第2課時

微生物的選擇與純培養第1章微生物技術學習導航

1.閱讀教材P9內容，分析培養基對微生物的選擇作用。2.結合教材P11～12“微生物的分離與純化實驗”，理解并掌握利用平板劃線分離法和涂布分離法來純化微生物的方法。重難點擊

1.探究培養基對微生物的選擇作用。2.掌握微生物分離與純化的基本操作。一、培養基對微生物的選擇作用二、微生物的分離與純化內容索引當堂檢測一、培養基對微生物的選擇作用基礎梳理不同微生物的營養需求不同，因此同一培養基上不同微生物的生長繁殖情況不同，同一種微生物在不同培養基上的生長繁殖情況也不同。通過實驗探究分析培養基對微生物的選擇作用。1.實驗探究利用牛肉膏蛋白胨培養基檢測空氣中的微生物，利用馬鈴薯葡萄糖培養基檢測桌面上的微生物。(1)實驗方法①空氣打開無菌平板，讓其在空氣中暴露30～60min。②桌面用一根無菌棉簽，先在無菌平板的一個區域潤濕，然后用其擦抹桌面，再用此棉簽在平板的另一區域內來回劃線。(2)實驗結果①同種培養基上生長的微生物類群主要有：

、

、

和酵母菌。②在牛肉膏蛋白胨培養基中

的數量多，為優勢菌；在馬鈴薯葡萄糖培養基中

的數量多，為優勢菌。(3)上述實驗說明在科研或工業生產中如果想獲得一種培養物應采取的措施是：配制

，采用適當的稀釋度，得到某一種微生物的

，即

。細菌放線菌霉菌細菌霉菌相應的培養基純培養物單菌落2.歸納分析(1)菌落概念：微生物的

菌體或孢子在

培養基表面上生長繁殖形成的肉眼可見的

，稱為菌落。(2)菌落特征：不同種微生物對營養要求不一樣，在相應的培養基上可形成大小、形態各異的菌落(如圖)，由圖思考：單個固體細胞群體①細菌菌落的特征：濕潤、黏稠、易挑起、菌落顏色

。②酵母菌菌落的特征：與

極相似，但是菌落要

，顏色單調。③霉菌菌落的特征：較

、常呈絨毛狀、絮狀或

狀，一般比細菌菌落大

倍。一致細菌大而厚疏松蜘蛛網幾倍到幾十(3)利用不同培養基培養、分離微生物種類營養需求pH范圍適用培養基細菌_____________________________________________酵母菌和霉菌_______________________________________________高氮源(C∶N＝4∶1)高碳源(C∶N＝16∶1)7.2～7.65～6牛肉膏蛋白胨培養基馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基3.選擇培養基根據微生物對營養物質、pH、氧氣等要求的不同，在培養基中加入某種化學物質，促進需要的微生物的生長，或者抑制不需要的微生物的生長，從而淘汰不需要的微生物，分離得到需要的微生物純種，這樣的培養基稱為選擇培養基。1.不同種微生物菌落的區別(1)酵母菌菌落與細菌菌落有何區別？答案酵母菌菌落外形上與細菌極為相似，但比細菌菌落大而厚，顏色也較單調。(2)霉菌菌落與細菌菌落有何區別？答案霉菌菌落較疏松，常呈絨毛狀、絮狀或蜘蛛網狀，一般比細菌菌落大幾倍到幾十倍。問題探究答案答案2.培養基的采用及原因(1)培養細菌常采用什么培養基，原因是什么？答案牛肉膏蛋白胨培養基，原因是細菌生長需要的氮源高(C/N比為4∶1)，pH中性或微堿性(pH7.2～7.6)，因此培養細菌常采用牛肉膏蛋白胨培養基。(2)培養酵母菌和霉菌常采用什么培養基，原因是什么？答案馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基，酵母菌和霉菌生長所需的碳源含量高(C/N比為16∶1)，pH偏酸性(pH5～6)，因此培養酵母菌和霉菌常采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(簡稱PDA)。歸納總結(1)菌落中的微生物是同一類型的，可以看做一個種群，菌落的特征是進行菌種鑒定的重要依據之一。(2)常見的選擇培養基①加入青霉素可以分離出酵母菌和霉菌。②加入高濃度的食鹽可得到金黃色葡萄球菌。③無氮源培養基可以分離固氮微生物。④石油是唯一碳源的培養基，可以分離能消除石油污染的微生物。⑤將培養基放在高溫環境中培養，分離耐高溫的微生物。拓展應用1.下列關于四種生物的能源、碳源、氮源和代謝類型的描述，其中正確的一組是項目硝化細菌乳酸菌酵母菌衣藻能源氧化NH3分解乳酸固定N2利用光能碳源CO2糖類糖類CO2氮源NH3N2N2NO代謝類型自養需氧型異養需氧型異養需氧型自養需氧型答案解析A.硝化細菌、乳酸菌

