摘要 本試驗用酶聯免疫吸附法( e l i s a ) 研究了鹽酸克倫特羅( c l b ) 在動物各組織的 殘留狀況及對動物的毒性。試驗采用小白鼠和豬兩種動物。采用單因子試驗設計，小白 鼠試驗分為4 個試驗組，豬分為3 個試驗組，分別灌注不同劑量的c l b 后，觀察動物 服用c l b 后的異常表現，并在小自鼠試驗3 0 d ，豬試驗3 5 d 后，進行解剖病理分析和殘 留檢測。 試驗結果顯示：用酶聯免疫吸附法( e l i s a ) 對c l b 進行檢測，方法簡單，容易掌 握，耗時少( 5 6 h ) ，可滿足縣級以下單位對c l b 的檢測。c l b 在動物各組織的殘留 規律為：小白鼠的肌肉組織和肝臟、肺臟、腎臟等內臟器官的c l b 殘留量與用藥劑量呈 極顯著正相關( p 腎臟 肌肉 脂肪 血漿：在停藥期為0 d 時肺臟 肝臟，但隨停藥 期的增加肺臟的殘留消除較肝臟快，在第2 4 d ，肺臟己測不出殘留時，肝臟仍有5 3 n g 的殘留。 但是，目前我國各地方的衛生檢驗部門( 陳瓊等，2 0 0 0 ；揚興武等，2 0 0 2 ：賴碧清 等，2 0 0 2 ：唐國盛等，2 0 0 2 金米聰等2 0 0 3 ) 在檢測c l b 時主要將尿液作為的檢測樣 品。雖然c i b 在體內代謝后大量以原形隨尿液排出，但一旦停止飼喂該藥，尿液中的藥 6 含量將急劇減少，因此采用尿液作為檢樣具有一定的局限性。 表2 各組織器官的殘留情況 一一 劑量與給停藥期 組織濃度( n g 幢) 藥時間( d a y ) 肺臟肝臟腎臟 肌肉脂肪血漿 一一 5 m 非g a 0 4 7 6 。04 2 2 12 1 9 1 8 8 33 5 26 0 ，4 3 0 d a y l m g k 9 6 7 d a y 2 3 4 01 8 0 9 5 0 47 8 8 2 6 33 9 o 1 5 42 2 6 9 11 1 4 4 37 ，6 2 27 2 0 66 7 o 55 9 n d5 3 n d4 3 n d3 1 8 7 3 3 2 2 8 6 4 3 2 o 1 2 0 8 0 5 n d n d n d n d 2 6 3 5 6 1 o 0 5 n d n d n d n d n d n d n d n d 1 2 ，6 5 5 2 9 1 , 0 0 7 0 5 n d n d n d n d n d n d 1 5 0 5 3 0 。7 n d n d n d n d n d n d n d n d n d 0 3 7 1 8 6 81 2 2 47 7 4 8 91 2 93 3 1 42 5o 4 2 0 5 0 4 n d 1 8 1 1 2 n d 1 3 0 1 3 0 9 注：n d 表示不可測得( n o td e t e c t a b l e ) a ：楊志凌( 2 0 0 1 ) ；b ：s m i t h ( 2 0 0 0 ) 。 1 4 2 鹽酸克倫特羅檢測樣品的前處理 鹽酸克倫特羅檢測樣品的前處理是指樣品的提取和凈化。主要有溶劑萃取法、固相 萃取法、基質固相分散、透析法、超臨界萃取法等。 溶劑萃取法液一液萃取法( s e l l p ) 是最早使用的一種方法，利用提取物的極性和 酸堿性，通過調節樣品p h 值和溶液極性的方法來改變提取物在不同體系的溶解度和分 7 ， 2 ， 4 6 8 如 h 四 m 凹 剪 配系數，實現對樣品的提取和純化。在某些情況下，為獲得良好的提取效果，需要用多 種有機溶劑。 固相萃取( s p e l ( g a i l l a r d y ，1 9 9 7 ；a e l e h n e r ，1 9 9 8 ；b r u i n sc h p ，1 9 9 9 ；g i a n c a r l o b i a n c o t t o ，1 9 9 9 ：b r u i n s ，1 9 9 9 ) 根據液相分離、解析原理達到分離、凈化的目的，是 目前常用的樣品凈化手段。固相萃取操作簡易，有機溶劑用量少，應用廣泛。但固相萃 取柱價格較高。 膜分離雙相滲析技術( g o z a l e a ，1 9 9 7 ；f e n t ec a ，1 9 9 9 ) 是一種半透膜分離技術， 適用于直接提取分子量相對較小的化合物。與溶劑萃取和固相萃取相比，具有操作簡便、 省時等優點。 基質固相分散萃取( m s p d e ) b i 先將一定量的基質( 如動物肝臟) 均質，并與吸附劑( 如 c 8 鍵合硅膠顆粒) 混勻制成半固態后裝柱、淋洗，m s p d e 的特點在于它將樣品的均質 過程與待測物質的萃取和凈化過程同步完成，減少了溶劑用量，節約了時間，提高了工 作效率，使現場檢測成為可能。此外，m s p d e 減少了樣品凈化程序，更適于自動化分 析。 