一 氮藍(lán)四唑（NBT）法測(cè)定超氧化物岐化酶（SOD）【實(shí)驗(yàn)原理】SOD是含金屬輔基的酶。高等植物含有兩種類型的SOD：MnSOD和Cu.ZnSOD，它們都催化下列反應(yīng)：由于超氧自由基（O2.）為不穩(wěn)定自由基，壽命極短，測(cè)定SOD活性一般為間接方法。并利用各種呈色反應(yīng)來(lái)測(cè)定SOD的活力。核黃素在有氧條件下能產(chǎn)生超氧自由基負(fù)離子O2.，當(dāng)加入NBT后，在光照條件下，與超氧自由基反應(yīng)生成單甲月替 （ 黃 色 ） ，繼而還原生成二甲月替 ，它是一種藍(lán)色物質(zhì)，在560nm波長(zhǎng)下有最大吸收。當(dāng)加入SOD時(shí)，可以使超氧自由基與H+結(jié)合生成H2O2和O2，從而抑制了NBT光還原的進(jìn)行，使藍(lán)色二甲月替 生成速度減慢。通過(guò)在反應(yīng)液中加入不同量的SOD酶液，光照一定時(shí)間后測(cè)定560nm波長(zhǎng)下各液光密度值，抑制NBT光還原相對(duì)百分率與酶活性在一定范圍內(nèi)呈正比。反應(yīng)液藍(lán)色愈深，說(shuō)明酶活性愈低。【儀器、材料與試劑】（一）儀器1. 分光光度計(jì)2. 臺(tái)式離心機(jī)（二）材料1. 磷酸氫二鈉2. 磷酸二氫鈉3. 甲硫氨酸4. EDTA-Na25. 核黃素6. 氮藍(lán)四唑(NBT)7. 陶瓷小研缽8. 4-5ml 離心管9. 10ml 玻璃試管（三）試劑1. 0.05mol/L磷酸緩沖液(PBS，pH7.8)：A母液：0.2mol/L磷酸氫二鈉溶液: 取Na2HPO412H2O（分子量358.14）71.7g；B母液：0.2mol/L磷酸二氫鈉溶液：取NaH2PO42H2O（分子量156.01）31.2g。分別用蒸餾水定容到1000ml。0.05mol/L PBS（pH7.8）的配制：分別取A母液(Na2HPO4) 228.75ml，B母液(NaH2PO4) 21.25ml，用蒸餾水定容至1000ml。2. 14.5mM甲硫氨酸溶液：稱取1.0818g Met用磷酸緩沖液（pH7.8）定容至500ml。3. 3mM EDTA-Na2溶液：稱取0.1117g EDTA-Na2用磷酸緩沖液定容至100ml。4. 60M核黃素溶液：稱取0.0023g 核黃素用磷酸緩沖液定容至100ml，避光保存。5. 2.25mM 氮藍(lán)四唑(NBT)溶液：稱取0.092g NBT用PBS定容至50ml，避光保存。【實(shí)驗(yàn)步驟】1. 酶液提取 稱取0.2g（可視情況調(diào)整）樣品（新鮮葉片或根系）洗凈后置于預(yù)冷的研缽中，分三次加入1.6ml （0.6 ml、0.5 ml、0.5 ml）50mmol/L預(yù)冷的磷酸緩沖液（pH7.8）在冰浴上研磨成勻漿，轉(zhuǎn)入離心管中在4、12000g下離心20min，上清夜即為SOD粗提液。2. 酶活性測(cè)定（1）反應(yīng)混合液配制(以60個(gè)樣為準(zhǔn))：分別取配好的Met溶液162ml，EDTA-Na2溶液6ml， NBT溶液6ml，核黃素溶液6ml,混合后充分搖勻；（2）分別取3ml反應(yīng)混合液和40l（可視情況調(diào)整）酶液于指形管中此即反應(yīng)管；同時(shí)做兩支對(duì)照管，其中1支試管加3ml反應(yīng)混合液和40l PBS（不加酶液）作為最大光還原管，另1支加3ml反應(yīng)混合液和40l PBS同時(shí)用錫箔紙包好遮光用于測(cè)定時(shí)調(diào)零。（3）將試管置于光照培養(yǎng)箱中在4000 lux光照25下反應(yīng)20min；（4）反應(yīng)結(jié)束后以不照光的對(duì)照管調(diào)零，分別測(cè)定各管在560nm下的吸光度（OD560）3. 