1、菌種的保藏,組長：葉慧沁 組員：許重望、葉小冬 葉智瓊、葉妍悅,菌種保藏的意義,菌種是從事微生物學及生命科學研究的基本材料，在醫學領域中，診斷制品的制備，菌苗的生產、微生物致病性研究，藥物的抑菌試驗及藥品微生物檢驗等都有一套完整的菌種.微生物具有生命活力，在傳代過程中易發生變異甚至死亡，因此菌種保藏是一項重要的基礎工作，是微生物學基礎工作的一項重要內容，也是藥品微生物工作中的一項常用技術。,概念,標準菌株：由國內或國際菌種保藏機構保藏的，遺傳學特性得到確認和保證并可追溯的菌株。 標準儲備菌株：由標準菌株經一次傳代得到的培養物。 商業派生菌株：由供應商提供的所有特性與標準菌株等效的菌株。 工作菌

2、株：由標準儲備菌株經傳代得到的培養物。,中國醫學菌種保藏中心提供的標準菌株,法國生物梅里埃公司提供的商業派生菌株,保藏的標準儲備菌株,制備的工作菌株,菌種在培養或保藏過程中，由于自發突變的存在，出現某些原有優良生產性狀的劣化、遺傳標記的丟失等現象，稱為菌種的衰退。 菌種衰退不是突然發生的，而是從量變到質變的逐步演變過程。開始時，在群體細胞中僅有個別細胞發生自發突變（一般均為負變），不會使群體菌株性能發生改變。經過連續傳代，群體中的負變個體達到一定數量，發展成為優勢群體，從而使整個群體表現為嚴重的衰退。,菌種衰退的原因,1、菌種衰退的主要原因是有關基因的負突變。 2、表型延遲現象也會造成菌種衰退

3、。 3、質粒脫落導致菌種衰退的情況在抗生素生產中較多，不少抗生素的合成是受質粒控制的。 4、連續傳代是加速菌種衰退的一個重要原因。 5、不適宜的培養和保藏條件是加速菌種衰退的另一個重要原因。,如何預防衰退,1、合理的育種 2、選用合適的培養基 3、創造良好的培養條件 4、控制傳代次數 5、利用不同類型的細胞進行移種傳代 6、采用有效的菌種保藏方法,菌種的復壯,菌種的復壯（rejuvenation）：使衰退的菌種恢復原來優良性狀。 狹義的復壯是指在菌種已發生衰退的情況下，通過純種分離和生產性能測定等方法，從衰退的群體中找出未衰退的個體，以達到恢復該菌原有典型性狀的措施； 廣義的復壯是指在菌種的生

4、產性能未衰退前就有意識的經常、進行純種的分離和生產性能測定工作，以期菌種的生產性能逐步提高。實際上是利用自發突變（正變）不斷地從生產中選種。,復壯的方法,1、純種分離。采用平板劃線分離法、稀釋平板法或涂布法均可。把仍保持原有典型優良性狀的單細胞分離出來，經擴大培養恢復原菌株的典型優良性狀，若能進行性能測定則更好。還可用顯微鏡操縱器將生長良好的單細胞或單孢子分離出來，經培養恢復原菌株性狀。 2、通過寄主體內生長進行復壯（如Bacillus thuringiensis的復壯）。主要是對一些寄生性的菌株，可以將衰退的菌株接種到相應的宿主體內，提高其寄生性能及其它性能。 3、淘汰已衰退的個體（采用比較

5、激烈的理化條件進行處理，以殺死生命力較差的已衰退個體）。可以采用各種外界不良理化條件,使發生衰退的個體死亡,從而留下群體中生長健壯的個體.4、 4、采用有效的菌種保藏方法。,菌種保藏的基本原理,微生物具有容易變異的特性，因此，在保藏過程中，必須使微生物的代謝處于最不活躍或相對靜止的狀態，才能在一定的時間內使其不發生變異而又保持生活能力。 低溫、干燥和隔絕空氣是使微生物代謝能力降低的重要因素，所以，菌種保藏方法雖多，但都是根據這三個因素而設計的,選擇保藏方法時，首先應考慮方法能否長期地 保持菌種原有的特性，同時也應兼顧到方法的經濟 和簡便。在實際工作中，往往多種條件同時使用, 以提高保藏效果。