超i 臨界流體萃取( s f e ) 是以超臨界流體( s f ) 代替各種溶劑來萃取樣品中的待測組 分的萃取方法( 0 k e e f f e ，1 9 9 8 ) 。超臨界流體既具有液體的強溶解性能，又具有氣體的 低粘度、高擴散性能、高傳質速度，使得分析速度提高。 比較c l b 檢測樣品的各種前處理的這幾種方法，溶劑萃取雖然溶劑使用量大，不 如其它方法凈化效果好但其費用低，更易被多數實驗室所采用。固相萃取處理的樣品可 以使得檢測限大為降低，今后隨著囤相萃取柱價格的降低，其應用會越來越廣泛。 1 4 3 鹽酸克倫特羅的檢測方法 為了保證畜牧產品的安全食用性，f d a 和w h o 規定了c l b 在動物體內的最高殘 留限量為：肉0 2 u g k g ，肝臟0 6 u g k g ，腎臟0 6 u g k g ，脂肪0 2 u g k g ，奶0 0 5 u g k g 。我國農業部規定了c l b 的殘留標準，馬、牛肌肉0 1 u g k g ，肝臟、腎臟0 5 u g k ，牛奶o 0 5 u g k g ( 農牧發 1 9 9 7 1 7 號) 。 目前能夠滿足以上檢測限的常用方法主要有：免疫分析法，高效液相色譜法及各種 聯用技術分析法等。其中免疫分析法主要為酶聯免疫分析法和放射免疫分析法。各種聯 用技術分析法主要是氣相色譜質譜法。 1 4 3 1 氣相色譜一質譜聯用法( g c m s ) 氣相色譜一質譜聯用法( g i a u l ta n d f o u r t i l l a n ，1 9 9 0 ；p o l e t t i n ie t a l ，1 9 9 1 ；l e v s s e i l se t 。8 a 1 1 9 9 1 ：m o n t r a d ee ta 1 , 1 以準確地對克倫持羅進行定性和定量分析，對免疫法初步檢測得 到的陽性樣品9 9 3 ；g o n z a l e ze ta l ，1 9 9 5 ；b a q o e n s ，1 9 9 6 ；w h a l e s ，m u r b y ，1 9 9 9 ；s p i s s o e t a l 。2 0 0 0 ) 靈敏度高，可可以進一步進行確認，是檢測鹽酸克倫特羅殘留的最常用的方法 之一，也是目前國際上公認的c l b a 0 定的確認方法。而我國已于2 0 0 1 年頒布了動物組織 中c l b 鋇t j 定的行業標準n y 4 3 8 2 0 0 1 ，也推薦使用g c m s 。但是由于g c m s 要求樣品有 較低的沸點且對熱穩定，而c l b 極性大沸點高，不適宜直接用g c m s 法，因此需要將其 進行衍生化，使其適應g c m s 分析。因此，用此法分析檢測前要對分子上的羥基、氨基 等極性基團衍生化，操作復雜，檢測時間長，難于滿足生產檢測的需要。 1 4 。3 2 高效液相色譜法( h p l c ) 在檢測c l b 時，h p l c 分析不需要將c l b 衍生化，且準確、快速、重復性好、假陽性率 低，適用于定量檢測。h p l c 法可采用不同的檢測器，有電化學檢測器 ( h a u c k ，1 9 8 9 ；c h r i s t i n eb c r g g r e n e t a l ，2 0 0 0 ；c r e s c e n z lc e ta l ，2 0 0 1 ) 、紫外檢測器 ( h o o i j e r i n k ，1 9 9 1 ；c a r d u c d i ，1 9 9 6 ；l a w r e n c e ，1 9 9 7 ；j a m e sf ，1 9 9 7 ) 、光電二極管陣列檢測 ：器( t s a i ，1 9 9 4 ) 和質譜檢測器( d a n i e l l ，1 9 9 6 ；e l b e r t a h e ta l ，1 9 9 8 ；l e h n e r a f2 0 0 1 ) 。 我國農業部頒布的行業標準n y 4 3 8 2 0 0 1 h p l c 推薦為飼料q 6 c l b 檢測方法，最低檢測 限為0 o l m g k g 。目前h p l c 的檢測限一般只能達到1 1 0 0 u g 瓜g ，儀器價格昂貴、操作比 較繁瑣，樣品在測定前需進行前處理工作，而且處理成本高，耗時長。 1 。4 3 3 免疫分析法 1 4 3 3 1 放射免疫分析法( r 放射免疫分析法檢測鹽酸克倫特羅殘留具有很好的特異性和高靈敏度。早在1 9 7 6 年，k o p i t a r 和z i m m e r 就首次報道了用r r a 法分析c l b 。但是由于所用儀器f 液體閃爍儀或 y 一放射儀) 價格較昂貴，實驗條件要求比較苛刻，放射性同位素對工作人員有一定傷 害，并且放射性廢棄物不易處理容易給環境造成污染。