理。保存方法：冷凍法，適用于所有生物材料，-40；有機溶劑脫水法，丙酮，適用于原料少、價值高，有機溶劑對原料生物活性無影響；防腐劑保鮮，常用乙醇、苯酚等，適用于液體原料，如發酵液、提取液。第二節 人體來源的藥物一、人體來源藥物的特點與研究意義1.人體來源的藥物的特點（1）安全性好。不易產生副反應。（2）效價高、療效可靠。質量好、效價高。（3）穩定性好。凍干制劑10度以下可保存2年以上。3.研究意義（1）資源的有限性；（2）意義。3.蛋白質類藥物分離提取方法（1）沉淀法（鹽析、有機溶劑、等電點）；（2）按分子大小分離（超濾、透析、層析、離心）；（3）電荷（離子交換、層析、電泳、等電聚焦）；（4）親和層析法（酶與底物、抗原與抗體）。二、人體來源藥物的種類和用途1.人血液成分制品（1）紅細胞制劑；（2）白細胞濃縮液；（3）血小板制劑；（4）新鮮冰凍血漿（FFP）。2.血漿的綜合利用（1）傳輸蛋白質；（2）免疫球蛋白；（3）凝血系統蛋白；（4）補體系統蛋白；（5）蛋白酶抑制物類。3.人體液細胞中的活性物質體液細胞包括紅細胞、白細胞、淋巴細胞、血小板、成纖維細胞等。活性物質主要是干擾素、白介素-2、超氧化物歧化酶等。4.人類來源的其他原料的利用5.細胞因子6.人體激素激素是調節機體正常發育和活動的重要物質，是由一類動物體內腺體細胞和非腺體組織細胞所分泌的化學信息分子。激素主要有：蛋白質激素、多肽激素、氨基酸衍生物激素、脂類激素。激素在體內含量很低，研究目的不是用生物體來提取，而是用于指導用其他原料進行生產和如何正確使用激素藥物進行治療。現在的生產方法有：用動物提取，半合成法，基因工程法。第三節 動物來源的藥物三、動物來源藥物的種類與用途1.動物多肽與蛋白質類藥物（1）動物多肽藥物的重要性與種類重要性：腦垂體所分泌的多肽激素，藥效顯著，且毒副作用小，通過對這些活性物質的結構和功能的研究，有助于我們設計和研制新型藥物。（2）動物蛋白類藥物2.動物酶與輔酶類藥物種類：促消化酶類（胃酶可口服，蛋白酶，胰酶）；消炎酶類（溶菌酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶等可提高毛細血管通透性，消退浮腫）；治療心血管疾病（纖溶酶、尿激酶、凝血酶）；抗腫瘤的酶（天冬氨酰酶、谷氨酰胺酶、半胱氨酸酶、組氨酸酶）。3.動物核酸類藥物4.動物糖類藥物5.動物脂類藥物：脂肪酸及其衍生物、磷脂類、膽酸類、卟啉和衍生物。第四節 植物來源的藥物一、糖類單糖、多糖、寡糖。二、脂類、類脂、固醇及其衍生物三、蛋白質、多肽及其活性物質四、化合物特別小分子化合物及其衍生物。是近幾年來研究最為活躍的領域。實例：超氧化物歧化酶的制備、精油、南瓜多糖等。第五節 海洋生物藥物一、取得重要進展的領域（1）海洋生物抗癌活性物質；（2）海洋生物抗菌活性物質；（3）海洋生物抗心血管疾病活性物質；（4）海洋生物抗放射性活性物質及酶類；（5）海洋前列腺素；（6）海洋保健品、螺旋藻；（7）海洋醫用生物材料。鱟試劑、河豚毒素試劑、甲殼素、珊瑚。二、我國發展海洋藥物的主攻方向1.海洋生物活性物質的研究2.大力促進海洋生物技術在開發海洋藥物上的應用3.開發新的海洋中成藥和新劑型4.充分利用海洋資源，開發海洋保健品5.