DNA甲基化 ConradWaddington1905 1975 Theinteractionsofgeneswiththeirenvironment whichbringthephenotypeintobeing 1942 Theterm epigenetics wasfirstcoinedinthe1940sbyBritishembryologistandgeneticistConradWaddington 表觀遺傳學 表觀遺傳學 從根本上講 表觀遺傳是環境因素和細胞內的遺傳物質之間發生交互作用的結果 與中心法則不同 表觀遺傳學認為遺傳信息并非單方向傳遞 環境因素也能改變遺傳物質 目前表觀遺傳學研究主要集中在甲基化 組蛋白修飾 小RNA和染色質重塑等方面 玉米中有一個編碼花青素合成途徑中一種關鍵酶的基因B I 存在于各種組織中 通常其無效等位基因b導致花青素缺乏 對B I完全隱性 另一個等位基因B 則使葉片只產生少量色素 但事實上在F2及相繼的后代中 僅有B 的表現型效應出現 即所有植株均為微量色素類型 B 對B I為顯性 B I僅與B 共處于同一基因型中一個世代 便徹底地 敗落了 發生了永久的活性蛻變 基因一定受到了某種修飾 以至于這種修飾效應能夠代代相傳 副突變等位基因 騾和駃騠前者又稱馬騾 是公驢與母馬雜交的后代 體大 耳小而尾部蓬松 后者又叫驢騾 是公馬與母驢雜交的后代 相對來說體小 耳大而尾毛較少 這個現象表明 來源于不同性別親本的遺傳物質在后代表達的功能可以有差別 這就是基因印記 基因印記 Hinny駃騠 Mule 類胰島素生長因子 2基因Igf2 位于7號染色體 在小鼠身體里是否表達 要看它是否是受之于父親 因為來自母親的基因拷貝是處于失活性狀態的 這就是說 該基因是被母親所印記的 相反 17號染色體上的Igf2r是被父親所印記的 被特別關注 因為來自父親的Igf2r是處于失活性狀態的 它只有受之于母親才在體內表達 類胰島素生長因子 親代印記的結果是 被印記的基因所表現的形式好像半合子的情況 盡管在每一個細胞中這種體細胞基因均成對存在 分子水平的分析發現 DNA序列并沒有發生改變 那么 功能與性狀的變化因何而起 X染色體失活 X連鎖的O基因控制黃色毛性狀 其等位基因o控制黑色毛性狀 另有常染色體基因S控制白色性狀 在雜合子貓XOXo 一些細胞團產生黃毛 一些細胞團產生黑毛 在白色背景下構成3色皮毛 現象與猜想 基因一定受到了某種修飾 這種修飾效應能夠通過有絲分裂和減數分裂實現代間傳遞 甲基化的發現 1979年McGhee等發現與雞 珠蛋白基因比鄰的胞嘧啶核苷酸甲基化后 該基因轉錄受抑制的現象 胞嘧啶的嘧啶環上第5位碳原子加上一個甲基 DNA甲基化的可遺傳特性是通過agoutiviableyellow Avy 小鼠模型研究發現的 Avy小鼠毛色控制基因agouti的第一外顯子前插入了一段逆轉座子 IAP 序列 agouti基因的表達間接地受到IAP的啟動子調控 因而IAP啟動子的甲基化狀態可以通過小鼠的毛色鑒定出來 通過給孕期的母鼠補充富含甲基的食物可以改變后代中三種毛色小鼠的比例 IAP啟動子被甲基化的小鼠 即棕色小鼠的比例增加了 IPA LTR LTR Phenotypediversitycontributedbydynamicsofepigenotype WT Agouti 別小看一個小小的修飾 卻給DNA增加了額外的信息 使得有限的基因組遺傳信息的表現呈現出豐富的多樣性和可塑性 