因此限制了它的廣泛應用。 1 1 4 3 3 ，2 熒光免疫分析法 熒光免疫分析法同放射免疫分析法相比，克r t 放射免廢分析法中的核輻射缺點； 與色譜法相比，具有對樣品處理比較簡單且一次能檢測多個樣品等優點。b a c i g a l u d om a 等( 1 9 9 5 ) 利用單抗技術與熒光免疫分析技術檢測了鹽酸克倫特羅在牛尿中的殘留，檢測 限l o p g g ，檢測線性范圍1 0 1 0 5 p g g o 但它對溫度的強烈依賴性和熒光強度取決于激 發波長，因此應用較少。 1 4 3 3 3 酶免疫分析法( e 弧) 9 酶免疫分析法( y a m a m o l ol , 1 w a t a ，1 9 8 2 ：p l o u m e i a l ，1 9 9 1 ；p o u e l a l ，1 9 9 4 ；p o l e t t i e t a l ，1 9 9 5 ：h a s s n o o te ta l ，1 9 9 6 ；h a h n a e ta l ，1 9 9 6 ；h a a s n o o t e ta l ，1 9 9 8 ) 在上世紀7 0 年代由 e n g v a l l 等創建的。它較g c - 一m s 和h p l c 有其獨特的優越性：樣品前處理不復雜，檢 測數據穩定、特異性強，檢測速度快：設備費用不高，易于推廣，靈敏度高，檢測限低 于o 5 u e c k g ：英國r a n d o x l a b o r a t o r i e sl t d 公司、德國f b i o p h a r m 公司等已開發出商品 化的酶標儀和試劑盒進行檢測。目前，我國對e t a 用于瘦肉精檢測的研究報道較少其 中南京農大的陳繼明等做了較多的研究。他們用自制的獻酸克倫特羅抗血清建立了間接 抑制酶聯免疫吸附法( e l i s a ) 方法。對飼料、尿樣和肝臟等樣品進行檢測，檢測范圍 為1 5 6u 咖i 1 9 0 n g m l ，特異性較強，塞曼特羅和沙丁胺醇分別有1 0 和1 2 5 的交 叉反應，而腎上腺素和去甲腎上腺素無交叉反應。目前我國赫酸克倫特羅的檢測也有了 快速、簡便的商用e l i s a 試劑盒，如上海賽群生物科技有限公司研制的鹽酸克倫特羅 酶聯免疫檢測試劑盒，經上海市高新技術成果轉化項目認定辦公室認定，上海市獸藥飼 料檢察所應用，其各項性能均達到了進口試劑盒的指標，認定可許代進口試劑盒。試劑 盒的使用更有利于該項檢測的研究和推廣。 2 有待研究的問題及試驗目的意義 2 1 有待研究的問題 綜上所述，在鹽酸克倫特羅的殘留分析方面，國外的研究動物多采用牛、羊和雞麗 對豬的研究少見報道，我國的畜產品主要以豬為主因此有必要對豬進行研究；在檢測 樣品的采集方面，國內的檢測基本上都是用宰前屠畜的尿液作為檢樣，采用尿液作為檢 樣有定的局限性，而在宰后采集合適的組織進行檢測更可靠。召：鹽酸克倫特羅的殘留 檢測方法方面：h p l c 、g c - m s 等操作煩瑣、檢測成本高，使得難于普及，采用較簡便 利于操作的檢測方法，同時降低檢測成本有待研究： 2 2 本試驗的目的意義 通過本研究，希望達到以下兒方面的目的： 2 2 1 了解豬各組織器官的殘留狀況： 2 2 2 探討機體各組織器官的病理變化； 2 2 3 以心臟、肝臟、j 擗! 臟、肺臟、腎臟、肌肉作為撿樣，尋找宰后檢測的最佳組織： 2 2 4 用所建立的方法在實際生產的運用。 意義：對c l b 在動物組織中的殘留分析為組織檢樣的選擇提供依據：機體各組織的 病理變化的研究，為感官檢驗提供科學依據，同時輔以e u s a 法，可及時在宰后檢驗過 l o 程中檢出鹽酸克倫特羅豬肉，防止漏檢錯判和中毒事件的發生，具有重要的生產實踐意 義。 3 材料與方法 3 1 試驗設計 試驗采用兩種不同種屬的動物小白鼠和豬分別進行試驗。同批同齡的4 0 9 左右的小 白鼠隨機分為4 個處理組，對照組，試驗l 組、試驗2 組和試驗3 組采用每天兩次的 口服給藥方式，給藥劑量見表3 。1 4 k g 左右的斷奶仔豬隨機分為3 個處理組。對照組、 試驗1 組和試驗2 組。試驗組同樣采用每天兩次的口服給藥的方式，給藥劑量分為七個 遞增的階段進行見表4 。 表3 小自鼠試驗給藥劑最 腿 表4 豬試驗給藥劑量 m g 對照l ! f l試驗1 紐 試驗2 紐 第一階段 第二二階段 第三階段 第四階段 第五階段 第六階段 第七階段 l6 21 3 2 4 0 4 8 5 6 6 4 給藥總時問( d )3 5 3 53 5 注：每一階段為5 d 。 4 6 8 o 2 4 6 2 7 4 6 7 8 9 o 0 0 o o 0 o 3 2 試驗動物及給藥方式 3 2 1 小白鼠 選用華西醫科大學的健康試驗小白鼠。