第二章酶工程教學重點、難點、學時一、概述(一）酶的定義（二）分類及命名（三）酶工程的研究內容（四）催化特性二、酶作用原理三、酶的生產及分離純化四、酶分子修飾五、酶的固定化六、酶反應器七、酶的應用及發展展望1、要點酶的定義、酶工程的研究內容、酶的催化特性、酶的作用原理、分離純化、化學修飾、固定化、在環境污染治理中的應用及展望2、重點作用原理、分離純化、固定化3、學時7學時教學要點、重點、學時（一）酶的定義生物體內產生的具有催化功能的特殊蛋白質和RNA。（二）分類及命名1、分類：氧化還原酶、轉移酶、水解酶、裂解酶、異構酶、連接酶或合成酶2、命名：(1)習慣命名法:

根據其催化底物來命名；根據所催化反應的性質來命名；結合上述兩個原則來命名；有時在這些命名基礎上加上酶的來源或其它特點。一、概述(2)國際系統命名法國際酶學－－四位數字編號系統第一位：表大類；第二位：表亞類；第三位：表亞亞類；第四位：表在亞亞類的序號系統名稱包括底物名稱、構型、反應性質，最后加一個酶字。例如：習慣名稱:谷丙轉氨酶系統名稱:丙氨酸：

-酮戊二酸氨基轉移酶酶催化的反應:

谷氨酸+丙酮酸

-酮戊二酸+丙氨酸一、概述（三）酶工程的研究內容酶工程：是利用酶的催化作用進行物質轉化的技術，是將酶學理論與化工技術結合而形成的新技術。其主要任務是：通過預先設計，經過人工操作控制而獲得大量所需的酶，并通過各種方法使酶發揮出最大的催化功能；目的是為我們提供產品或以特定的功能為我們服務。1、生產2、分離純化3、酶分子修飾4、酶的固定化5、酶反應動力學6、酶反應器7、酶的應用一、概述（四）酶的催化特性

1、催化效率高2、專一性強

3、催化條件溫和

4、酶活性可調

5、對環境條件敏感一、概述（一）酶是生物催化劑活化能（J/mol)：在一定溫度下一摩爾底物全部進入活化狀態所需要的自由能。酶能大大降低活化能，增加活化分子。（二）酶催化反應動力學中間產物學說二、酶作用原理在酶催化的反應中，第一步是酶與底物形成酶－底物中間復合物。當底物分子在酶作用下發生化學變化后，中間復合物再分解成產物和酶。

E+S====E-S

P+E

許多實驗事實證明了E－S復合物的存在。E－S復合物形成的速率與酶和底物的性質有關。二、酶作用原理二、酶作用原理酶與底物結合形成中間絡合物的方式（理論）(1)鎖鑰假說(lockandkeyhypothesis)：認為整個酶分子的天然構象是具有剛性結構的，酶表面具有特定的形狀。酶與底物的結合如同一把鑰匙對一把鎖一樣(2)誘導契合假說（induced–fithypothesis):

該學說認為酶表面并沒有一種與底物互補的固定形狀，而只是由于底物的誘導才形成了互補形狀.1、米－門方程的提出（底物濃度對酶促反應速度的影響）二、酶作用原理二、酶作用原理米氏方程1913年，德國化學家Michaelis和Menten根據中間產物學說對酶促反映的動力學進行研究，推導出了表示整個反應中底物濃度和反應速度關系的著名公式，稱為米氏方程。Km—米氏常數Vmax

—最大反應速度米氏方程的推導：二、酶作用原理假設：1）忽略ｐ的逆反應，也即在初速度期間；2）底物濃度遠遠大于酶的濃度；3）反應處于穩態，即中間產物生成和分解的速度相等。2、關于米－門方程的討論1）酶初速度和底物濃度的關系為一雙曲線；2）[E]<<[S]<<Km時，可用[So]表示[S]；3)當V=Vmax,V與[S]無關，與[Eo]成正比；4）k3<<k2時，Km=Ks,可表示酶與底物結合緊密程度；5）k3－－酶的每個活性部位在單位時間內，催化底物起反應的分子數，又叫轉換系數，簡稱T.N.。二、酶作用原理3、Km與Vmax的意義1）米氏常數是酶反應處于動態平衡，即穩態時的平衡常數。是V=1/2Vmax時的底物濃度，故又稱半速度常數。（1）Km值是酶的特征常數之一，只與酶性質有關，而與酶濃度無關。不同的酶，Km值不同。（2）如果一個酶有幾種底物，則對每一種底物，各有一個特定的Km值。（3）同一種酶的幾種底物中，Km值最小的底物一般稱為該酶的最適底物或天然底物。2）最大酶反應速率rp,max=k3CEｔ。它表示了當全部的酶都成復合物狀態時的反應速率。二、酶作用原理