開發新的海洋醫用生物材料第三章 生物技術制藥單元操作與藥物生產的質量控制第一節 生物技術制藥單元操作一、概述生物藥物的提取和純化可分為5個主要步驟：預處理、固液分離、濃縮、純化和產品定型（干燥，制丸，擠壓，造粒，制片），每一步驟都可采用各種單元操作。在提取純化過程中，要盡可能減少操作步驟，因為每一操作步驟都不可避免帶來損失。操作步驟多，總收率就會下降。二、提取純化的工藝論證工藝驗證，就是通過系統的方法得到關于生產工藝的書面材料，證明并保證生產過程能始終如一地生產出特定的高質量的產品。工藝驗證的范圍：廠房設施、工程儀表、機械設施、生產環境、工藝條件、計算機軟件、介質、原材料、半成品、成品、操作人員素質和測試方法等。以上各個部分都要有驗證材料或試驗數據，根據這些材料和數據寫出驗證報告。當工藝的某一部分有較大變動時（如大修、工藝條件變化），要進行重新驗證，即再驗證。再驗證是針對某一部分的行動，而不是整個工藝過程的驗證，因而比較簡單、快速、易行。驗證的實施過程包括以下步驟：提出驗證要求，組織驗證小組，制定驗證方案，實施驗證試驗，寫出驗證報告，再驗證等。三、原料選擇、預處理與固液分離技術（一）原料選擇的基本準則1.在大量的信息資料和實踐經驗的基礎上，選擇目標原料；2.選擇有效成分含量高的新鮮材料；3.來源豐富易得；4.制造工藝簡單易行；5.成本比較低；6.原料的采集不破壞生態環境，選擇對環境友好的原材料資源，防止生物入侵。（二）細胞破碎機械法：珠磨法、高壓勻漿法、超聲波破碎法、X-press法等。非機械法：酶溶法、化學滲透法、凍融法、干燥法等。（三）離心1.差速離心法2.速率區帶離心法速率區帶離心法是在離心前于離心管內先裝入密度梯度介質（如蔗糖、甘油、KBr、CsCl等），待分離的樣品鋪在梯度液的頂部、離心管底部或梯度層中間，同梯度液一起離心。（四）膜分離法1.薄膜分離（1）超濾：根據溶質分子和懸浮粒子是否通過多孔膜來進行篩分。（2）反滲透：以高分子透過性薄膜為分離介質，在超過溶液滲透壓力的情況下，使溶液中的溶劑透過薄膜，同時使溶質和不溶物阻截在膜前。（3）微孔濾膜：由高分子材料制成的薄膜過濾介質，可以過濾一般介質不能截留的細菌和微粒。膜的孔徑在0.210m。（4）滲析：它是利用多孔膜兩側溶液的濃度差使溶質從濃度高的一側通過膜孔擴散到濃度低的一側從而得到分離的過程。（5）電滲析：電滲析是基于離子交換膜能選擇性的使陰離子或陽離子通過的性質，在直流電場的作用下使陰陽離子分別透過相應的膜以達到從溶液中分離電解質的目的。2.膜分離設備（1）板框式膜組件；（2）卷式膜組件；（3）管式膜組件；（4）中空纖維膜組件。四、沉淀法1.鹽析法利用不同的蛋白質在高濃度鹽溶液中，溶解度不同程度的降低來進行分離純化。在低鹽濃度下，溶解度隨著鹽濃度升高而增加，稱鹽溶作用；當鹽濃度不斷升高時，不同蛋白質的溶解度又以不同程度下降并先后析出沉淀，稱鹽析作用。優點：設備和條件要求低，安全應用范圍廣泛。在高鹽情況下，蛋白質不易發生變化，一般在室溫下操作。缺點：分級分離能力不高。鹽析時應注意的幾個問題：（1）鹽飽和度：由于蛋白質的結構和性質不同，鹽析要求的飽和度也不同。要按工藝要求，正確計算飽和度。（2）pH值的選擇：蛋白質在pI時的溶解度最小。因此，進行鹽析時的pH，要選擇在被分離蛋白質的pI附近。（3）蛋白質濃度（蛋白質的溶解度）：在相同條件下，蛋白質濃度越大越易沉淀，使用鹽的飽和度極限也愈低。