預試5 d ，觀察小白鼠生活狀況和精神，確認 其健康后，將與小白鼠的食道大小合適的軟管，取代2 - 5 m l 的注射器的針頭，并用此注 射器取適量( 按表1 ) 的已溶解于蒸餾水的鹽酸克倫特羅溶液，再將軟管插入小白鼠的 食道處，將鹽酸克倫特羅溶液灌入其食道中( 見版圖1 ) 。對照組僅灌入同體積的蒸餾水。 3 2 j 豬 試驗動物豬來自四川農業大學動物營養所的長白太湖二元雜交健康仔豬。預示5 d 后給藥，給藥方式與小白鼠相同，只是所用的軟管和注射器與豬的食道合適( 見版圖2 ) 。 3 3 飼養管理 小白鼠試驗在四川農業大學食品實驗室進行，小白鼠單籠飼養，飼料為華西醫科大 學專用小白鼠全價料，自由采食和飲水，每天清換一次墊料。室內溫度1 8 2 7 。c ，濕度 4 2 7 5 ，自然通風。 豬試驗在為四川農業大學動物營養所實驗場進行。豬單籠飼養，飼料為l 四) j l 農業大 學動物營養所配制的仔豬料。自由采食和飲水，每天清掃飼養籠，室內溫度1 8 2 7 。c ， 濕度4 2 - 7 5 ，自然通風。 3 4 樣品的采集與保存 3 4 1 小白鼠樣品的采集 待試驗3 0 d 后，將小白鼠活體解剖，分別取肝臟、肺臟、腎臟、肌肉，用塑料袋密 封后放入一2 0 冰箱中待檢。 3 4 2 豬樣品的采集 試驗3 5 d 后，將豬只屠宰放血，開膛，分別取出心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、 肌肉，用塑料袋密封后放入一2 0 冰箱中待檢。 3 5 樣品的前處理 3 5 1 試劑和儀器 試劑：5 0 m mh c l ：1 m n a o h 5 0 0 m m 磷酸二氫鉀緩沖液( p h 3 0 ) ；5 0 m mt r i s 緩沖液( p h 8 5 ) ；庚烷( h e p t a n e ) 。 儀器：5 0 m l 、1 0 m l 離心管，巴氏德吸管若干； h y - 5 調速多用振蕩器( 江蘇省金壇市醫療儀器廠) ； l d 5 2 a 型離心機( ： 4 0 0 0 轉分) ( 北京醫用離心機廠) ： 1 2 b f c 2 0 0 0 型氮氣吹干儀( 北京八方世紀科技有限公司) 3 5 1 心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟的前處理( 見版圖3 ) 將5 克研碎的樣品與2 5 m 1 5 0 m m h c l 混合，振蕩1 5 h ，勻漿；稱6 9 勻漿物，加入 離心管，1 0 1 5 以4 0 0 0 轉分，離心1 5 m i n ；將上清液轉移到另一離心管中，加 3 0 0 u l l m n a o h 混合1 5 m i n ，后加入4 m 1 5 0 0 m m 磷酸二氫鉀緩沖液( p h 3 o ) ，簡單混合 后放置于4 c 的冰箱過夜；次日取出又于1 睢1 5 以4 0 0 0 轉分，離心1 5 r a i n ，轉移全部 上清液于l o m l 試管中，在6 0 * ( 2 下氮氣吹干。將干燥的樣品管密封后，放入一2 0 冰箱 中待測。 3 5 2 肌肉的前處理 因為肌肉中所含脂肪較心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟等組織多，故樣品前處理中 增加提脂步驟。 將5 克研碎的樣品與2 5 m 1 5 0 m m t r i s 緩沖液( p h 8 5 ) 混合，振蕩0 5 h ，勻漿；后加 入1 5 m l 庚烷( n h e p t a n e ) 振蕩5 m i n 去脂；1 0 1 5 以4 0 0 0 轉分，離心5 m i n ，用巴氏 德吸管除去上面的庚烷層及中間薄薄的脂肪層i 再用1 5 m l 庚烷( n h e p t a n e ) 重復以上 操作；然后稱6 9 勻漿物，加入離心管中；以后的操作按3 5 1 進行。 3 6 樣品的殘留檢測 3 6 1 試劑和儀器 試劑：6 個c l b 的標準液( 濃度分別為0 ，0 1 ，0 3 ，0 9 ，2 7 ，8 1 n g m 1 ) ，c l b 過氧化物酶標記物，酶反應底物，顯色劑，反應終止液，p b s ，p b s t 洗液( 由上海賽 群生物有限公司提供) 。 儀器：m u l t i s k a nm k 3 酶聯免疫檢測儀( 上海雷勃分析儀器有限公司) ；2 0 u l ，5 0 u l ， 1 0 0 u l ，2 0 0 u l 微量加樣器。 3 6 2 測定 首先將待測定的樣品對應酶聯免疫檢測試劑盒的9 6 個微孔編號( 見表5 ) ，以保證 樣品于后期酶聯免疫檢測儀所出數據一一對應。 寸一 。