簡單地把DNA甲基化理解為 一把鎖 凡是被DNA甲基化標記的部分 大都是需要被 塵封 監禁 的基因 比如基因組的 搗蛋鬼 轉座子 就是被甲基化這把 鎖 管制著 失去管制或管制不嚴 這些 搗蛋鬼 會在基因組里跳來跳去 把基因組搞得一團糟 會引起很多問題 如腫瘤 精神疾病等 酵母與果蠅基因組中未能檢測到任何甲基化CpG 這兩種生物并不依賴DNA甲基化的方式來控制基因活性 它們采用其它的機制來達到同一目的 脊椎動物與高等植物普遍利用DNA甲基化作為重要的調控機制 指在DNA甲基轉移酶 DNMTs 的作用下 以S 腺苷甲硫氨酸 SAM 為甲基供體 將甲基添加在DNA分子中的堿基上 常見的DNA甲基化發生在DNA鏈上的胞嘧啶第5位碳原子和甲基間的共價結合 胞嘧啶由此被修飾為5甲基胞嘧啶 5mC DNA甲基化的分子機理 哺乳動物基因組中約有5 10 是CpG位點 其中約有70 為mCpG CpG位點不是均勻分布 而是呈現局部聚集傾向 形成一些GC含量較高 CpG雙核苷酸相對聚集的區域 即CpG島 CpG島CpG島主要位于基因的啟動子區 少量位于基因的第一個外顯子區 其甲基化狀態直接影響基因表達 甲基化的CpG雙核苷酸通過募集轉錄抑制因子或者阻礙轉錄激活因子的結合抑制基因的表達 CpG島一般是非甲基化的 而在失活X染色體 印記基因和非表達的組織特異基因中則是甲基化的 成體基因組通常中 奢侈基因呈現高密度甲基化 而含有豐富CpG島的管家基因則呈非甲基化 基因組甲基化的特點 可逆性 許多甲基化位點可以根據細胞活性的要求重新甲基化或去甲基化 組織特異性 不同的組織細胞具有不同的甲基化模式 為基因表達設定程序 異常的甲基化可分為高甲基化和低甲基化 前者指正常組織中不發生甲基化的位點被甲基化 后者是指在正常組織中發生甲基化的位點去甲基化 Dnmts 3a 3b 1 DenovoDNAmethylation Maintenancemethylation Howmethlgroupadded 甲基化酶 一般按甲基化的方式將甲基化酶 DNAmethytransferase DNMT 分為2類 一種是維持型甲基轉移酶 需以半甲基化的雙鏈DNA為模板 指導新合成的鏈甲基化 一種是全新甲基化酶 不依賴半甲基化DNA分子中的甲基化模板而從新開始合成5mC 哺乳動物細胞中已知有活性的DNMT有3種 它們是DNMT1 DNMT3a DNMT3b DNMT1的主要功能是作為DNA復制復合物 DNAsynthesome 中的組分 催化子鏈DNA半甲基化位點甲基化 維持復制過程中甲基化位點的遺傳穩定性 DNMT3a和DNMT3b主要催化從頭甲基化 以非甲基化的DNA為模板 催化新的甲基化位點形成 在胚胎發育中起重要作用 甲基化酶 CpG島的形成 雖然人類基因組上有的CpG島處于甲基化狀態 但是大部分CpG島是不易被甲基化的 這同基因組上約80 的CpG雙核苷酸處于甲基化狀態的現象形成鮮明對比 該現象促使人們思考為什么CpG島不易被甲基化 去甲基化酶 哺乳動物體內可能存在去甲基化的酶 這種酶可能為一種糖基化酶 核酸內切酶或真正的去甲基化酶 近2年來 對去甲基化酶的研究有所突破 一般認為 DNA甲基化有兩種方式 一種是主動去甲基化 另一種是復制相關的DNA去甲基化 DNA甲基化抑制轉錄的機制 DNA軸的主溝是許多蛋白因子與DNA結合的部位 當胞嘧啶被甲基化后 5mC則突出至主溝中 從而干擾了轉錄因子與DNA結合 體外研究發現 某些特異轉錄因子與甲基化靶序列的親和力明顯降低 