計(jì)算結(jié)果已知SOD活性單位以抑制NBT光化還原的50為一個(gè)酶活單位（U），按下式計(jì)算活性n=(ODmax-OD560)/ODmax/2SOD總活性 ( Ack-AE )V/（1/2AckWVt） SOD比活力SOD總活性/蛋白質(zhì)含量SOD總活性以鮮重酶單位每克表示（u/g FW）；比活力單位以酶單位每毫克蛋白表示；Ack為照光對(duì)照管的吸光度；AE為樣品管的吸光度；V為樣品液總體積（ml）；Vt為測(cè)定時(shí)的酶液用量（ml）；W為樣品鮮重（g）；蛋白質(zhì)含量單位為mg/g。【注意事項(xiàng)】1. 酶液提取須在4下進(jìn)行，提取后立即進(jìn)行測(cè)定，冰箱中放幾小時(shí)活性也會(huì)下降；2. 植物中的酚類物質(zhì)對(duì)測(cè)定有干擾，制備粗酶液時(shí)可加入聚乙烯吡咯烷酮（PVP）或pvpp等，盡可能除去植物組織中的酚類等次生物質(zhì)。3. NBT反應(yīng)液配好后過(guò)濾除去不溶物立即使用，若置于冰箱中要避光保存，充分搖勻然后使用。4. 加反應(yīng)液時(shí)最好在暗光下進(jìn)行；5. 核黃素產(chǎn)生O2.，NBT還原為籃甲潛都與光照密切相關(guān)，照光強(qiáng)度和時(shí)間要嚴(yán)格控制。光照培養(yǎng)箱內(nèi)壁裱糊錫箔紙，使箱內(nèi)均勻光照約達(dá)40molm-2s-1，同時(shí)使照光時(shí)間一樣，選擇試管盡量一致，照光結(jié)束后測(cè)一個(gè)拿一個(gè)（最好晚上做）（溫度高時(shí)照光時(shí)間縮短，溫度低時(shí)延長(zhǎng)）；6. 測(cè)定活性時(shí)加入的酶量，以能抑制反應(yīng)的50為佳。（一個(gè)酶單位相當(dāng)于引起反應(yīng)液達(dá)到半抑制時(shí)酶的用量，即以能抑制反應(yīng)50的酶量為一個(gè)SOD酶活性單位。）（反應(yīng)液中加酶液與PBS調(diào)零差異不大，反應(yīng)液調(diào)零與其它兩個(gè)則有一定差異。李合生方法：2支CK管均以緩沖液代替酶液。）【參考文獻(xiàn)】Beauchamp C, Fridovich I. Superoxide dismutase. Improved assays and an assay applicable to acrylamide gel. Anal Biochem, 1971, 44: 276-287. Zhou W, Zhao D, Lin X. Effects of water logging on nitrogen accumulation and alleviation of waterlogging damage by application of nitrogen fertilizer and mixtalol in winter rape (Brassica napes L.). J. Plant Growth Regul, 1997,16, 47-53. 二 愈創(chuàng)木酚過(guò)氧化物酶（POD）活性的測(cè)定-愈創(chuàng)木酚法【實(shí)驗(yàn)原理】在過(guò)氧化物酶催化下，H2O2將愈創(chuàng)木酚氧化成茶褐色產(chǎn)物。此產(chǎn)物在470nm處有最大光吸收，故可通過(guò)測(cè)470nm下吸光值變化測(cè)定過(guò)氧化物酶活性。【儀器、材料與試劑】（一）儀器1. 分光光度計(jì)2. 臺(tái)式離心機(jī)（二）材料1. 磷酸氫二鈉2. 磷酸二氫鈉3. 2-甲氧基酚4. 30H2O25. 陶瓷小研缽6. 2ml 離心管（三）試劑1. 0.2mol/L磷酸緩沖液(pH6.0)：A母液：0.2mol/L磷酸氫二鈉溶液: 取Na2HPO412H2O（分子量358.14）71.7g；B母液：0.2mol/L磷酸二氫鈉溶液：取NaH2PO42H2O（分子量156.01）31.2g。分別用蒸餾水定容到1000ml。0.2mol/L磷酸緩沖液(pH6.0)的配制：分別取A母液(Na2HPO4 )12.3ml和B母液(NaH2PO4 ) 87.7ml混勻即為100ml PBS(0.2M，pH6.0)；【實(shí)驗(yàn)步驟】1. 