卿囂靶制崆n iii。1【馥gii。n寸博崾如爨廿1器鬲蜓q豁避噠一n0囂崾iii=怔螻議曾p。，冷村狀如驟武懨哥晶器麗一j8_【最嶂如煦 h一墨禳圃吲冥s世毯噠輿障一區世漲蜊憫蛞疑g導1器皸豆晾導罱懨a(罨。旺母挺島導1壬永鑿稍氓增肇墨靶靶q螺*簽塒哪匿球菸婆基疑蠱七b鬲丑草u一獸n怔竣p。，nn箍世1圭挺麗器蹭蜷髓一j8_【曩障(僻氓v廿器窨皿雄兩罐婪 s蟲剮文錳燃姑蜷蠱一n0n o 0 5 ) 。但從表中可 以看到，對照組的平均增重為8 k g ，試驗1 組的平均增重為1 0 1 k g ，比對照組增加2 6 2 5 ； 試驗2 組的平均增重為1 0 6 2 k g ，比對照組增加3 2 7 5 。顯示出試驗組體重增加的幅度 大于對照組。而從采食量來看，對照組總采食量為2 6 7 1 4 k g ，試驗1 組總采食量為 2 5 1 0 4 k g ，比對照組下降6 0 2 ；試驗2 組總采食量為2 4 8 5 1 k g ；比對照組下降6 9 7 。 4 2 3 剖檢變化 4 2 3 1 小白鼠剖檢變化 在活體解剖后( 見版圖1 3 1 7 ) ，可以看到對照組脂肪明顯多于試驗組，而試驗組的 劑量越高，皮下脂肪層越薄。對照組皮下血管較淡，腎臟、心臟、腹腔周圍脂肪明顯， 腸系膜網膜脂肪明顯，腿部肌肉上有一層白膜；而試驗組皮下血管明顯，腎臟、心臟、 腹腔周圍無臘肪，腸系膜網膜薄，腿部無脂肪。 4 2 3 2 豬剖檢變化 豬在屠宰后，測得各試驗組的組織器官的重量( 見表1 0 ) ( 見版圖1 8 ) 。從表1 0 中可以看到試驗組的各器官均大于對照組，呈現一定的規律性。特別是試驗2 組脾臟較 對照組重6 3 5 ，心臟重2 3 3 ，其次為腎臟重2 0 5 ，肺臟重1 6 o ，肝臟重8 7 。 從剖檢分析來看試驗組肝臟體積大于對照組，輕微腫大；試驗組的肺臟有膨脹現象，體 積較大，明顯產生間質水腫，出血和炎癥；對照組的脾臟質地細膩，試驗組與對照組比 2 1 較脾臟邊緣外翻且粗糙。同時解剖腹股溝深淋巴結，發現對照組正常，而試驗1 組充血， 試驗2 組出血：解剖腹股溝淺淋巴結，發現對照組、試驗1 組都正常，試驗2 組出血。 表1 0 豬各組織器官的重量g 5 分析與討論 5 1e l i s a 方法檢測克倫特羅的優點 本試驗采用的鹽酸克倫特羅殘留酶聯免疫檢測試劑盒，購自上海塞群生物科技有限 公司，并由上海市科委組織專家鑒定，上海市獸藥飼料監察所實踐驗證，其靈敏度高， 平均檢測下限為o 1 n g 。回收率為：9 0 1 5 ，特異性強，與鹽酸克倫特羅同類藥物 無交叉反應，測試數據可靠。 本試驗采用e l i s a 方法對c l b 在豬各組織的殘留情況作了系統的研究，發現此法相 對g c m s 等方法有三大優點：一是檢測樣品的前處理采用溶劑提取的方法，不復雜，容 易掌握，僅需要h c l 、n a o h 、磷酸二氫鉀緩沖液、t f i s 緩沖液、庚烷( n h e p t a n e ) 幾種 常用試劑，污染小：二是所需的設備便宜，一臺g c m s 儀需要上百萬元人民幣，而酶聯 免疫檢測儀僅3 4 萬元。這就可滿足縣級以下單位對肉中鹽酸克倫特羅殘留的檢測。三 是從采樣到出結果整個過程僅需5 6 h ，這將大大提高對鹽酸克倫特羅非法使用的檢測 力度，對我國畜牧業的發展和保障人民的健康具有重要的意義。 5 2 鹽酸克倫特羅在動物各組織器官的殘留規律 本研究表明：對不同種屬的兩種動物( 小白鼠和豬) ，采用口服的飼喂方法，飼喂 不同劑量的鹽酸克倫特羅3 0 d 和3 5 d 后，鹽酸克倫特羅在動物體內的殘留在一定程度上 呈現一致的規律性。即組織器官的c l b 殘留量均隨飼喂劑量的增加而增加：不論c l b 劑量的高低，同一飼喂劑量機體的組織器官中的肺臟和肝臟有較高的殘留，高于腎臟， 而遠遠高于心臟、脾臟和肌肉。 5 2 1 鹽酸克倫特羅在動物心臟的殘留規律 本研究僅對豬的心臟中的c l b 殘留進行了檢測。本研究的結果顯示豬對照組、試 2 2 驗1 組、試驗2 組的心臟殘留量分別為未檢出、5 9 1 n g g 、7 1 o n g g 。試驗1 組、試驗2 組的用藥劑量逐漸加大，而結果顯示其殘留量也逐漸升高，表明殘留量有隨用藥劑量增 大而增大的趨勢。但心臟中的最高殘留也僅7 1 o n g g ，較肝臟3 5 0 8 n g g 、肺臟4 1 5 5 n g g 、 腎臟2 3 2 3 n g g 低。因此，鹽酸克倫特羅在動物心臟的殘留較其它組織低。故在許多的 殘留研究中，對雞( m a l u c e k k i ，1 9 9 4 ) 、羊( e l l i o t ，1 9 9 3 ) 、豬( b r a m b i l l a ，1 9 9 4 ；楊志凌， 2 0 0 1 ) 都很少把心臟作為研究對象。 