蛋白質濃度愈高，其他蛋白質共沉作用也愈強，這是不希望的。選擇適當的蛋白質濃度，可避免共沉的干擾。（4）溫度：一般在室溫下進行，濃鹽對蛋白質有保護作用。但對溫度敏感的，要在低溫下進行。常在0-4范圍內迅速操作。如尿激酶。（5）鹽析沉淀物的脫鹽：鹽析的沉淀分離后，經脫鹽才能獲得純品。最常用的脫鹽方法是透析，時間一般較長，應常換透析液，注意防止污染。2.有機溶劑沉淀法利用不同蛋白質在不同濃度的有機溶劑中的溶解度差異而分離目的蛋白質的方法。蛋白質的沉淀與溶解，與溶劑的介電常數有關。降低溶液的介電常數，使其溶解度變小，同時，還破壞蛋白質的水化膜而使蛋白質沉淀析出。有機沉淀法應注意的問題：（1）控制工藝過程的溫度：整個操作規程應在低溫下進行，而且最好是同一溫度。（2）防止溶劑局部溫度過高：加入有機溶劑時攪拌要均勻，速度要適當，避免局部濃度過高，引起沉淀物的破壞、變性或失活。（3）及時處理沉淀物：沉淀物經過濾或離心后，要立即用水或緩沖液溶解，降低有機溶劑的濃度。（4）pH的選擇：在待沉淀蛋白質的pI附近（，蛋白質在pI時的溶解度最小）。（5）有機溶劑是酶和蛋白質的變性因素，尤其是對敏感酶類。3.等電點沉淀法利用蛋白質在等電點時的溶解度最低，而各種蛋白質又具有不同的等電點的特性進行分離的工藝過程。4.水溶性非離子型聚合物沉淀法在一定的pH值下，鹽濃度越高，所需PEG時濃度越低，溶液的pH越接近目的物的等電點，沉淀所需PEG的濃度越低。五、萃取（一）雙水相萃取雙水相體系的形成是兩種天然或合成的親水性聚合物水溶液相互混合，由于較強的斥力或空間位阻，相互之間無法滲透，在一定條件下，即可形成雙水相體系。雙水相萃取的技術特征：（1）體系有生物親和性。（2）體系能進行萃取性的生物轉化。（3）體系能與細胞相結合，操作既節省萃取設備和時間，又避免了胞內酶的損失。（4）親和萃取可大大提高分配系數和萃取專一性。（5）任何兩相體系，都不要求特殊的處理就可與后續純化工藝相銜接。（6）開發廉價新型的雙水相體系。（二）超臨界流體萃取1.技術原理在超臨界狀態下，將超臨界流體與待分離的物質接觸，使其有選擇性地把極性大小、沸點高低和分子量大小的成分依次萃取出來。2.萃取裝置超臨界萃取裝置從功能上大體可分為八部分：萃取劑供應系統、低溫系統、高壓系統、萃取系統、分離系統、改性劑供應系統、循環系統和計算機控制系統。3.超臨界流體萃取（SFE）的特點（優點）（1）可以在接近室溫（35-40）及CO2氣體籠罩下進行提取，有效地防止了熱敏性物質的氧化和逸散。（2）使用SFE是最干凈的提取方法，由于全過程不用有機溶劑，因此萃取物絕無殘留溶媒，同時也防止了提取過程對人體的毒害和對環境的污染，是100%的純天然（產物中無雜質）；（3）萃取和分離合二為一，當包含溶解物的CO2-SCF流經分離器時，由于壓力下降使得CO2與萃取物迅速成為兩相（氣液分離）而立即分開，不僅萃取效率高而且能耗較少，節約成本（SCF立方英尺）；（4）CO2是一種不活潑的氣體，萃取過程不發生化學反應，且屬于不燃性氣體，無味、無臭、無毒，故安全性好；（5）CO2價格便宜，純度高，容易取得，且在生產過程中（可）循環使用，從而降低成本；（6）壓力和溫度都可以成為調節萃取過程的參數。通過改變溫度或壓力達到萃取目的。六、層析法1.離子交換層析。2.凝膠層析。3.親和層析。