二、酶作用原理

4、Km與Vmax的測定測定Km和V的方法很多，最常用的是Lineweaver–Burk的作圖法—

雙倒數作圖法。

1Km11

=

+

V

Vmax[S]Vmax取米氏方程式的倒數形式：1/Vmax斜率=Km/Vmax-1/Km二、酶作用原理（二）酶促反應的影響因素

1、pH；

2、溫度；

3、酶濃度；

4、抑制劑的影響不可逆抑制與可逆抑制的區分

1）競爭性抑制；2）非競爭性抑制作用

3）反競爭抑制；4）底物抑制

5、底物的濃度二、酶作用原理（一）酶的生產

1.對酶源的要求

2.微生物作為酶的優勢

3.對酶生產菌的要求（二）酶的分離純化

1.酶提取

2.酶分離純化的沉淀技術

3.酶分離純化的層析技術

4.酶分離純化的電泳技術三、酶的生產及分離純化（一）酶的生產1.對酶源的要求

1）酶含量豐富

2）提取、純化方便三、酶的生產及分離純化2.微生物作為酶的優勢

1）易得到所需的酶類

2）易獲得高產菌株

3）生產成本低

4）微生物生長周期短

5）生產易管理

6）提高微生物產酶能力的途徑較多

7）可提高酶產量或改造酶（一）酶的生產三、酶的生產及分離純化3.對酶生產菌的要求

1）不是致病菌，也不產毒素

2）不易變異退化，不易感染噬菌體

3）產酶量高，而且最好產生胞外酶

4）原料廉價，周期短，易培養三、酶的生產及分離純化（一）酶的生產（二）酶的分離純化酶的分離提純可分為四個要點：酶源選材勻漿方法分離步驟結晶方法酶的分離提純涉及的理論與技術：酶主要是蛋白質酶具有催化功能三、酶的生產及分離純化酶分離提純步驟如下：三、酶的生產及分離純化半勻漿選材提取液粗酶制品精制細胞器純酶酶結晶抽取或分散親和分離法少量酶分離方法結晶法1.酶提取定義：是將酶從生物組織或細胞中以溶解狀態釋放出來的過程，以供進一步從中分離純化出所需的酶。1）組織及細胞的破碎（1）物理法（包括機械法）（2）化學法（3）酶解法

2）酶的提取原理———相似相溶常用方法：（1）酸、堿、鹽溶液提?。?）有機溶液提取三、酶的生產及分離純化2．酶分離純化的沉淀技術1）鹽析———溶解度的差異鹽溶－低濃度的中性鹽可增加電解質類物質的溶解度；鹽析－當鹽濃度繼續增加時，蛋白質的溶解度反而降低而析出。（1）基本原理

a.減弱了蛋白質的水合程度b.中和了蛋白質電荷，使靜電荷減少蛋白質的溶解度與溶液中的離子強度遵守Cohn方程：

三、酶的生產及分離純化（2）影響因素

a.蛋白質的濃度b.介質的pHc.溫度d.鹽類型三、酶的生產及分離純化2．酶分離純化的沉淀技術2．酶分離純化的沉淀技術2）PEG沉淀法———溶解度的差異（1）基本原理空間排阻學說：PEG分子在溶液中形成網狀結構，與溶液中的蛋白質分子發生空間排擠作用，從而使蛋白質分子凝聚而沉淀下來。

PEG沉淀蛋白質的過程遵循下列方程：三、酶的生產及分離純化（2）影響因素a.蛋白質的分子質量——大，沉降好b.蛋白質濃度c.pH值d.離子強度e.溫度f.PEG聚合度三、酶的生產及分離純化2．酶分離純化的沉淀技術3)有機溶劑沉淀法——溶解度的差異（1）基本原理

a.介質的介電常數下降，增強靜電作用力b.降低水合程度（2）常用方式

a.分級沉淀有用的蛋白質b.雜蛋白質變性（3）缺點——易使酶變性，低溫操作三、酶的生產及分離純化2．酶分離純化的沉淀技術4）等電點沉淀法——溶解度的差異蛋白質在等電點（ｐI）處，凈電荷為0，易于沉淀。5）熱變性沉淀法——熱穩定性的差異