序列特異性甲基化結合蛋白 MBD MeCP 與啟動子區甲基化CpG島結合 阻止轉錄因子與啟動子靶序列的結合 從而影響基因的轉錄 1998年 英國愛丁堡大學的Nan和美國馬里蘭州的Johes等各自獨立發現 選擇性地結合于甲基化DNA上的特異的轉錄抑制因子MeCP2與組蛋白脫乙酰化酶 histonedeacetylase HDAC 在細胞中可存在于同一個復合物中 組蛋白H3 H4的N端尾部的賴氨酸發生去乙酰化 從而導致組蛋白上正電荷增加 與帶負電荷的DNA相互作用 使染色體結構壓縮 進一步限制轉錄因子的結合 引起轉錄抑制 組蛋白密碼 DNA甲基化與小RNA的關系 近年研究表明 siRNA和miRNA能在哺乳動物細胞中介導DNA甲基化 RdDM 組蛋白修飾及異染色質的形成 從而導致轉錄基因沉默 TGS 目前研究表明 Argonautes蛋白家族 AGO1及AGO2 DNMT3a 組蛋白去乙酰化酶 Histonedeacetylase 1 HDAC 1 和Polycomb蛋白家族 Polycombgroup PcG 的EZH2 Enhancerofzestehomolog2 參與了siRNA誘導的轉錄水平基因沉默 TGS 組蛋白甲基化酶 甲基化CpG結合蛋白 染色質域蛋白及組蛋白去乙酰化酶等基因均是miRNA潛在的作用靶標 piRNA是真核生物中主要控制轉座子活性的一類24 31nt的RNA分子 這類小分子RNA與Argonaute蛋白家族中的Piwi亞家族蛋白相互結合 故命名為Piwi interactingRNAs Piwi為一表觀遺傳學調控因子 能與PcG蛋白共同結合于基因組PcG應答元件上 協助PcG沉默同源異型基因 甲基化與發育 DNA甲基化與配子形成 胚胎發育的關系 哺乳動物生殖細胞在形成受精卵后的最初幾次卵裂中 發生DNA的去甲基化 即在去甲基化酶的作用下 去除DNA分子上幾乎所有從親代遺傳來的甲基化標記 此過程包括非特異性去甲基化和特異性去甲基化 胚胎早期的植入期前 整個基因組發生了普遍的非特異性去甲基化 非甲基化狀態保持到細胞的桑葚期前 此后的胚胎植入期間 組織特異性基因經歷選擇性的特異性甲基化 因此 成體基因組通常呈現2種DNA甲基化形式 奢侈基因呈現高密度甲基化 而含有豐富CpG島的管家基因則呈非甲基化 當細胞內新的甲基化模式形成后 即可通過甲基化酶以 甲基化維持 的形式將新的DNA甲基化傳遞給所有子細胞 印記基因 哺乳動物配子形成晚期 絕大多數順序按程序去甲基化 這一階段遺傳印記基因以性別專一性方式確定甲基化模式 從受精卵到胚泡階段 基因組范圍的甲基化均被抹去 但某些印記基因保持甲基化 當胚胎發育進入原腸胚期 細胞開始分化 重新設定基因組范圍的甲基化模式 以決定細胞的命運 精子和卵子的原核在受精后仍有一段時間的分離狀態 可以在顯微操作下進行原核去除或移植 全套染色體均來自雄親的小鼠或均來自雌親的小鼠均在發育過程中夭折 Memoryatthecellularlevel 甲基化與發育 性成熟個體 配子母細胞 成熟配子 早期胚胎 成體模式的胚胎 體細胞 生殖細胞 原始生殖細胞 甲基化清洗 印記 保持印記 部分保持印記 保持印記 保持印記 甲基化清洗重塑 X染色體失活 基因的時空特異性表達 甲基化異常導致的疾病 衰老 DNA甲基化同眾多疾病的發生與發展密切相關 比如 型糖尿病 自身免疫疾病以及各種癌癥 特別是癌癥 其發生過程中癌細胞基因組整體的欠甲基化和局部區域的超甲基化是其典型特征 