七、電泳技術（一）醋酸纖維素薄膜電泳。（二）瓊脂糖凝膠電泳。（三）聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）。（四）等電聚焦電泳技術。八、其它技術（一）濃縮是指低濃度溶液通過除去溶劑變為高濃度溶液的過程。常在提取后和結晶前進行，有時也貫穿于整個制藥過程。（二）結晶是利用某些藥物具有形成晶體的性質是目標藥物（溶質）呈晶態從溶液中析出的過程。（三）干燥是從濕的固體生物藥物中，除去水分或溶劑而獲得相對或絕對干燥制品的工藝過程。它也是一種蒸發，但不同于濃縮。通常包括原料藥的干燥和制成臨床制劑的干燥。（1）常壓干燥。通風與加熱結合。成本低，干燥量大。但時間長，易污染。（2）減壓干燥。利用專用設備減壓加速，使溶劑迅速蒸發。時間短，溫度低。制藥常用方法。（3）噴霧干燥。將液體通過噴射裝置噴成霧滴后，在一定流速的熱氣流中，迅速蒸發干燥的方法。第二節 生物技術藥物生產的質量控制什么是藥品的六個“P”？1.什么是GAP？GAP：英文名稱“Good Agricultural Practice”的縮寫。直譯為“良好的農業規范（因為中藥材栽培或飼養主要屬于農業范疇）”，在中藥行業譯為“中藥材生產質量管理規范”。 2.什么是GCP？GCP：英文名稱“Good Clinical Practice”的縮寫。中文名稱為“藥品臨床試驗管理規范”， 是規范藥品臨床試驗全過程的標準規定，其目的在于保證臨床試驗過程的規范，結果科學可靠，保護受試者的權益并保障其安全。3.什么是GLP？GLP：英文名稱“Good Laboratory Practice”的縮寫。中文名稱為“藥品實驗室管理規范”。目前，在我國是指于 2003年9月1日起施行藥物非臨床研究質量管理規范（局令第2號）。 4.什么是GSP？GSP：英文名稱“Good Supply Practice”的縮寫。中文名稱為“藥品經營質量管理規范”，它 是控制醫藥商品流通環節所有可能發生質量事故的因素從而防止質量事故發生的一整套管理程序。5.什么是GUP？GUP：英文名稱“Good Use Practice”的縮寫。中文名稱為“藥品使用質量管理規范”，在我國是指 醫療機構藥劑質量管理規范。 6.什么是GMP？GMP：英文名稱“Good Manufacturing Practice”的縮寫。中文名稱為“藥品生產質量管理規范”，在我國，GMP是指 國家藥品監督管理局于1999年3月18日通過，6月18日發布，8月1日起開始正式實施的藥品生產質量管理規范（局令9號）。這個規范是藥品生產和質量管理的基本準則，適用于藥品制劑生產的全過程和原料生產中影響成品質量的關鍵工序。它是一種強制性認證，沒有通過認證的生產企業或生產車間已于2004年7月1日實行強制性停產。 第四章 基因工程制藥第一節 概述問題：基因工程菌生產藥物的優點？第二節 基因工程藥物生產的基本過程主要程序是：目的基因的克隆，構建DNA重組體，將DNA重組體轉入宿主菌構建工程菌，工程菌的發酵，外源基因表達產物的分離純化，產品的檢驗等。基因工程藥物的生產是一項十分復雜的系統工程，可分為上游和下游兩個階段。上游階段是研究開發必不可少的基礎，它主要是分離目的基因、構建工程菌（細胞）。下游階段是從工程菌（細胞）的大規模培養一直到產品的分離純化、質量控制等。