可用其他輔助因子、底物等方法，使目的酶的熱變性溫度提高。三、酶的生產及分離純化2．酶分離純化的沉淀技術3.酶分離純化的層析技術層析分離——是利用混合物中各組分的物理化學性質｛分子的大小和形狀、分子極性、吸附力、分子親和力和分配系數｝的不同，使各組分的分布程度不同而達到分離。三、酶的生產及分離純化1）凝膠過濾層析——分子大小和形狀的差異（1）基本原理如圖2－32所示，酶液中各組分按相對分子質量從大到小的順序先后流出層析柱，從而實現分離純化。（2）優點條件溫和，操作簡便，分離范圍廣，回收率高，層析柱可反復使用，無需再生處理,可分段分離。（3）常用的凝膠交聯葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠3.酶分離純化的層析技術三、酶的生產及分離純化2）離子交換層析——電荷性質的差異它利用離子交換劑上可解離基團對各種離子的親和力不同而進行分離。（1）基本原理蛋白質是兩性電解質，不同蛋白質由于其pI不同，在同一種pH值介質中電離狀況不同，分子所帶電荷種類和數量就不同，與離子交換劑的靜電吸附能力也不同。通過吸附和改變離子強度或pH值解吸洗脫，可使蛋白質依據其靜電吸附能力由弱到強的順序而分離開來。三、酶的生產及分離純化3.酶分離純化的層析技術（2）洗脫方法

a.梯度洗脫

b.階段洗脫3.酶分離純化的層析技術三、酶的生產及分離純化3.酶分離純化的層析技術3）親和層析——親和力的差異（1）基本原理利用配基與酶結合能力而將目的酶分離出來。三、酶的生產及分離純化（2）載體a.應具有均一、堅實、多孔的網狀結構b.親水c.具有可活化和改變的化學基團d.具有良好的化學穩定性交聯瓊脂糖凝膠三、酶的生產及分離純化3.酶分離純化的層析技術(3)配基a.配基與酶的親和力b.配基與載體的結合方式引入手臂可避免配基在載體上密度太大而造成的空間障礙。W-氨烷基化合物三、酶的生產及分離純化3.酶分離純化的層析技術4）高效液相色譜（1）基本原理用檢測器檢出，由收集器收集同一色譜的目的酶。HPLC的優點：分辨率高；快速，整個分離過程僅幾十分鐘；靈敏度高；一根術可分析多個樣品，而無需重新填裝柱。三、酶的生產及分離純化3.酶分離純化的層析技術4.酶分離純化的電泳技術三、酶的生產及分離純化電泳—帶電物質在直流電場作用下，向著與其電荷相反的電極移動的現象。區帶電泳——樣品溶液在一惰性支持物上進行電泳的過程。電泳后，不同的蛋白質組成被分離形成帶狀區間。區帶的位置可用專一蛋白質染料染色顯示，有些也可利用伴有顏色變化的酶催化反應來顯示。1）聚丙烯酰胺凝膠電泳（1）基本原理

a.蛋白質的靜電荷b.蛋白質的分子大?。?）分類三、酶的生產及分離純化4.酶分離純化的電泳技術a連續凝膠電泳b不連續凝膠電泳c濃度梯度凝膠電泳dSDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳a.連續凝膠電泳采用相同濃度的單體和交聯劑，用相同pH值和相同濃度的緩沖溶液制備成連續均勻的凝膠，然后在同一條件下進行電泳。按分子大小和凈電荷的不同而具有不同的遷移率，從而彼此分開。三、酶的生產及分離純化4.酶分離純化的電泳技術b.不連續凝膠電泳是指凝膠孔徑大小、緩沖液成分及pH均為不連續的，并在電場中形成不連續的電位梯度，從而使樣品濃縮成一個極窄的起始區帶?？商岣叻直媛实娜齻€物理效應：濃縮效應；分子篩效應；電荷效應組成：由上至下分別為：樣品凝膠；濃縮凝膠；分離凝膠三、酶的生產及分離純化4.酶分離純化的電泳技術c.濃度梯度凝膠電泳聚丙烯酰胺濃度由上至下形成由低到高的連續梯度，其內部孔徑也逐漸減小。適用于測定蛋白質的分子質量三、酶的生產及分離純化4.酶分離純化的電泳技術d.SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE）

