有限公司Co.,Ltd.文件名稱(chēng)文件編號(hào)致病菌檢驗(yàn)操作規(guī)程版本狀態(tài)V1.2頁(yè)碼第4頁(yè)有限公司Co.,Ltd.致病菌檢驗(yàn)操作規(guī)程文件編號(hào)：HM-WI-SYS-0028版次：V1.2生效日期：20XX年04月15日分發(fā)號(hào)：文件變更記錄序號(hào)更改原因更改內(nèi)容更改后版本更改人/日期1新編制全部V1.02部分修改檢測(cè)方法V1.13部分修改內(nèi)容調(diào)整V1.2致病菌檢驗(yàn)操作規(guī)程目的：規(guī)范致病菌的操作，保證儀器的正確使用和實(shí)驗(yàn)的真實(shí)有效性。范圍：適用于本公司成品致病菌檢驗(yàn)。3.職責(zé)：質(zhì)管部門(mén)制定作業(yè)指導(dǎo)書(shū)，檢驗(yàn)室檢驗(yàn)人員嚴(yán)格按本文件操作，對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性負(fù)責(zé)。4.內(nèi)容：4.1試驗(yàn)所需儀器、器具、試劑及培養(yǎng)基4.1.1設(shè)備生物安全柜，恒溫培養(yǎng)箱，恒溫水浴箱，壓力蒸汽滅菌器，電熱干燥箱，天平，顯微鏡。4.1.2器具接種環(huán)，玻璃棒，移液管，燒杯，干燥載玻片，玻璃管，小導(dǎo)管，鑷子，剪刀，250mL的錐形瓶，酒精燈，培養(yǎng)皿（直徑9cm）。與培養(yǎng)基接觸的錐形瓶、培養(yǎng)皿和其他器具在使用前用壓力蒸汽滅菌器進(jìn)行滅菌（參數(shù)：103.4Ka，121℃，30min），或置電熱干燥。4.1.3試劑及培養(yǎng)基乳糖膽鹽發(fā)酵管，伊紅美藍(lán)瓊脂，革蘭氏染色試劑盒，SCDLP培養(yǎng)液，十六烷三甲基溴化銨瓊脂，綠膿菌素測(cè)定用培養(yǎng)基，三氯甲烷，硝酸鹽胨水培養(yǎng)基，明膠培養(yǎng)基，血瓊脂培養(yǎng)基，甘露醇培養(yǎng)液，生理鹽水，兔血漿（0.5ml），葡萄糖肉湯，血平板培養(yǎng)基，氯化鈣，草酸鉀，1%二甲基對(duì)苯二胺試液。按需求量配制培養(yǎng)基，在培養(yǎng)要求的條件下在高壓蒸汽滅菌器中滅菌，并在微生物無(wú)菌室潔凈操作臺(tái)內(nèi)冷卻至約45℃，將培養(yǎng)基注入培養(yǎng)皿，每皿約15～20m1，待瓊脂培養(yǎng)基凝固后，即可供采樣用。5.實(shí)驗(yàn)操作樣液制備：在100級(jí)凈化條件下用無(wú)菌方法打開(kāi)用于檢測(cè)的至少3個(gè)包裝，從每個(gè)包裝中取樣，準(zhǔn)確稱(chēng)取10g±1g樣品。剪碎后加人到200ml滅菌生理鹽水中，充分混勻，得到一個(gè)生理鹽水樣液。液體產(chǎn)品用原液直接做樣液。5.大腸桿菌檢測(cè)方法5.1.1操作步驟取樣液5ml接種50ml，乳糖膽鹽發(fā)酵管，置35℃±2℃培養(yǎng)24h，如不產(chǎn)酸也不產(chǎn)氣，則報(bào)告為大腸菌群陰性。如產(chǎn)酸產(chǎn)氣，則劃線(xiàn)接種伊紅美藍(lán)瓊脂平板，置35℃±2℃培養(yǎng)18-24h，觀察平板上菌落形態(tài)。