B.乳酸菌、酵母菌C.酵母菌、衣藻

D.硝化細菌、衣藻解析解答此題時應明確：硝化細菌、乳酸菌屬于細菌，酵母菌屬于真菌，衣藻屬于真核生物。微生物所需的能源、碳源、氮源因其同化作用類型的不同而不同。2.培養基是人工配制的適合不同微生物生長繁殖或積累代謝產物的營養基質。先用完全培養基培養混合菌種，然后分別放在A、B、C三種特殊培養基上培養，分別得到菌落①、②、③。其中A培養基以蛋白質為唯一碳源；B培養基中缺氮源；C培養基中成分如下表：成分粉狀硫MgSO4·7H2O(NH4)2SO4FeSO4KH2PO4CaCl2H2O含量10g0.5g0.4g0.01g4g25g1000mL請分析回答：(1)菌落③同化作用類型最可能是

。A.光能自養型

B.化能自養型C.異養型

D.A或B(2)如果要獲得具有固氮能力的菌株，應選用菌落

；如果要培育獲得大量蛋白酶的菌株，應選用菌落

。(3)從題中分析可見，生物進化的內在因素是

，對生物生存起重要作用的因素是

。答案解析問題導析②①遺傳和變異外界環境條件返回上頁答案問題導析

(1)

可水解蛋白質為氨基酸。(2)當培養基無氮源時，

微生物可以進行固氮作用，獲得氮源。(3)題干表格中缺少

成分且含硫較多。蛋白酶固氮碳源返回上頁解析由題目可知：A培養基以蛋白質為唯一碳源，則菌落①的菌株可合成較多的蛋白酶；B培養基中缺氮源，只能培養固氮微生物；C培養基中無碳源且含有大量粉狀硫，可培養化能自養型微生物，所以生物的生存是由外界環境條件決定的。二、微生物的分離與純化基礎梳理要研究某種微生物的特性，就要從混雜的樣品中分離所需的菌種進行純培養。閱讀教材，試以大腸桿菌為例探討微生物分離與純化的方法。1.實驗原理微生物的分離與純化就是將待檢測微生物樣品通過

接種在

培養基上，樣品中的每一個細胞或孢子都可以生長繁殖形成_____

。將單個菌落接種到

培養基上，經培養后，即可得到一個微生物的純種。劃線或涂布固體單個菌落斜面2.方法步驟(1)稀釋：用1mL

吸取1mL大腸桿菌培養液，加入到盛有9mL

的大試管中，充分混勻，然后用無菌吸管從此試管中吸取1mL加入另一支盛有9mL無菌水的試管中混合均勻，依次類推制成10－1、10－2、10－3、10－4、10－5、10－6系列稀釋度的大腸桿菌稀釋液。無菌吸管無菌水(2)劃線或涂布①平板劃線分離法a.操作：在

處，左手拿皿底，右手拿接種環，挑取大腸桿菌培養液一環在平板上劃線。b.劃線方法：

劃線和

劃線。近火焰平行連續c.平行劃線時，第一次劃線及每次劃線之前都要灼燒接種環，劃線結束后也要灼燒接種環，目的分別是什么？答案項目第一次灼燒每次劃線之前灼燒劃線結束時灼燒目的殺死接種環上原有的微生物殺死上次劃線后接種環上殘留的菌種，使下次劃線的菌種直接來源于上次劃線的末端，使每次劃線后菌種數目減少殺死接種環上殘存的菌種，避免細菌污染環境和感染操作者②涂布分離法a.將

浸在盛有酒精的燒杯中。b.取不超過0.1mL的

，滴加到培養基表面。c.將蘸有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃盡后，冷卻8～10s。d.用涂布器將菌液均勻地涂布在培養基表面。涂布時可轉動培養皿，使菌液分布均勻。(3)培養：將接種的平板

