儀器分析項目五

高效液相色譜分析認識高效液相色譜法1認識高效液相色譜儀2掌握高效液相色譜儀的應用3概念與特點分離類型認識高效液相色譜法11.2.1液-固吸附色譜法液-固吸附色譜法是以固體吸附劑作固定相，被分離物質在固定相吸附力大小的不同而實現分離的方法。固定相極性：硅膠、氧化鋁等，其中全多孔型硅膠微粒固定相使用最廣泛。非極性：活性炭等。流動相極性大的試樣用極性較強的流動相，極性小的則用極性較低的流動相。特別適宜于分離異構體。具體為偶氮染料、維生素、極性小的植物色素等。分離原理1.2.2液-液分配色譜法分離原理液-液分配色譜法是根據物質在兩種不互溶（或部分互溶）的液體中溶解度的不同而實現分離的方法。將特定的液態（固定液）涂漬在惰性載體（擔體）表面制備固定相，與流動相組成液液兩相。組分分離時依據不同的組分在互不相溶的兩相中分配系數不同，因而溶質在兩相間進行分配。固定液易被流動相漸漸溶解而流失，流動相流速不能高，不能采用梯度洗脫，柱的重復性、穩定性不好，使用受限。1.2.3鍵合相色譜法定義化學鍵合相色譜法（BPC）是采用將固定液利用化學反應鍵合到載體表面上，使其形成均一、牢固的單分子薄層而構成的固定相的液相色譜法。據統計，在高效液相色譜法中，約有80%的分離問題可以用鍵合相色譜法解決。十八烷基硅烷(ODS)鍵合相1.2.3鍵合相色譜法化學鍵合相類型載體：廣泛使用全孔型或薄殼型微粒硅膠。鍵合反應：硅烷化反應、硅酸酯化反應類型：非極性鍵合相（鍵合ODS或C18等非極性基團）

極性鍵合相（鍵合-NH2、-CN、醇基等極性基團）

離子型鍵合相（鍵合季銨鹽、磺酸基等可交換陰或陽離子基團)據統計，在高效液相色譜分析任務中，約有80%由C18反相鍵合相解決。1.2.3鍵合相色譜法正相鍵合相色譜法特征——固定相極性＞流動相極性固定相——-NH2、-CN等極性鍵合相流動相——非極性或弱極性溶劑（如正己烷）+適量極性溶劑（如乙腈、

三氯甲烷、醇等混合溶劑分離機制——類似液-液分配色譜的分離原理應用范圍——分離溶于有機溶劑的極性至中等極性的分子型化合物

1.2.3鍵合相色譜法反相鍵合相色譜法特征——固定相極性＜流動相極性固定相——ODS（C18）或辛烷基硅烷（C8）等非極性或弱極性鍵合相流動相——水+有機調節劑（如水-甲醇、水-乙腈、水-甲醇-無機鹽緩沖液等）分離機制——“疏溶劑作用”理論應用范圍——適用于分離非極性至中等極性的分子型化合物

1.2.3鍵合相色譜法1-對羥基苯甲酸甲酯2-對羥基苯甲酸乙酯3-對羥基苯甲酸丙酯4-對羥基苯甲酸丁酯當溶質分子的極性一定時，若增大流動相的極性（水相比例增大），則降低流動相對溶質分子的洗脫能力，使溶質的分配比增大，保留時間增大；反之亦然。固定相：C1固定相：C8固定相：C181-尿嘧啶2-苯酚3-乙酰苯4-硝基苯5-苯甲酸甲酯6-甲苯反相鍵合色譜中，鍵合相碳鏈越長，分離效果越好。反相色譜分離實例1.2.3鍵合相色譜法流動相要求：（1）純度要高：色譜純→過濾（0.45μm有機膜）→脫氣；

（2）對色譜柱、固定相和分離組分要有惰性；

（3）對樣品要有適宜的溶解度；

（4）與檢測器要相匹配：紫外檢測器：要求流動相在紫外區吸收很弱；

示差折光檢測器：要求流動相與樣品組分的折光率相差較大。常用溶劑極性順序：水>乙腈>甲醇>乙醇>丙醇>四氫呋喃>二氯甲烷實際上采用適當比例的二元混合溶劑可適應不同類型的樣品分析，有時采用三元甚至四元混合溶劑以獲得最佳分離。實際使用中，采用甲醇-水體系已能滿足多數樣品的分離要求。1.2.4離子色譜法離子色譜法是利用不同待測離子對固定相上的交換基團親和力差別而實現分離。定義1.2.4離子色譜法分離原理抑制型（雙柱型）交換反應：R+-OH-+NaX→R+-X-+NaOH洗脫反應：R+-X-+NaOH→R+-OH-+NaX與組分反應：R-H++NaX→R-Na++HX與洗脫劑反應：R-H++NaOH→R-Na++H2O加了抑制柱后，進入檢測器的本底是電導率很低的水，因此很容易檢測出具有較大電導率的HX。分離柱抑制柱1.2.4離子色譜法分離原理非抑制型（單柱型）使用更低交換容量的固定相，常使用濃度很低、電導率很低的流動相，如0.1-1.0mmol/L的苯甲酸、鄰苯二甲酸或它們的鹽溶液。由于本底電導較低,試樣離子被洗脫后可直接被電導檢測器所檢測。1.2.4離子色譜法固定相實際上是離子交換劑，離子交換基團+基質上。基質：合成樹脂（聚苯乙烯）、纖維素和硅膠。類型：陽離子和陰離子交換劑。前者用于分離堿性化合物，后者用于酸性化合物。類型符號官能團強陽離子交換劑SCX—SO3H弱陽離子交換劑WCX—COOH強陰離子交換劑SAX—N+R3弱陰離子交換劑WAX—NH21.2.4離子色譜法流動相大都采用水緩沖溶液，有時用有機溶劑+水緩沖溶液。增加流動相中鹽的濃度，可以降低待測離子的競爭親和力，使其在固定相上的保留時間減少，先出色譜柱；反之，則保留時間增大，后出色譜柱。pH增大，酸的離解度增大，保留時間增加，后出柱；有機堿的離解度降低，保留時間減小，先出柱。緩沖溶液中緩沖劑濃度增大，保留時間會減小。1.2.5凝膠色譜法凝膠色譜法又稱分子排阻色譜法，它是以多孔凝膠為固定相，利用流動相中各組分的相對分子質量不同（分子尺寸大小）而使各組分分離。分離原理小分子量的化合物可以進入孔中，滯留時間長；大分子量的化合物不能進入孔中，直接隨流動相流出。常用于分離高分子化合物，如組織提取物、多肽、蛋白質、核酸等。1.2.5凝膠色譜法分離過程1-分子大小不同的混合物上柱；2-洗脫開始，小分子擴散進人凝膠顆粒內，大分子被排阻于顆粒之外；3-大小分子分開；4-大分子行程較短，已洗脫出層析柱，小分子尚在進行中。1.2