超甲基化體現在抑癌基因的啟動子區被異常甲基化 整體的欠甲基化同重復序列 如轉座子 以及癌基因的啟動子區的甲基化程度減小 基因組遺傳不穩定性的增加密切相關 甲基化異常與疾病 Alu序列是重新甲基化過程中的甲基化中心 在甲基化轉移酶的作用下 DNA甲基化從Alu序列出發往外延伸 當CpG島周圍富集的轉錄因子結合位點同具有鋅指結構的轉錄因子結合以后則可以阻止甲基化向CpG島的蔓延 因此在這種阻止與蔓延的作用達到動態平衡以后 就形成了比較穩定的甲基化模式 當細胞所在的環境發生變化時 這種平衡可能會被打破 阻止功能的增強或者侵入能力的提高則可能使DNA甲基化往CpG島外或者往內移動 從而建立新的平衡 比如 如果某些順式元件發生突變 則本可以結合并阻礙DNA甲基化蔓延的特定轉錄因子可能因為結合能力的減弱使其阻礙功能變弱甚至消失 這種情況下 其附近的CpG島可能會被甲基化 因此 發生癌變的組織中抑癌基因的異常甲基化以及與老化過程相關的甲基化可能是由于這種保護機制的減弱造成的 Bibikova等對結腸癌 乳腺癌 肺癌和前列腺癌細胞系以及正常細胞中371個基因中的1536個位點的甲基化狀態進行聚類分析 發現各種癌癥都存在其特異的DNA甲基化生物標記 甲基化的分析檢測 DNA甲基化的檢測大體分為兩個步驟 a 待檢測樣品的前期處理 b 目標序列的定位和甲基化狀態的量化 待檢測樣品的前期處理方法主要包括三大類 a 亞硫酸氫鈉法 亞硫酸氫鈉把非甲基化的胞嘧啶轉化為尿嘧啶 而保持甲基化的胞嘧啶不變 以此實現兩類的分離 b 限制性內切酶法 限制性內切酶可以切割非甲基化的位點 而甲基化以后的識別位點將被保留 c 利用特定抗體對甲基化的胞嘧啶進行免疫沉淀反應 前期處理實現了甲基化和非甲基化的胞嘧啶分離以后 可以對分離出的甲基化DNA片段進行基因芯片雜交或者大規模深度測序 實現高通量的檢測 酶切法 對甲基化敏感程度不同的一對同裂酶HpaII和MspI 這對酶可識別CCGG位點 但對甲基化的敏感程度不同 HpaII對內 外側胞嘧啶甲基化敏感 MspI只對外側胞嘧啶甲基化敏感 而絕大多數基因組甲基化發生在胞嘧啶內側 因此可以用MspI來識別CCGG 用HpaII來鑒別這些序列是否甲基化 亞硫酸氫鈉 PCR法 在PCR反應時 設計兩套不同的引物對 一對引物序列針對經亞硫酸氫鈉處理后的甲基化DNA鏈設計 若用該對引物能擴增出片段 說明該檢測位點發生了甲基化 另一引物針對經亞硫酸氫鈉處理后的非甲基化DNA鏈設計 若用該對引物能擴增出片段 說明該檢測位點沒有甲基化 對引物的選擇和設計要求非常高 目前英國科學家提出 單分子納米孔測序儀能直接分辨出甲基化胞嘧啶和未修飾的胞嘧啶 當核酸外切酶消化單鏈DNA后 單個堿基落入孔中 它們瞬間與環式糊精相互作用 并阻礙了穿過孔中的電流 每個堿基ATGC以及甲基胞嘧啶都有自己特有的電流振幅 因此很容易轉化成DNA序列 納米孔技術就能直接讀出這5 甲基胞嘧啶 DNA甲基化的生物信息學研究進展 由于DNA甲基化在基因調控中的重要功能 以Sanger研究所為代表的人類表觀基因組聯盟 于2000年10月發起了人類表觀基因組計劃 humanepigenomeproject HEP 試圖獲得人類多個組織中的DNA甲基化模式 目前發表的較大規模的DNA甲基化相關數據庫有4個 MethDB MethyCancer PubMeth和MethCancerDB DNA甲基化的預測 分析 對單個CpG雙核苷酸的甲基化狀態預測 對CpG島片段以及CpG島的甲基化狀態預測 