5 2 2 鹽酸克倫特羅在動物肝臟的殘留規律 本研究顯示小白鼠對照組、試驗1 組、試驗2 組、試驗3 組中的殘留量分別為未檢 出、1 0 3 8 n g g 、1 8 1 7 n g g 、2 4 2 8 n g g ；豬對照組、試驗1 組、試驗2 組的殘留量分別為 未檢啦、3 3 8 4 n g g 、3 5 0 8 n g g ；小白鼠肝臟的c l b 殘留量與用藥劑量呈極顯著正相關 ( p 0 0 1 ) ，豬肝臟的c l b 殘留量有隨用藥劑量增大而增大的趨勢。兩種動物試驗均 表明在同一劑量下，肝臟較其它組織有較高的殘留，其殘留量僅次于肺臟。這與楊志凌 ( 2 0 0 1 ) 、b r a m b i l l a ( 1 9 9 4 ) 和s m i t h ( 2 0 0 0 ) 的報道相一致。 肝臟有較高的殘留可能一是因為肝臟中藥物代謝酶齊全，含量豐富是藥物代謝的主 要器官；二也可能是由于肝臟中含有大量的結合蛋白，對藥物具有強的結合和滯留能力， 并且血流充沛的緣故。因此，肝臟具有體積大，采樣既方便又容易，運送與處理都較方 便，c l b 殘留量高的特點，可作為監測鹽酸克倫特羅殘留的主要器官。 5 2 3 鹽酸克倫特羅在動物脾臟的殘留規律 本研究僅對豬的脾臟c l b 殘留進行了檢測。本研究的結果顯示豬對照組、試驗1 組、試驗2 組的脾臟殘留量分別為未檢出、6 3 1 n g g 、7 8 3 n g g 。試驗1 組、試驗2 組的 用藥劑量逐漸加大，而結果顯示其殘留量也逐漸升高，表明用脾臟c l b 殘留量有隨藥 劑量增大而增大的趨勢。但脾臟的最高殘留量也僅為7 8 3 n g g ，較肝臟3 5 0 8 n 【g g 、肺臟 4 1 5 5 n g g 、腎臟2 3 2 3 n g g 低。因此，脾臟中的殘留相對少很少將其作為c l b 殘留研究 對象。 5 2 4 鹽酸克倫特羅在動物肺臟的殘留規律 本研究顯示小白鼠對照組、試驗1 組、試驗2 組、試驗3 組中的殘留量分別為未檢 出、1 1 4 s n g g 、1 9 6 1 n g g 、2 6 3 3 n g g 、：豬對照組、試驗1 組、試驗2 組的殘留量分別 為未檢出、3 8 6 3 n g g 、4 1 5 5 n g g ；小白鼠肺臟的c l b 殘留量與用藥劑量呈極顯著正相 關( p 0 0 1 ) ，豬肺臟的c l b 殘留量有隨用藥劑量增大而增大的趨勢。研究顯示不論 小白鼠還是豬肺臟都是殘留最高的內臟器官，這可能因為肺臟對c l b 有較強的親和力 的緣故。這與楊志凌( 2 0 0 1 ) 在對豬混飼鹽酸克倫特羅( 5 m g k g ) 3 0 d 后，鹽酸克倫特 羅在肺臟中的殘留最高為4 7 6 0 n g g ，m e y e r 和r i n k e ( 1 9 9 1 ) ，s m i t h ( 2 0 0 0 ) 的報道相一致。 5 2 5 鹽酸克倫特羅在動物腎臟的殘留規律 本研究顯示小白鼠對照組、試驗1 組、試驗2 組、試驗3 組腎臟中的殘留量分別為 未檢出、4 9 7 n g g 、9 0 4 n g g 、1 2 0 o n g g ；豬對照組、試驗1 組、試驗2 組的殘留量分別 為未檢出、1 9 8 8 n g g 、2 3 2 3 n g g ：小白鼠腎臟的c l b 殘留量與用藥劑量呈極顯著正相 關( p o 0 1 ) ，豬腎臟的c l b 殘留量有隨用藥劑量增大而增大的趨勢。腎臟中的殘留 較高( 僅次于肺臟和肝臟) ，這可能是由于腎臟組織是藥物的排泄器官并且其含有大量 的結合蛋白，對藥物具有強的結合和滯留能力的緣故。 5 2 6 鹽酸克倫特羅在動物肌肉的殘留規律 本研究顯示小白鼠對照組、試驗1 組、試驗2 組、試驗3 組中的殘留量分別為未 檢出、1 0 5 n g g 、1 7 9 n g g 、2 3 8 n g g ；豬對照組、試驗1 組、試驗2 組的殘留量分別為 未檢出、7 0 3 n g g 、8 1 7 n g g ：小白鼠肌肉的c l b 殘留量與用藥劑量呈極顯著正相關( p 0 0 5 ) 。但在小 白鼠試驗中，試驗2 組、試驗3 組的平均增重呈負增加，且采食量呈下降趨勢，這可能 反應出c l b 影響了小白鼠f 常的生長，對小白鼠造成了毒性作用。豬試驗1 組、試驗 2 組的平均增重比對照組分別增加2 6 2 5 、3 2 7 5 ，試驗1 組、試驗2 組的采食量比 對照組分別下降6 0 2 、6 9 7 ，這可能正是由于c l b 對豬的抑制脂肪沉積，增加蛋白 質沉積的作用，從而不需要采食太多的能量，提高平均增重。