典型的大腸菌落為黑紫色或紅紫色，圓形，邊緣整齊，表面光滑濕潤(rùn)，常具有金屬光澤，也有的呈紫黑色，不帶或略帶金屬光澤。或粉紅色，中心較深的菌落。取疑似菌落1-2個(gè)作革蘭氏染色鏡檢，同時(shí)接種乳糖發(fā)酵管，置35℃±2℃培養(yǎng)24h觀察產(chǎn)氣情況。5.1.2結(jié)果報(bào)告凡乳糖膽鹽發(fā)酵管產(chǎn)酸產(chǎn)氣，乳糖發(fā)酵管產(chǎn)酸產(chǎn)氣，在伊紅美藍(lán)平板上有典型大腸菌落，革蘭氏染色為陰性無(wú)芽胞桿菌，可報(bào)告被檢樣品檢出大腸桿菌。6.0綠膿桿菌檢測(cè)方法6.1操作步驟取樣液5ml，加人到50mlSCDIP培養(yǎng)液中，充分混勻，置35℃±2℃培養(yǎng)18-24h。如有綠膿桿菌生長(zhǎng)，培養(yǎng)液常呈現(xiàn)一層薄菌膜，培養(yǎng)液常呈黃綠色或藍(lán)綠色。從培養(yǎng)液的薄菌膜處挑取培養(yǎng)物，劃線(xiàn)接種十六烷三甲基溴化銨瓊脂平板，置35℃±2℃培養(yǎng)18-24h，觀察菌落特征。綠膿桿菌在此培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，菌落扁平，邊緣不整，菌落周?chē)囵B(yǎng)基略帶粉紅色，其他菌不長(zhǎng)。取可疑菌落涂片作革蘭氏染色，鏡檢為革蘭氏陰性菌者應(yīng)進(jìn)行下列試驗(yàn):氧化酶試驗(yàn)：取一小塊潔凈的白色濾紙片放在滅菌平皿內(nèi)，用無(wú)菌玻棒挑取可疑菌落涂在濾紙片上，然后在其上滴加一滴新配制的1%二甲基對(duì)苯二胺試液，30s內(nèi)出現(xiàn)粉紅色或紫紅色，為氧化酶試驗(yàn)陽(yáng)性.不變色者為陰性。綠膿菌素試驗(yàn):取2-3個(gè)可疑菌落，分別接種在綠膿菌素測(cè)定用培養(yǎng)基斜面，35℃±2℃培養(yǎng)24h，加人三氯甲烷3-5ml，充分振蕩使培養(yǎng)物中可能存在的綠膿菌素溶解，待三氯甲烷呈藍(lán)色時(shí)，用吸管移到另一試管中并加人1mol/L的鹽酸1ml，振蕩后靜置片刻。如上層出現(xiàn)粉紅色或紫紅色即為陽(yáng)性，表示有綠膿菌素存在。硝酸鹽還原產(chǎn)氣試驗(yàn)：挑取被檢菌落純培養(yǎng)物接種在硝酸鹽胨水培養(yǎng)基中，置35℃±2℃培養(yǎng)24h.培養(yǎng)基小倒管中有氣者即為陽(yáng)性明膠液化試驗(yàn):取可疑菌落純培養(yǎng)物，穿刺接種在明膠培養(yǎng)基內(nèi)，置35℃±2℃培養(yǎng)24h，取出放于4-10℃，如仍呈液態(tài)為陽(yáng)性，凝固者為陰性。42℃生長(zhǎng)試驗(yàn)：取可疑培養(yǎng)物，接種在普通瓊脂斜面培養(yǎng)基上，置42℃培養(yǎng)24-48h，有綠膿桿菌生長(zhǎng)為陽(yáng)性。6.2結(jié)果報(bào)告被檢樣品經(jīng)增菌分離培養(yǎng)后，證實(shí)為革蘭氏陰性桿菌，氧化酶及綠膿桿菌試驗(yàn)均為陽(yáng)性者，即可報(bào)告被檢樣品中檢出綠膿桿菌。如綠膿菌素試驗(yàn)陰性而液化明膠、硝酸鹽還原產(chǎn)氣和42℃生長(zhǎng)試驗(yàn)三者皆為陽(yáng)性時(shí)，仍可報(bào)告被檢樣品中檢出綠膿桿菌。