第三節 基因工程藥物的分離純化基因工程藥物具有下列特點：（1）目的產物在初始物料中含量較低；（2）含目的產物的初始物料組成復雜；（3）目的產物的穩定性差，具有生物活性的物質對pH、溫度、金屬離子、有機溶劑、剪切力、表面張力等十分敏感，容易失活、變性；（4）種類繁多，包括有大、中、小分子、結構簡單或復雜的有機化合物，以及結構復雜及性質各異的生物活性物質；（5）應用面廣，對其質量、純度要求高，甚至要求無菌、無熱原等。一、建立分離純化工藝的依據1.含目的產物的起始物料的特點：（1）菌種類型及其代謝特征。（2）原材料和培養基的來源及其質量。（3）生產工藝和條件。包括滅菌方法和條件、生產方式、生產周期、生產能力、工藝控制條件、因素及方式等。（4）初始物料的物理、化學和生物學特性。2.物料中雜質的種類和性質3.目的產物特性4.產品質量的要求二、分離純化的基本過程基因工程藥物分離純化一般不應超過4-5個步驟，包括細胞破碎、固液分離、濃縮與初步純化、高度純化直至得到純品以及成品加工。三、分離純化的技術1.細胞破碎與固液分離。2.目的產物的分離純化。3.非蛋白質類雜質的去除。分離純化技術應滿足下列要求：（1）技術條件要溫和，能保持目的產物的生物活性；（2）選擇性要好，能從復雜的混合物中有效地將目的產物分離出來，達到較高純化倍數；（3）收率要高；（4）兩個技術之間要能直接銜接，不需要對物料加以處理或調整，這樣可以減少工藝步驟；（5）整個分離純化過程要快，能夠滿足高生產率的要求。四、選擇分離純化方法的依據1.根據產物表達形式來選擇2.根據分離單元之間的銜接來選擇通常先運用非特異、低分辨的操作單元，以盡快縮小樣品體積，提高產物濃度，去除最主要的雜質；隨后采用高分辨率的操作單元：凝膠排阻色譜這類分離規模小、分離速度慢的操作單元放在最后。3.根據分離純化工藝的要求來選擇分離純化工藝應遵循以下原則：（1）具有良好的穩定性和重復性（能產業化）。（2）盡可能減少組成工藝的步驟。（3）組成工藝的各技術或步驟之間要能相互適應和協調，工藝與設備也能相互適應，從而減少步驟之間對物料的處理和條件調整。（4）在工藝過程中要盡可能少用試劑，以免增加分離純化步驟，或干擾產品質量。（5）分離純化工藝所用的時間要盡可能短，因穩定性差的產物隨工藝時間增加收率。（6）工藝和技術必須高效，收率高，易操作，對設備條件要求低，能耗低。（7）具有較高的安全性。在選擇后處理技術、工藝和操作條件時，要能確保去除有危險的雜質，保證產品質量和使用安全，以及生產過程的安全。第四節 基因工程藥物的質量控制一、原材料的質量控制二、培養過程的質量控制三、純化工藝過程的質量控制（產品有足夠的生理和生物學試驗數據資料，確證提純物分子批間保持一致性。外源蛋白質，DNA與熱原質都控制在規定限度以下）四、目標產品的質量控制質量控制主要要求：產品的鑒別、純度、活性、安全性、穩定性和一致性。1.產品的鑒別。2.純度分析。3.生物活性測定。4.穩定性考察。5.產品一致性的保證。（6.安全性）五、產品的保存1.液態保存（1）低溫保存；（2）在穩定pH條件下保存；（3）高濃度保存；（4）加保護劑保存。2.固態保存固態蛋白質比液態穩定，一般蛋白質含水量超過10%時容易失活。含水量降到5%時，在室溫或冰箱中保存比較穩定。凍干粉或結晶都具有強抗熱性和穩定性。