這說f ! j j 本試驗采用的c l b 劑量約為o 1 6 o 6 4 m g k g b w ，已達到了生產中應用以提高豬生產性能的劑量而豬的 各組織均表現出了不同程度的病理變化，這表明在畜牧生產中非法添加c l b 在達到提 高生產性能目的時，可能已經造成了豬自身的毒害。 5 4 實際生產中防止鹽酸克倫特羅的漏檢的方法 本研究發現，口服鹽酸克倫特羅的豬在體態和生活行為均發生異常。并且在豬肝臟、 肺臟、脾臟和淋巴結等組織器官發生了肉限可見的病理變化，同時證明了肝臟、肺臟、 腎臟有較高的殘留。這表明：在實際生產中可仔細觀察屠畜的體態和行為，并在屠宰動 物時剖解肝臟、肺臟、脾臟和淋巴結等組織如發現病理癥狀就可即時及時檢出疑似鹽 酸克倫特羅豬肉，防止漏檢錯判和中毒事件的發生，具有重要的生產實踐意義。 綜上所述，本試驗采用e l i s a 方法對小白鼠的肌肉和肝臟、肺臟、腎臟等內臟器 官，豬的肌肉和心臟、肝臟、脾臟、腫臟、腎臟等內臟器官中赫酸克倫特羅的殘留情況， 做了系統全面的分析，找出了適合的檢測器官和方法。研究了小自鼠和豬對黼酸克倫特 羅的毒性表現，并進行了相應的剖檢分析，為官觀檢驗提供了科學依據。目前，就鹽酸 克倫特羅對動物毒性方面的研究報道較少，本研究為其積累資料。具有重要意義。 6 結論 6 1 在豬的各組織器官的中肺臟和肝臟有較高的殘留，高于腎臟，而遠遠高于心臟、脾 臟和肌肉。 6 2 豬在肝臟、肺臟、脾臟、腎臟和淋巴結等組織均發生了輕微腫火、膨脹、間質水腫， 出血和炎癥等肉眼可見的病理變化。 6 3 肝臟、肺臟都具有殘留量高體積大，采樣既方便又容易，運送與處理都較方便的 優點，因此，是可食組織中檢測鹽酸克倫特羅殘目的主要器官。 6 a 在屠宰檢驗過程中，若發現肝臟、肺臟、腎臟和淋巴結等組織出現上述肉眼可見的 病理變化的胴體，可初步判定為c l b 殘留疑似病豬，即時檢出，再輔以e l i s a 檢測， 能有效地防止漏檢錯判和中毒事件的發生，具有重要的生產實踐意義。 參考文獻 陳瓊，連玉華2 0 0 0 某肉聯廠屠宰豬“瘦肉精”殘留的檢測畜牧與獸醫3 2 ( 4 ) ：3 1 3 2 陳忠熙一起克倫特羅食物中毒的調查中國衛生監督雜志2 0 0 1 8 ( 5 ) ：2 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a td e p o s i t i o ni nl a m b s j a n i t a ，s c i 5 9 ：1 3 5 6 - 1 3 6 4 b a l l a r i n ig ，m o l i n ol ，m u n a f o a 1 9 7 8 p r e l i m i n a r yf i n d i n g so nt h eu s eo ft h eb e t a 一2 一m i m e t i c ( a d r e n e r g i c l a g e n tc l e n b u t e r o lt os u p p r e s su t e r i n ec o n t r a c t i o n si nt h ec o w c i i n i c av e t e r i n a r i a 1 0 1 ( 1 ) ：1 1 1 6 ； b a t j o e n se ，c o u r t h e y nd ，b r a b a n d e rh f 1 9 9 6 g a sc h r o m a t o g r a p h i c - t a n d e mm a s ss p e c t r o m e t r i ca n a l y s i s o fc l e n b u t e r o lr e s i d u e si nf a e c e s j c h r o m a t o g r a 7 5 0 ( 1 2 ) ：1 3 3 - 1 3 9 b e e r m a n nd ，h ，b u t l e rw r ，h o u g u ed e ，f i s h e l lv l k ，d a l r y m p l er h ，r i c k sc a a n d c g , s c a n e s 1 9 8 7 c i m a t e r o l i n d u c e dm u s c l e h y p e r t r o p h y a n da l t e r e de n d o c r i n e s t o t u si n l a m b s j a n i m s c i 6 5 ：1 5 1 4 1 5 2 7 b i o l a t t ib ，c a s t a g n a r om ，b o l l oe ，a p p i n os 1 9 9 4 g e n i t a ll e s i o n s f o l l o w i n gl