加入1%~2%的SDS制備而成。

SDS－PAGE主要用于測定蛋白質的分子質量?；驹恚?/p>

SDS－蛋白質復合物中SDS含有大量陰離子，從而掩蓋了蛋白質之間原來的電荷的差異；而且蛋白質構象發生改變變成橢圓形，短軸為18埃左右，長軸與蛋白質分子質量成正比－－－SDS－蛋白質復合物的遷移率不再受其原在電荷和分子形狀的影響，而只決定于蛋白質的分子質量。三、酶的生產及分離純化4.酶分離純化的電泳技術2）等電聚焦（1）基本原理帶有電荷的蛋白質分子可在電場中泳動，其電泳遷移率隨其所帶電荷不同而彼此不同。等電聚焦是在電解槽中放入載體兩性電解質，當通以直流電時，便形成一個由陽極到陰極逐步增加的ｐH梯度，而蛋白質則移動并聚焦于pI處。三、酶的生產及分離純化4.酶分離純化的電泳技術（2）目的a.分離純化酶b.測定pI（3）載體兩性電解質

——是具在ｐH梯度的物質，是由多種氨基與羧基比例不同的多氨基多羧酸的混合物構成的。三、酶的生產及分離純化4.酶分離純化的電泳技術理想載體兩性電解質具有的條件：a.在pI處必須有足夠的緩沖能力，以使pH梯度穩定；b.在pI處必須有足夠的電導；c.分子質量要小；d.化學組成應不同于被分離物質；e.應不與被分離物質發生反應或使之變性。三、酶的生產及分離純化4.酶分離純化的電泳技術（一）問題的提出

1、定義

2、修飾目的

3、修飾方法

4、現在進行的工作（二）酶分子的化學修飾（三）生物酶工程四、酶分子修飾（一）問題的提出1、定義

———通過各種方法使酶分子結構發生某些改變，從而改變酶的某些特性和功能的過程。利用的是“結構決定功能”。2、修飾目的

1）提高酶活力；2）增強穩定性；

3）環境可改變；4）改變最適pH或T；

5）改變酶的特異性；6）改變催化類型；

7）提高反應效率。四、酶分子修飾3.修飾方法

1）金屬離子置換修飾；

2）大分子結合修飾；

3）肽鏈有限水解修飾；

4）酶蛋白側鏈基團修飾；

5）氨基酸置換修飾；

6）物理修飾。四、酶分子修飾（一）問題的提出4.現在進行的工作

1）設法使酶的活性結構加固；

2）通過化學修飾或酶法修飾改變酶的活性；

3）設法消除免疫性或抗原性以利于醫療應用。四、酶分子修飾（一）問題的提出1.定義化學修飾——通過化學手段將某些化學物質或基團結合到酶分子上，以改變酶的物理化學性質，達到改變酶的催化性質的目的?！侵竿ㄟ^主鏈的剪接切割和側鏈的化學修飾對酶分子進行改造，其目的在于改變酶的一些性質，創造出天然酶不具備的某些優良性狀，擴大酶的應用以達到較高的經濟效益。它主要是利用修飾劑所具有的各類化學基團的特性，直接或經一定活化步驟與酶分子的某種氨基酸殘基產生化學反應，從而改造酶的結構和功能。四、酶分子修飾（二）酶分子的化學修飾2.修飾常用的方法1）部分水解酶的非活性主鏈；2）對活性部位或非活性部位以外的側鏈基團進行共價修飾；3）輔酶因子的置換。3.常用的修飾劑1）?；噭?）烷化劑；3）形成酯和酰胺的試劑；4）氧化還原試劑；5）親電子試劑四、酶分子修飾（二）酶分子的化學修飾4.修飾時的注意事項1）對修飾劑的要求——分子質量大、生物相容性和水溶性好、反應基團多、半衰期長；2）對酶性質的了解——活性部位、最適條件、側鏈基團的化學性質以及反應活性；3）反應條件的選擇——酶穩定的條件5.修飾后酶催化活性的改變如表2－13四、酶分子修飾（二）酶分子的化學修飾1.性質