對CpG島的甲基化狀態與組蛋白修飾之間的關系的分析 體細胞分裂形成的 女兒 細胞 還可以繼續分裂 不僅繼承了 母親 細胞的基因組DNA序列 還十分忠實地拷貝了 母親 細胞基因組DNA的甲基化模式 但是 在生殖細胞形成過程中 還有受精卵向胚胎分化的過程中 基因組DNA的甲基化要經過一個大規模的 重塑 而且時間窗口很短 最新研究 DNA主動去甲基化的機理 DNA甲基化在這么短的時間內事如何被 清洗 掉的 回答這個問題的關鍵就是找到能夠將DNA的甲基化基團去掉的DNA去甲基化酶 DNAdemethylase 2005年 北大尚永豐實驗室報道了在卵巢癌細胞有基因特異性 主動DNA去甲基化 的現象 2006年 美國朱健康實驗室在植物發現并鑒定了DNA去甲基化酶 2007年 海德堡的發育生物學家Niehrs在Nature上發文報道一個DNA損傷誘導蛋白Gadd45a促進DNA去甲基化 美國加州貝克曼研究所的Pfeifer實驗室在PLoSGenet 上發文否定Niehrs的結果 題目針鋒相對 GADD45AdoesnotpromoteDNAdemethylation DNA去甲基化的機理 后來相繼有幾篇來自不同實驗室的報道肯定了Niehrs的結果 僅管如此 還是有些問題 Gadd4a基因敲除病不妨礙胚胎發育 也不會影響受精卵分裂前的去甲基化過程 2 Gadd4a其實并不是真正的去甲基化酶 它只是啟動核酸切除修復 主要用來修復紫外線對DNA的損傷 把一段甲基化的DNA切了 重新合成新鏈 但在全基因組水平上用切除DNA的方法進行甲基化重塑貌似不合理 2010年 劍橋的M AzimSurani和WolfReik先后在Nature和Science上報道 AID 胞嘧啶核苷脫氨酶 基因敲除的精子的去甲基化受到顯著影響 甲基胞嘧啶通過脫氨作用形成的尿嘧啶 尿嘧啶只能在RNA出現 如果在DNA出現 細胞會觸發堿基切除反應 他們都證實AID參與的去甲基化是通過對甲基化胞嘧啶的脫氨作用啟動堿基切除修復完成的 DNA去甲基化的機理 2009年 斯坦福大學醫學院的院士HelenM Blau證明誘導哺乳動物iPS需要AID蛋白參與啟動細胞的DNA去甲基化 并啟動細胞核重新編程過程 為了研究iPS誘導過程中的相關機制 他們構建了一個異核體細胞 融合了小鼠胚胎干細胞和人類成纖維細胞 這種異核體誘導的速度比正常的體細胞誘導速度快很多 僅需1天時間 誘導效率高達70 用RNAi進行掃描發現 異核體誘導啟動依賴一種蛋白 這種蛋白就是AID AID不僅促進細胞重排過程中的去甲基化 更是可以誘導OCT4和NANOG基因的表達 2種iPS誘導過程中的轉錄因子 AID蛋白對成纖維細胞上的OCT4與NANOG發揮作用 對胚胎干細胞不發揮作用 利用RNAi篩選系統尋找DNA去甲基化酶 2009年 張毅實驗室設計了一個能檢測活細胞基因組DNA甲基化狀態方法 并用受精卵細胞進行篩選 拿到了一個效果肯定的候選基因 轉錄延長因子ELP3 把MBPD與綠色熒光蛋白連起來 融合 相當于給MBPD加上了一個熒光標簽 可以在顯微鏡下直接觀察和追蹤MBD的位置 一般情況下 MBPD GFP是與基因組上甲基化的DNA結合 在在熒光顯微鏡下呈現綠色的斑點 在基因組甲基化被清除時 MBPD GFP就無處可以結合 因此就分散在細胞核內 在顯微鏡下 原來那些綠色熒光斑點消失 而變成了彌散的綠色 這樣通過觀察熒光信號的變化來判斷基因組甲基化的變化 通過RNA干擾技術 把選定的基因