第五章 細胞工程制藥第一節 概述細胞工程可分為動物細胞工程和植物細胞工程。動物細胞工程包括：細胞培養技術；細胞融合技術；胚胎工程技術；克隆技術。植物細胞工程包括：植物組織、器官培養技術；細胞培養技術；原生質體融合與培養技術；亞細胞水平的操作技術等。第二節 動物細胞工程制藥1.細胞融合。單克隆抗體。2.核移植就是將一個動物的細胞核，移植到卵細胞中，并發育成長。3.轉基因動物是指經人的有意干涉，通過實驗手段將外源基因導入動物細胞中并穩定地整合到動物基因組中，且能遺傳給子代的動物。4.動物細胞培養。是指離散的動物活細胞在體外人工條件下的生長、增殖的過程。第三節 植物細胞工程制藥1.組織及細胞培養。2.遺傳特性改造。3.轉基因植物。轉基因植物生產重組蛋白具有以下優點：1.與動物細胞培養相比，植物細胞培養條件簡單且易于成活，有利于遺傳操作；2.植物培養細胞具有全能性，能夠再生植株；3.轉基因植物中的外源基因可通過植物雜交的方法進行基因重組，進而在植物體內積累多基因；4.轉化植株系的種子易于貯存，有利于重組蛋白的生產和運輸；5.用動物細胞生產重組蛋白，可能污染動物病毒，這對人類可能造成潛在危險，而植物病毒不感染人類，所以用植物細胞生產重組蛋白更為安全；6.植物細胞有與動物細胞相似的結構和功能，有利于重組蛋白的正確裝配和表達。第四節 細胞工程制藥未來發展前景1.人源化抗體的研制和生產注入人體后會產生抗體（抗抗體）或激發免疫反應。2.啟動“分子藥田”工程3.實施“動物藥廠”計劃第六章 酶工程制藥第一節 概述酶工程（Enzyme Engineering）是酶學和工程學相互滲透結合、發展而形成的一門新的技術學科。酶工程的主要內容：酶的生產、分離純化、酶的固定化、酶及固定化的反應器、酶和固定化酶的應用。現代酶工程的主要（研究）內容：（1）酶的分離純化（提純）、大批量生產及新酶和酶的應用開發；（2）酶和細胞的固定化及酶反應器的研究，包括酶傳感器、反應檢測等；（3）酶生產中基因工程技術的應用及遺傳修飾酶（突變酶）的研究；（4）酶的分子改造和化學修飾，（以及酶的）結構與功能（之間關系）的研究；（5）有機相中酶反應的研究；（6）酶的抑制劑、激活劑的開發與應用研究；（7）抗體酶、核酸酶的研究；（8）模擬酶、合成酶及酶分子的人工設計、合成研究。第二節 藥用酶的生產（藥用酶：可用于預防和治療疾病的酶。）一、藥用酶的生產方法（1）提取法；（2）生物合成法；（3）化學合成法。二、提高藥用酶產量的措施1.添加誘導物。2.控制阻遏物濃度。3.添加表面活性劑。4.添加刺激劑。5.添加產酶促進劑。第三節 藥物的酶法生產一、酶的選擇與反應條件的優化二、酶的固定化制備固定化酶的過程稱為酶的固定化，固定化所采用的酶，可以是經提取分離后得到的有一定純度的酶，也可以是結合在菌體（死細胞）或細胞碎片上酶或酶系。酶的一些不足：（1）酶的穩定性較差，在溫度、pH值和無機離子等外界因素的影響下，容易變性失活；（2）酶一般都是在水溶液中與底物反應，這樣酶在反應系統中，與底物和產物混在一起，反應結束后，即使酶仍有較高的活力，也難于回收利用。這種一次性使用酶的方式，不僅使得成本較高，而且難于連續化生產；（3）酶反應后成為雜質與產物混在一起，無疑給進一步的分離純化帶來一定的困難。1.固定化酶的定義固定化酶，是指限制或固定于特定空間位置的酶，具體來說，是指經物理或化學方法處理，使酶變成不易隨水流失即運動受到限制，而又能發揮催化作用的酶制劑。