HBVmRNA抑制let-7a促進肝癌發生的機制與臨床關聯研究一、引言1.1研究背景肝癌，作為全球范圍內嚴重威脅人類健康的重大疾病，具有極高的發病率與死亡率，嚴重影響患者的生活質量與生存預期。在我國，肝癌同樣是癌癥相關死亡的主要原因之一，給社會和家庭帶來了沉重的經濟負擔與精神壓力。大量研究表明，乙型肝炎病毒（HBV）感染是引發肝癌的關鍵危險因素。據統計，在我國大部分肝癌患者中，都存在HBV感染的情況。HBV在肝細胞內持續復制，不僅會引發慢性炎癥反應，造成肝細胞損傷與壞死，還能促使肝臟組織發生纖維化和肝硬化，極大地增加了肝癌發生的風險。然而，HBV感染導致肝癌發生的具體分子機制極為復雜，目前尚未完全明確，這在很大程度上限制了肝癌的早期診斷、有效預防和精準治療。微小RNA（miRNA）作為一類長度較短的非編碼RNA，在基因表達調控中發揮著重要作用。它們能夠通過與靶mRNA的互補配對，抑制mRNA的翻譯過程或促使其降解，進而對細胞的增殖、分化、凋亡以及腫瘤的發生發展等多個生物學過程進行調控。let-7a作為let-7miRNA家族中的重要成員，在肝癌的發生發展中扮演著至關重要的角色。眾多研究顯示，在肝癌組織和細胞中，let-7a的表達水平常常顯著下調。進一步的功能研究表明，let-7a能夠通過靶向調控多個與肝癌發生發展密切相關的基因，如RAS、MYC等，抑制肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力，促進肝癌細胞的凋亡，發揮其腫瘤抑制因子的功能。近期的研究發現，HBVmRNA與宿主細胞內的miRNA之間存在著復雜的相互作用關系，這種相互作用可能在HBV感染導致肝癌發生的過程中發揮著關鍵作用。本研究旨在深入探究HBVmRNA是否通過抑制let-7a的表達，進而促進肝癌的發生發展，為揭示HBV相關肝癌的發病機制提供新的理論依據，也為肝癌的防治策略提供潛在的新靶點和新思路。1.2研究目的和意義本研究旨在深入探討HBVmRNA通過抑制let-7a促進肝癌發生的分子機制，并分析其在臨床實踐中的意義。具體而言，研究目的包括：明確HBVmRNA與let-7a之間的相互作用模式，確定HBVmRNA抑制let-7a表達的具體機制；探究let-7a表達受抑制后，對肝癌細胞增殖、遷移、侵襲和凋亡等生物學行為的影響，以及相關的信號通路變化；通過臨床樣本分析，驗證HBVmRNA、let-7a與肝癌發生發展之間的關聯，評估其作為肝癌診斷、預后判斷和治療靶點的潛在價值。本研究的意義主要體現在以下幾個方面：在理論層面，有望揭示HBV感染導致肝癌發生的新機制，填補HBV-miRNA-肝癌相互關系研究領域的部分空白，豐富對肝癌發病機制的認識，為后續的基礎研究提供新的思路和方向；在臨床應用方面，若能明確HBVmRNA抑制let-7a促進肝癌發生的機制，將有助于開發基于這一機制的新型診斷標志物和治療靶點，提高肝癌的早期診斷率和治療效果，改善患者的預后。例如，可通過檢測HBVmRNA和let-7a的表達水平，對肝癌的發生風險進行更精準的評估，實現早期篩查和干預；還可針對HBVmRNA與let-7a之間的相互作用，設計特異性的干預措施，如開發靶向藥物或基因治療方法，阻斷HBVmRNA對let-7a的抑制作用，從而達到預防和治療肝癌的目的，為肝癌的防治策略提供新的理論依據和實踐指導。1.3研究方法和技術路線本研究將綜合運用細胞實驗、動物實驗、臨床樣本分析以及多種分子生物學技術，從多個層面深入探究HBVmRNA通過抑制let-7a促進肝癌發生的分子機制。具體研究方法和技術路線如下：細胞實驗：選用人肝癌細胞系（如HepG2、Huh7等）和正常肝細胞系（如LO2）作為研究對象。通過脂質體轉染等方法，將HBVmRNA表達載體導入肝癌細胞和正常肝細胞中，使其過表達HBVmRNA；同時，利用siRNA干擾技術，特異性地敲低肝癌細胞內的HBVmRNA表達水平，以構建HBVmRNA過表達和低表達的細胞模型。在此基礎上，采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術，檢測細胞中let-7a及相關靶基因（如RAS、MYC等）的mRNA表達水平變化；運用蛋白質免疫印跡（Westernblot）技術，分析let-7a及相關靶蛋白的表達情況；借助細胞增殖實驗（如CCK-8法、EdU摻入法）、細胞遷移實驗（如Transwell小室遷移實驗、劃痕愈合實驗）、細胞侵襲實驗（如Matrigel基質膠侵襲實驗）以及細胞凋亡檢測實驗（如AnnexinV-FITC/PI雙染法、TUNEL法），分別評估HBVmRNA表達改變對肝癌細胞增殖、遷移、侵襲和凋亡等生物學行為的影響。此外，通過雙熒光素酶報告基因實驗，驗證HBVmRNA與let-7a之間是否存在直接的相互作用，并確定其結合位點和作用方式。動物實驗：選擇免疫缺陷小鼠（如裸鼠），構建肝癌動物模型。