酶液提取 稱取0.2g（可視情況調(diào)整）樣品（新鮮葉片或根系）洗凈后置于預(yù)冷的研缽中，分三次加入1.6ml （0.6 ml、0.5 ml、0.5 ml）50mmol/L預(yù)冷的磷酸緩沖液（pH7.8）在冰浴上研磨成勻漿，轉(zhuǎn)入離心管中在4、12000g下離心20min，上清夜即為酶粗提液。2. 酶活性測(cè)定（1）反應(yīng)混合液的配制：取50mlPBS（pH6.0，0.2M）緩沖液于燒杯中，加入28l愈創(chuàng)木酚（2-甲氧基酚）于磁力攪拌器上加熱攪拌，直至溶解愈創(chuàng)木酚溶解，待溶液冷卻后加入19l 30的H2O2，混勻后保存于冰箱中備用。（2）酶活性測(cè)定：取3ml反應(yīng)液并加入40l酶液后測(cè)定OD470值在40秒的變化。以PBS代替酶液為對(duì)照調(diào)零，3. 計(jì)算結(jié)果以每min OD值變化（升高）0.01為1個(gè)酶活性單位（u）。，按下式計(jì)算活性POD活性=（A470Vt）/（WVs0.01t） (u/g FW)A470：為反應(yīng)時(shí)間內(nèi)吸光度的變化；W為樣品鮮重(g)；t為反應(yīng)時(shí)間(min)；Vt為提取酶液總體積（ml）；Vs為測(cè)定時(shí)取用酶液體積（ml）。【注意事項(xiàng)】1. 反應(yīng)液配制時(shí)由于愈創(chuàng)木酚難溶，應(yīng)加熱一段時(shí)間。加入H2O2前注意溶液冷卻，防止H2O2的揮發(fā)。2. 由于該反應(yīng)迅速，加入酶液要立即進(jìn)行吸光值的測(cè)定。參考文獻(xiàn)J.L. Muoz-Muoz, F. Garca-Molina, P.A. Garca-Ruiz, E. Arribas, J. Tudela, F. Garca-Cnovas, J.N. Rodrguez-Lpez, Enzymatic and chemical oxidation of trihydroxylated phenols, Food Chemistry,Volume 113, Issue 2,15 March 2009, Pages 435-444F. Quintanilla-Guerrero, M.A. Duarte-Vzquez, B.E. Garca-Almendarez, R. Tinoco, R. Vazquez-Duhalt, C. Regalado, Polyethylene glycol improves phenol removal by immobilized turnip peroxidase,Bioresource Technology, Volume 99, Issue 18, December 2008, Pages 8605-8611三 CAT(過(guò)氧化氫酶)的測(cè)定【實(shí)驗(yàn)原理】過(guò)氧化氫酶(Catalase,CAT),是一種廣泛存在于生物組織中的氧化還原酶，它能催化H2O2分解為水和氧氣,清除組織中的過(guò)氧化氫。H2O2在240nm處有一個(gè)吸收高峰,其吸光度與H2O2的含量成正比,過(guò)氧化氫酶能分解過(guò)氧化氫,使反應(yīng)溶液吸光度(A240)隨反應(yīng)時(shí)間而降低。單位時(shí)間內(nèi)吸收的差值就是過(guò)氧化氫酶的活性。【儀器、材料與試劑】（一）儀器1. 分光光度計(jì)2. 臺(tái)式離心機(jī)（二）材料植物葉片等植物材料（三）試劑1 0.15mol/L磷酸緩沖液（pH7.0）： 取A母液(Na2HPO4) 228.75 ml 和B母液(NaH2PO4) 146.25 ml混合后用蒸餾水定容至500ml。2 0.3H2O2: 吸取0.5ml 30的H2O2，用PBS (pH7.0)定容至50ml。【實(shí)驗(yàn)步驟】1. 酶液提取 稱取0.2g（可視情況調(diào)整）樣品（新鮮葉片或根系）洗凈后置于預(yù)冷的研缽中，分三次加入1.6ml （0.6 ml、0.5 ml、0.5 ml）50mmol/L預(yù)冷的磷酸緩沖液（pH7.8）在冰浴上研磨成勻漿，轉(zhuǎn)入離心管中在4、12000g下離心20min，上清夜即為CAT粗提液。2 酶活性測(cè)定（1）反應(yīng)混合液的配制：取100ml