7.0金黃色葡萄球菌檢測(cè)方法7.1操作步驟：取樣液5ml，加入到50mLSCDLP培養(yǎng)液中，充分混勻，置35℃±2℃培養(yǎng)24h，自上述增菌液中取1-2接種環(huán)，劃線(xiàn)接種在血瓊脂培養(yǎng)基上，置35℃±2℃培養(yǎng)24～48h。在血瓊脂平板上該菌菌落呈金黃色，大而突起，圓形，不透明，表面光滑，周?chē)腥苎ΑＬ羧〉湫途洌科鞲锾m氏染色鏡檢，金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽(yáng)性球菌，排列成葡萄狀，無(wú)芽胞與莢膜。鏡檢符合上述情況，應(yīng)進(jìn)行下列試驗(yàn)：甘露發(fā)酵試驗(yàn):取上述菌落接種甘露醇培養(yǎng)液，置35℃±2℃培養(yǎng)24h，發(fā)酵甘露醇產(chǎn)酸者為陽(yáng)性。血漿凝固酶試驗(yàn):玻片法：取清潔干燥載玻片，一端滴加一滴生理鹽水，另一端滴加一滴兔血漿，挑取菌落分別與生理鹽水和血漿混合，5min如血漿內(nèi)出現(xiàn)團(tuán)塊或顆粒狀凝塊，而鹽水滴仍呈均勻混濁無(wú)凝固則為陽(yáng)性，如兩者均無(wú)凝固則為陰性。凡鹽水滴與血漿滴均有凝固現(xiàn)象，再進(jìn)行試管凝固酶試驗(yàn)；試管法：吸取1:4新鮮血漿0.5ml，放滅菌小試管中，加入等量待檢菌24h肉湯培養(yǎng)物0.5ml混勻，放35℃±2℃溫箱或水浴中，每半小時(shí)觀察一次，24h之內(nèi)呈現(xiàn)凝塊即為陽(yáng)性。同時(shí)以已知血漿凝固酶陽(yáng)性和陰性菌株肉湯培養(yǎng)物各0.5ml作為陽(yáng)性與陰性對(duì)照。7.2結(jié)果報(bào)告凡在瓊脂平板上有可疑菌落生長(zhǎng)，鏡檢為革蘭氏陽(yáng)性葡萄球菌，并能發(fā)酵甘露醇產(chǎn)酸，血漿凝固酶試驗(yàn)陽(yáng)性者，可報(bào)告被檢樣品檢出金黃色葡萄球菌。8.溶血性鏈球菌檢測(cè)方法8.1操作步驟取樣液5ml加人到50ml葡萄糖肉湯，35℃±2℃培養(yǎng)24h，將培養(yǎng)物劃線(xiàn)接種血瓊脂平板，35℃±2℃培養(yǎng)24h觀察菌落特征。溶血性鏈球菌在血平板上為灰白色，半透明或不透明，針尖狀突起，表面光滑，邊緣整齊，周?chē)袩o(wú)色透明溶血圈。挑取典型菌落作涂片革蘭氏染色鏡檢，應(yīng)為革蘭氏陽(yáng)性，呈鏈狀排列的球菌。鏡檢符合上述情況，應(yīng)進(jìn)行下列試驗(yàn)：鏈激酶試驗(yàn)：吸取草酸鉀血漿0.2ml-(0.01g草酸鉀加5ml兔血漿混勻，經(jīng)離心沉淀，吸取上清液)，加人0.8ml滅菌生理鹽水，混勻后再加入待檢菌24h肉湯培養(yǎng)物0.5ml和0.25%氯化鈣0.25ml，混勻，放35℃±2℃水浴中，2min觀察一次(一般10min內(nèi)可凝固)，待血漿凝固后繼續(xù)觀察，并記錄溶化時(shí)間。如2h內(nèi)不溶化，繼續(xù)放置24h觀察，如凝塊全部溶化為陽(yáng)性，24h仍不溶化為陰性。桿菌肽敏感試驗(yàn):將被檢菌菌液涂于血平板上，用滅菌鑷子取每片含0.04單位桿菌肽的紙片放在平板表面上，同時(shí)以已知陽(yáng)性菌株作對(duì)照，在35℃±2℃下放置18～2