（酶類可粗分為天然酶和修飾酶，固定化酶屬于修飾酶。）2.固定化酶的特點（優點）（1）可以（在較長時間內）多次使用，而且在多數情況下，酶的穩定性提高。（2）反應后，酶與底物和產物易于分開，產物中無殘留酶，易于純化，產品質量高。（3）反應條件易于控制，可實現轉化反應的連續化和自動控制。（4）酶的利用效率高，單位酶催化的底物量增加，用酶量減少。（5）比水溶性酶更適合于多酶反應。3.酶和細胞的固定化方法酶和細胞的固定化方法的分類（1）載體結合法物理吸附法物理吸附法是用物理方法將酶吸附于不溶性載體上的一種固定化方法。離子結合法離子結合法是酶通過離子鍵結合于具有離子交換基的水不溶性載體上的固定化方法 共價結合法共價結合法是酶以共價鍵結合于載體上的固定化方法 （2）交聯法（共價鍵）交聯法是用雙功能或多功能試劑使酶與酶或微生物的細胞與細胞之間交聯的固定化方法。（3）包埋法網格型。將酶或細胞包埋在高分子凝膠細微網格中的稱為網格型。微囊型。將酶或細胞包埋在高分子半透膜中的稱為微囊型。（4）選擇性熱變性法4.酶和細胞的固定化過程中使用載體的條件：（1）固定化過程中不引起菌變性；（2）對酸堿有一定的耐受性；（3）有一定的機械強度；（4）有一定的親水性及良好的穩定性；（5）有一定的疏松網狀結構，顆粒均勻；（6）共價結合時具有可活化基團；（7）有耐受酶和微生物細胞的能力；（8）廉價易得。（酶和細胞的固定化載體，主要有以下三類：）（1）吸附載體。吸附法有物理吸附和離子吸附兩種。物理吸附所用的載體有無機物和有機物。（2）包埋載體。包埋法制備固定化酶或細胞的載體有卡拉膠等。目前，工業上應用的包埋載體主要為卡拉膠、海藻膠等。（3）共價結合載體（交聯載體）。用共價結合法制備固定化酶或細胞所用的載體有纖維素、SephadexA200、瓊脂、瓊脂糖、苯胺多孔玻璃等。5.固定化酶的制備技術（1）物理吸附法中蛋白質與載體結合力較弱，而且酶容易從載體上脫落，活力下降，故此法不常用；離子交換吸附法是將解離狀態的酶溶液與離子交換劑混合后，洗去未吸附的酶和雜質即得固定化酶，本方法中離子交換劉的結合蛋白質能力較強，常彼采用。影響載體吸附的因素較多，如溶液的pH、離子強度、溫度、蛋白質濃度及載體的比表面積等。（2）包埋法制備固定化酶技術包埋法又分為凝膠包埋法和微囊化包埋法兩類。凝膠包埋這是將酶或細胞限制于高聚物網格中的技術；微囊化法是將酶或細胞定位于不同構型的膜外殼內的技術。其基本制備方法有界面沉降法及界面聚合法兩類。界面沉降法。本法是物理法，是利用某些在水相和有機相界面上溶解度極低的高聚物成膜的過程將酶包埋的方法。其基本過程是將酶液在與水不混溶的、沸點比水低的合機相中乳化，使用油溶性表面活性劑形成油包水的微滴，再將溶于有機溶劑的高聚物加入攪拌下的乳化液中，然后再加入另一種不能溶解高聚物的有機溶劑，使高聚物在油水界面上沉淀、析出及成膜。最后在乳化劑作用下使微囊從有機相中轉移至水相，即成為固定化酶。用于制備微囊的高聚物材料有硝酸纖維素、聚苯乙烯及聚甲基丙烯酸甲酯等。微囊化的條件溫和，制備過程不致引起酶的變性，但要完全除去半透膜上殘留的有機溶劑卻不容易。界面聚合法。本法是化學制備法，其基本原理是利用不溶于水的高聚物單體在油水界面上聚合成膜的過程制備微囊。