6、（二）菌種保藏步驟 挑選特征典型的純菌菌落； 確定保藏的合適菌體形態； 選擇最適宜的保藏方法； 定期對保藏菌種進行檢查，觀察是否發生變化，若有變化，須改變保藏方法。保藏期滿應及時進行移種。,1.瓊脂斜面低溫保存法,（1）方法：將經常使用的菌種的典型菌落接種在斜面（某些特殊菌種可用液體培養基）上，按規定的溫度和時間培養，待充分生長后，把培養好的新鮮菌種用牛皮紙保好，為減緩培養基的水分蒸發，延長保藏時間，可將菌種保藏管的棉花塞換成橡膠塞。放在4左右的冰箱中保藏。每隔 23個月移種一次，繼續進行保藏。若用半固體高層培養基穿刺培養，一般可保藏半年 一年。有的甚至更長時間。 （2）適用范圍：細菌、酵母菌

7、、霉菌保藏。,大腸桿菌斜面 金黃色葡萄球菌斜面,各類菌種保藏條件及時間,（3）特點： 優點是簡便，易于推廣；一般不需要另選擇保藏用培養基；對大多數微生物都適用。 缺點是保藏期太短；傳代次數多，易發生變異及污染。,（4）注意事項： 保藏的菌種應是生命活力旺盛的新鮮培養物，至少應是第三代的培養物。 保藏時，破傷風桿菌可用庖肉培養基；生孢梭菌用流體硫乙醇酸鹽培養基。 必須定期檢查保藏菌種冰箱的溫度、濕度以及菌種管的棉塞是否松動或生霉，如有異常應及時處理。 每次移植后，應與原菌種的編號、名稱逐一核對，確證培養基特征和純度無誤后再繼續保藏。 保藏菌種的培養基應無糖，其他菌類含糖小于 2 %為宜，以免產酸

8、過多，影響菌種存活。 銅綠假單胞菌在冰箱中易發生菌體自溶而死亡，不宜用本法保存。,2、液體石蠟保存法： 本法是用石蠟將培養物與空氣隔絕，以降低菌種的生理生化水平，并可防止水分蒸發，從而延長菌種的保藏期。,（1）方法： 將菌種接種于斜面或穿刺于0.3 0.5 %瓊脂半固體高層培養基中，培養好備用。 取化學純的液體石蠟裝在試管中，每管1015ml，加棉塞，瓶口包上紙，121高壓滅菌30min，取出置37溫箱或 110 170 烤箱中 1 2 h 或干燥器內除去液體石蠟中的水分。,將上述液體石蠟加入培養好的菌種試管內，液體石蠟液面以高出培養基最上端 1 為宜，將試管直立，放入4冰箱中保藏。 適用范圍：適用于保藏部分霉菌，酵母菌和放線菌，對細菌保藏效果較差。,液體石蠟對各類菌種保藏效果,（3）特點： 本方法簡便易行，是實驗室常用的一種保藏方法， 該法主要使菌種與空氣隔絕。 （4）注意事項： 保藏時，用新鮮培養物接種，應檢查純度和特征 后，方可進行保藏。 保藏過程中，需經常觀察斜面是否干燥，如干燥， 需重新移種。 使用菌種時，先將菌種管傾斜使液體石蠟流至一 邊，再用接種針挑取培養物接種到新鮮斜面上培 養，待長出新培養物后，再移種一次到新斜面上 即可使用。,將沾有少量液體石蠟的接種針浸于95%酒精中片刻，再燒灼滅菌，以免直接