于培養箱或溫室中37℃培養16～24h。涂布器菌液倒置3.接斜面從

上挑取少許細胞，接種到

上，置于培養箱或溫室37℃培養24h，菌種長好后，4℃保存備用。單個菌落斜面培養基1.平板劃線分離法操作注意事項(1)平板劃線分離法接種菌種時，哪些操作可防止雜菌污染？答案①接種前將接種環放在酒精燈火焰上灼燒。②劃完一個區域后，將接種環灼燒，冷卻后再劃下一區域。③接種環沾取菌液時，要將試管口、棉塞等通過火焰。④劃線時將培養皿打開一條縫隙，將沾有菌種的接種環迅速伸入平板內。問題探究答案(2)在灼燒接種環之后，為什么要等其冷卻后再進行劃線？答案避免接種環溫度太高，殺死菌種。(3)在做第二次劃線以及其后的操作時，為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線？答案劃線后末端含有的細菌數目較少，每次從上一次的末端開始劃線能夠使細菌的數目隨劃線次數的增加而逐漸減少，最終分散成單個的細菌。(4)為何最后一次劃線不能與第一次劃線相連？答案最后一次劃線已經將細菌稀釋成單個的細胞，如果與第一次劃線相連則增加了細菌的數目，得不到純化的效果。答案2.涂布分離法操作注意事項(1)涂布分離法的所有操作都應在火焰附近進行。結合平板劃線與系列稀釋的無菌操作要求，想一想將菌液滴加到培養基上時應如何進行無菌操作？答案應從操作的各個細節保證“無菌”。例如，酒精燈與培養皿的距離要合適，吸管頭不要接觸任何其他物體，吸管要在酒精燈火焰附近等。(2)操作結束后，為什么要將一個未接種的培養基和接種的培養基放在一起培養？未接種的培養基表面是否有菌落生長很關鍵。如果有菌落生長，說明了什么？答案培養未接種培養基的作用是對照。未接種的培養基在恒溫箱中保溫1～2d后無菌落生長，說明培養基的制備是成功的；若有菌落生長，說明培養基滅菌不徹底，或培養基被污染，需要重新制備。答案

平板劃線分離法涂布分離法特點操作簡單，但是單菌落不易分離操作復雜，但是單菌落易分離原理連續劃線。由于劃線后，線條末端細菌的數目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使細菌的數目隨著劃線次數的增加而逐步減少，最終能得到由單個細菌繁殖而來的菌落將菌液進行一系列的梯度稀釋，然后將不同稀釋度的菌液分別涂布到瓊脂固體培養基的表面，進行培養。在稀釋度足夠高的菌液里，聚集在一起的微生物將被分散成單個細，從而能在培養皿表面形成單個菌落歸納總結平板劃線分離法和涂布分離法的比較操作注意事項第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環，在劃線操作結束時，仍然需要灼燒接種環。在灼燒接種環之后，要等其冷卻后再進行劃線，以免接種環溫度太高殺死菌種涂布平板的所有操作都應在火焰附近進行。應從操作的各個細節保證“無菌”。例如，對涂布器等接種器具進行消毒和滅菌、酒精燈與培養皿的距離要合適、吸管頭不要接觸任何其他物體、吸管要在酒精燈火焰周圍；等等相同點用平板劃線分離法和涂布分離法接種的目的是：使聚集在一起的微生物分散單個細胞，從而能在培養基表面形成單個的菌落，以便于純化菌種拓展應用3.涂布分離法是微生物培養中常用的一種接種方法。下列相關敘述錯誤的是A.操作前需要將菌液進行一系列的梯度稀釋B.需將不同稀釋度的菌液分別涂布到固體培養基表面C.不同濃度的菌液均可在培養基表面形成單個菌落D.操作過程中對培養基和涂布器等均需進行嚴格滅菌處理答案解析解析涂布分離法要先將菌液進行一系列的梯度稀釋，A項正確；只有在稀釋度足夠高的菌液中，聚集在一起的微生物才被分散成單個細胞，從而能在培養基表面形成單個菌落，故而要將不同稀釋度的菌液分別涂布平板，B項正確、C項錯誤；在稀釋涂布過程中，為防止雜菌污染，要對培養基和涂布器等進行嚴格滅菌處理，D項正確。一題多變(1)B項中不同稀釋度的菌液一般涂布幾個平板為宜？答案為保證結果準確，每個稀釋度的菌液一般涂布3個平板，并對結果取平均值。(2)如何證明該接種過程是成功的？答案將接種后的培養基和一個未接種的培養基都放入適宜溫度的恒溫箱中，培養12h和24h后，觀察培養基上的菌落情況，若未接種的培養基上無菌落生長，則證明操作是成功的；否則不成功。答案答案(3)題中如果不同稀釋度的菌液接種后都不能得到單細胞菌落，原因可能是什么？答案可能是稀釋度不夠，聚集在一起的微生物沒能被分散成單個細胞。(4)如果不進行D項操作，培養基上的菌落可能有哪些變化？答案菌落種類和數目增多。4.圖甲是涂布分離法中的部分操作，圖乙是平板劃線分離法操作結果。下列敘述中，錯誤的是A.甲中涂布前要將涂布器灼燒，冷卻后才能取菌液B.對于濃度較高的菌液，如果甲中的稀釋倍數僅為102，則所得的菌落可能