成膜的高聚物有尼龍、聚酰胺及聚脲等。現以尼龍610為例，其基本過程是將含酶的10血紅蛋白溶液與己甲叉二胺水溶液混合，再傾入含有1Span85的氯仿-環己烷中分散乳化，加入溶于有機相的癸二酰氯后，便在油水界面上發生聚合反應，棄去上清后，加入Tween20去乳化，洗去有機溶劑及末聚合的單體，將其轉移至水相中即得微囊。纖維包埋法是將可形成纖維的高聚物溶于與水不混溶的有機溶劑中，再與酶溶液混合并乳化，然后將乳化液經噴頭擠入促凝利(如甲苯及石油醚等)中形成纖維，即成為固定化酶。（3）交聯法制備固定化酶技術例如0.2的木瓜蛋白酶和0.3的戊二醛在pK5.27.2，0下，24h即完成反應，反應速度隨溫度的升高而增大。若pH低于4.0，即使長時間反應也不能實現酶的固定化。酶晶體也可以用交聯法實現固定化，但在交聯過程中酶容易失活。（4）共價結合法制備固定化酶的技術共價結合法制備固定化酶的優點是酶與載體結合牢固，穩定性好；缺點是載體需要活化，固定化操作復雜，反比條件比較劇烈，酶容易失活和產生空間位阻效應。6.固定化酶的形狀與性質6.1 固定化酶的形狀（1）顆粒狀固定化酶（制備方法簡單，顆粒比表面積大，轉化效率高，適用于各種類型的反應器）；（2）纖維狀固定化酶（比表面積大，轉化效率高，但只適用于填充床反應器）；（3）膜狀固定化酶/酶膜（表面積大，滲透阻力小，可用于酶電極，破碎后也可用于填充床反應器）；（4）管狀固定化酶/酶管（機械強度大，切短后可用于填充床反應器，也可以組裝成列管式反應器）。6.2 固定化酶的性質（1）酶活力的變化（2）酶穩定性的變化穩定性包括：操作穩定性。貯藏穩定性。熱穩定性。對蛋白酶的穩定性。（3）酶學特性的變化。底物專一性。最適pH。最適溫度。米氏常數（Km）。最大反應速度（Vmax）。7.固定化酶活力的測定方法 三、酶的非水相催化其催化活性與水溶液中相當，甚至更高，并且具有下列顯著特點：（1）提高非極性底物和產物的溶解度，從而提高反應速度。（2）可催化水解反應的逆反應，而合成（酶類、）多肽、酯類等化合物。（3）有利于反應后酶與產物的分離。（4）解除或減少某些產物對酶的抑制作用。（5）提高酶的穩定性。第七章 發酵工程制藥一、發酵工程與發酵工程制藥的發展歷史二、微生物發酵制藥的研究范圍微生物菌體發酵：如香菇類、靈芝、金針菇、依賴蟲蛹而生有的冬蟲夏草菌以及與天麻共生的密環菌等藥用真菌。微生物酶發酵：微生物代謝產物發酵：微生物轉化發酵：第二節 微生物工業用菌種 一、發酵工業對生產菌種的要求（1）能在易得、價廉的原料制成的培養基上迅速生長，且代謝產物產量高。目標產物最好能分泌到胞外，以降低產物抑制并利于產物分離。（2）發酵條件粗放、易于控制，且所需的酶活性高。（3）菌種生長和發酵速度較快，發酵周期短。（4）根據代謝控制的要求，選擇單產高的營養缺陷型突變菌株或調節突變菌株或野生菌株。（5）抗雜菌、抗噬菌體能力強。（6）菌種純粹，遺傳性狀穩定（不易變異退化），以保證發酵生產和產品質量的穩定性。（7）菌體不是病源菌，不產生任何有害的生物活性物質和毒素以保證安全。二、工業上常用的微生物1.微生物的共同特性（1）個體小、構造簡單；（2）容易培養、易于代謝；（3）生長旺盛、繁殖迅速；（4）適應性強、容易變異；（5）分布廣泛、種類繁多。2.工業上常用的微生物發酵工業上常用的微生物有細菌、酵母菌、霉