——分子水平上的生物修飾2.概念

重組DNA技術——是在分子水平上，把某種生物的基因轉移到另一種生物細胞之中，并在新細胞中擴增和表達。生物酶工程——又稱高級酶工程，它是酶學和以基因重組技術為主的現代分子生物學技術相結合的產物。它是最理想的酶改造方法。四、酶分子修飾（三）生物酶工程3.生物酶工程的主要內容（如圖2－48）1）克隆酶；2）突變酶；3）新酶。4、生物酶工程的發展分支——酶的蛋白質工程1）定義——是通過結構基因的改造達到修飾蛋白質分子結構，從而改變該蛋白質的性能甚至創造出自然界中尚未發現的新蛋白質的目的。2）與基因工程的區別和聯系聯系——蛋白質工程在基因工程上發展起來的；區別——基因工程：解決的是酶大量生產的問題；蛋白質工程：完全符合要求的酶四、酶分子修飾（三）生物酶工程（一）概述1.Idea的提出2.基本概念（二）固定化方法1.吸附法；2.包埋法；3.結合法；（三）固定化法對酶的影響五、固定化（一）概述1.Idea的提出1）酶的穩定性差；2）難回收；3）難分離純化（產物與酶）。2.基本概念

酶的固定化——將酶與水不溶性的載體結合，制備固定化酶的過程。

固定化酶——固定在載體上并在一定的空間范圍內進行催化反應的酶。固定化酶的原料——純酶、結合在死細胞或細胞碎片的酶或酶系（固定化菌體）五、固定化1.吸附法

——利用各種固體吸附劑將酶或含酶菌體吸附在其表面上而使酶固定化的方法

常用吸附劑——活性炭、氧化鋁、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅膠、羥基磷灰石。特點——操作簡單、條件溫和、不會使酶失活；結合力弱、易脫落。五、固定化（二）固定化方法吸附法包埋法結合法分類2、包埋法——將酶或含酶菌體包埋在各種多孔載體中，使酶固定。載體——瓊脂、瓊脂糖、海藻酸鈉等。五、固定化（二）固定化方法凝膠包埋法半透膜包埋法分類根據載體材料和方法1）凝膠包埋法

——將酶或含酶菌體包埋在各種凝膠內部的微孔中，制成一定形狀的固定化酶或固定化菌體，大多數為球狀或片狀。常用凝膠——天然凝膠（瓊脂凝膠、角叉菜膠、明膠等）和合成凝膠（聚丙烯酰膠凝膠、光交聯樹脂）2）半透膜包埋法——是指將酶包埋在由各種高分子聚合物制成的小球內，制成固定化酶。常用半透膜——聚酰胺膜、火棉膠膜等。微膠囊——半透膜包埋法制成的固定化酶小球，直徑一般只有幾微米至幾百微米。特點——僅適用于底物和產物為小分子物質的酶的固定化。（二）固定化方法五、固定化3.結合法——選擇適宜的載體，使之與通過共價鍵和離子鍵與酶結合在一起的固定化方法。分類（結合鍵不同）：離子鍵結合法、共價鍵結合法1）離子鍵結合——通過離子鍵使酶與載體結合的固定化方法。載體——不溶于水的離子交換劑特點——制備操作簡單，活力損失較少，但使用時一定要嚴格控制好pH值、離子強度和溫度。五、固定化（二）固定化方法2）共價鍵結合——通過共價鍵使酶與載體結合的固定化方法載體——纖維素、瓊脂糖凝膠、葡聚糖凝膠、甲殼質、氨基酸共聚物、甲基丙烯醇共聚物。載體活化——借助于某種方法，在載體上引進某一活潑基團。其方法有：重氮法、疊氮法、溴化氰法、烷化法等。能形成共價鍵的基團（酶分子）——氨基、羧基、巰基、酚基和咪唑基等。（二）固定化方法五、固定化各種固定化方法的比較：見表2－14固定化的注意事項：固定化前——對酶性質的了解、方法的選擇、條件的控制。固定化后——測定酶的活力、研究反應最適條件、考察酶穩定性五、固定化（二）固定化方法1）酶活力回收率變化

——是指固定化酶所保留下來的酶的活力與游離酶在固定化之前的酶活力之比。多數下降2）底物專一性變化——對分子質量大的活性下降3）反應的最適pH值變化——不同程度