o n g t e r ma d m i n i s t r a t i o no f c l e n b u t e r o li nf e m a l ep i g s v e t e r i n a r yp a t h o l o g y 3 l ( 1 ) ：8 1 - 9 2 b l e c h a e 1 9 9 8 i m m u n o m o k u l a t i o n ：am e a n so fd i s e a s e p r e v e n t i o n i ns t r e s s e d l i v e s t o c k j a n i ms c i6 6 ：2 0 8 4 2 0 9 5 b r a i n s ，c h p ，e ta 1 1 9 9 9 o n l i n ec o u p l i n go fs o l i d p h a s ee x t r a c t i o nw i t hm a s ss p e c t r o m e t r yf o rt h e a n a l y s i so fb i o l o g i c a ls a m p l e s i d e t e r m i n a t i o no fc l e n b u t e r o l i nu r i n e j o u r n a lo fc h r o m a t o g r a p h y a 8 6 3 ( 1 ) ：1 1 5 1 2 2 b e r g g r e nc ，, b a y o u d hs ，s h e r r i n g t o nd ，e n s i n gk 2 0 0 0 u s eo fm o l e c u l a r l yi m p r i n t e ds o l i d - p h a s e e x t r a c t i o n f o r t h es e l e c t i v ec l e a n - u p o f c l e n b u t e r o l f r o m c a l f u r i n e j c h r o m a t o g r a 8 8 9 0 - 2 ) ：1 0 5 一1 0 c r e s c e n z lc ，s b a y o u d h ，ea 6 c o n n a c k e ta 1 2 0 0 1 d e t e r m i n a t i o no fc l e n b u t e r o li nb o v i n el i v e rb y c o m b i n i n gm a t r i xs o l i d p h a s ed i s p e r s i o na n dm o l e c u l a r l yi m 鯽i n t e ds o l i d p h a s ee x t r a c t i o nf o l l o w e db y l i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ，e l e c i r o s p r a y i o n t r a pm u l t i p l e - s t a g e m a s s s p e c t r o m e t r y a n a l c h e m 7 3 ：2 1 7 1 - 2 1 7 7 d u m c a nnd w i l l i a m sd a 2 0 0 0 d e l e t r i o u se f f e c t so fc h r o n i cc l e n b u t e r o lt r e a t m e n to ne n d u r a n c ea n d s p r i n te x e r c i s ep e r f o r m a n c ei nr a t s c l i n i c a l s c i e n c e 9 8 3 3 9 - 3 4 7 e i s e m a n nj h 1 9 8 8 。e f f e c t so fd i e t a r yc l e n b u t e r o lo nm e t a b o l i s mo ft h eh i n d q u a r t e r si ns t e e r s ja n i ms c i ， 6 6 ( 2 ) ：3 4 2 - 3 5 3 e l b e r ta h o g e n d o o m ，p i e tv a n7 _ o o n e n 1 9 9 8 t h ep o t e n t i a lo fr e s t r i c t e da c