不是由單一的細胞或孢子繁殖而成C.乙中培養皿中所得的菌落都符合要求D.乙中的連續劃線的起點是上一次劃線的末端答案解析問題導析問題導析(1)對菌液進行稀釋時，菌液中菌體的濃度越高，則稀釋的倍數也要

，菌體的濃度低時，則稀釋的倍數不必

。(2)高溫會殺死菌體，所以一些經過高溫或灼燒滅菌的器材需要

后才能接觸菌種。(3)平板劃線分離法的多次劃線中，菌體

，即不同劃線處的

不同，所以形成的菌落并非全部是由單個菌體繁殖而成的。返回上頁答案越高太高冷卻越來越少菌體數目解析灼燒后的涂布器如果沒有冷卻就接觸菌種，會將菌體殺死，A正確；稀釋倍數過低，會導致多個菌體聚集在一起繁殖成菌落，B正確；平板劃線分離法中一般最后一次劃線的末端處形成的菌落才是由單一的細胞或孢子繁殖而成，這種菌落才符合要求，C錯誤；連續劃線中，除了第一次劃線外，每一次劃線的起點是上一次劃線的末端，目的是使菌體密度越來越小，保證最后劃線末端處的菌落是由單一的細胞或孢子繁殖而成，D正確。返回上頁一題多變稀釋倍數和劃線次數是兩種接種方法的關鍵，決定稀釋倍數和劃線次數的因素是什么？答案決定稀釋倍數及劃線次數的因素是菌液的濃度，如果菌液的濃度較高則需要高倍數的稀釋，所劃線次數也要較多，否則就可以低倍稀釋或減少劃線次數。答案拓展提升兩種接種方法中，只有涂布分離法才適合對細菌進行計數的原因只要稀釋倍數足夠高，則涂布分離法中形成的每個菌落都是由單一菌體繁殖而成的，即一個肉眼看不見的細菌對應著一個可以看見的菌落，可以通過統計菌落的數目推測出細菌的數目。而平板劃線分離法中一般除了最后一次劃線末端處的菌落是由單一的細菌繁殖而成的，其他每個菌落往往是由多個細菌一起繁殖而成，即一個菌落并非對應著一個細菌，所以不適合用于細菌的計數。課堂小結營養需求選擇平板劃線法、涂布分離法斜面當堂檢測1.微生物培養過程中，肉眼鑒別金黃色葡萄球菌和枯草桿菌的重要依據是A.細菌的大小、形狀、顏色B.菌落的大小、形狀、顏色C.有無鞭毛D.培養基的不同解析微生物的鑒別和分離，一般要用固體培養基，由于不同微生物在固體培養基上長出菌落的形狀、顏色等各不相同，所以可以作為鑒別的標準，因為每一個細菌細胞很小，肉眼無法看到其顏色、形狀等。23451答案解析√2.通過選擇培養基可以從混雜的微生物群體中分離出所需的微生物。在缺乏氮源的培養基上，大部分微生物無法生長；在培養基中加入青霉素，可以抑制細菌和放線菌；在培養基中加入10%的酚，可以抑制細菌和霉菌。利用上述方法不能從混雜的微生物群體中分離出A.大腸桿菌

B.霉菌C.放線菌

D.圓褐固氮菌答案解析√2345123451解析固氮細菌的生長不需要從培養基中獲得氮源，可在缺乏氮源的培養基上正常生長，因此可分離出圓褐固氮菌；在加入青霉素的培養基上不能生長細菌和放線菌，可分離出霉菌；在加入10%的酚的培養基中，因該培養基能抑制細菌和霉菌的生長，所以可分離出放線菌。利用上述三種培養基無法分離出大腸桿菌。3.如圖是微生物平板劃線分離法示意圖，劃線的順序為1→2→3→4→5。下列操作方法正確的是A.操作前不用進行任何處理B.劃線操作必須在火焰上進行C.在5區域中才可以得到所需菌落D.在1、2、3、4、5區域中劃線前后都要對接種環滅菌解析劃線之前應對接種環滅菌；劃線操作在酒精燈火焰旁進行；從1區域至5區域菌落密度越來越小，可能會在3、4、5區域得到所需菌落。答案解析23451√4.分離純化