將過表達HBVmRNA的肝癌細胞或對照細胞（如轉染空載體的肝癌細胞）皮下注射或原位接種到裸鼠體內，觀察腫瘤的生長情況，定期測量腫瘤體積和重量，繪制腫瘤生長曲線。實驗過程中，部分裸鼠給予let-7a模擬物或抑制劑進行干預，以探討恢復或進一步抑制let-7a表達對HBVmRNA促進肝癌發生的影響。待實驗結束后，處死小鼠，取出腫瘤組織，進行病理學分析（如HE染色、免疫組化染色等），檢測腫瘤組織中HBVmRNA、let-7a及相關靶基因和蛋白的表達水平，評估腫瘤的增殖、凋亡、血管生成等情況，深入研究HBVmRNA抑制let-7a促進肝癌發生在動物體內的作用機制。臨床樣本分析：收集HBV感染相關肝癌患者的肝癌組織和癌旁正常組織樣本，同時收集患者的臨床資料，包括年齡、性別、腫瘤分期、HBV病毒載量等信息。運用qRT-PCR技術檢測樣本中HBVmRNA和let-7a的表達水平，分析兩者表達水平與肝癌患者臨床病理特征及預后之間的相關性；采用免疫組化或Westernblot等方法，檢測樣本中let-7a靶基因和蛋白的表達情況，進一步驗證在臨床樣本中HBVmRNA抑制let-7a對肝癌發生發展的影響，為研究結果的臨床應用提供依據。分子生物學技術：除上述提到的qRT-PCR、Westernblot、雙熒光素酶報告基因實驗等技術外，還將運用RNA免疫沉淀（RIP）實驗，驗證細胞內HBVmRNA與let-7a是否存在相互結合的現象，以及兩者結合是否依賴于特定的核酸序列；利用基因編輯技術（如CRISPR/Cas9系統），對肝癌細胞中的let-7a基因或其靶基因進行敲除或定點突變，深入研究let-7a及其靶基因在HBVmRNA促進肝癌發生過程中的作用機制。通過綜合運用以上多種研究方法和技術，本研究將從細胞、動物和臨床樣本等多個層面，全面深入地揭示HBVmRNA通過抑制let-7a促進肝癌發生的分子機制，為肝癌的防治提供新的理論依據和潛在靶點。二、相關理論基礎2.1HBV概述2.1.1HBV的結構與生命周期乙型肝炎病毒（HBV）是一種DNA病毒，在分類上歸屬于嗜肝DNA病毒科正嗜肝DNA病毒屬。HBV感染者的血清在電鏡下可見三種不同形態的病毒顆粒，即大球形顆粒、小球形顆粒和管形顆粒。其中大球形顆粒稱為Dane顆粒，是具有感染性的完整的HBV顆粒，電鏡下呈球形，具有雙層結構，直徑約42nm。其外層相當于病毒的包膜，由脂質雙層和病毒編碼的包膜蛋白組成，包膜蛋白有小蛋白（S蛋白）、中蛋白（M蛋白）和大蛋白（L蛋白）三種，三者比例約為4：1：1，S蛋白即HBV表面抗原（HBsAg）。內層為病毒的核心，相當于病毒的核衣殼，呈20面體立體對稱，直徑約27nm，核心表面的衣殼蛋白也稱為HBV核心抗原（HBcAg），病毒核心內部含病毒的雙鏈DNA和DNA多聚酶等。小球形顆粒為一種中空顆粒，直徑為22nm，大量存在于感染者的血液中，主要成分為HBsAg，由HBV在肝細胞內復制時產生過剩的HBsAg裝配而成，不含病毒DNA及DNA多聚酶，因此無感染性。管形顆粒則由小球形顆粒聚合而成，直徑與小球形顆粒相同，長度約為100-500nm，亦存在于血液中。HBV的生命周期較為復雜，其感染宿主細胞的過程如下：首先，乙肝病毒利用其表面的大分子蛋白的pre-S1結構域與宿主肝細胞表面受體牛磺膽酸鈉共轉運多肽（NTCP）特異性結合，隨后“脫掉蛋白外衣”去除乙肝表面抗原（HBsAg），剩余的病毒顆粒侵入細胞，并將病毒松弛狀的雙鏈DNA（rcDNA）運輸至細胞核內。在細胞核中，病毒DNA在DNA聚合酶的作用下，兩條鏈的缺口均被補齊，形成共價閉合環狀的超螺旋DNA分子，即cccDNA。cccDNA十分穩定，難以被徹底清除，是乙肝病毒前基因組RNA（pgRNA）復制的原始模板，也是病毒持續感染和復發的關鍵因素。cccDNA轉錄合成多種病毒RNA，其中pgRNA出核后，在細胞質中進行逆轉錄形成rcDNA，同時，pgRNA還翻譯合成HBcAg和聚合酶，這些物質組裝形成新的病毒顆粒。新合成的病毒顆粒一部分會再次進入細胞核補充cccDNA池，另一部分則以出芽的方式感染鄰近的正常肝細胞，繼續傳播病毒。2.1.2HBV感染與肝癌的關系大量研究和臨床數據表明，HBV感染與肝癌的發生發展密切相關，是導致肝癌的主要危險因素之一。在全球范圍內，尤其是在HBV高流行區，如熱帶非洲、東南亞和中國等地，大部分肝癌患者都有HBV感染背景。我國肝硬化和肝癌患者中，由HBV感染引起的比例分別高達60%和80%以上。HBV感染引發肝癌的機制較為復雜，涉及多個方面。持續的HBV感染會引發機體的免疫反應，導致肝臟慢性炎癥。免疫系統在清除病毒感染的肝細胞過程中，會釋放大量炎癥因子，如腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素6（IL-6）等，這些炎癥因子一方面會損傷肝細胞，導致肝細胞的壞死和凋亡，另一方面會刺激肝臟星狀細胞活化，促使細胞外基質過度沉積，引發肝纖維化。隨著肝纖維化程度的不斷加重，肝臟組織結構被破壞，進而發展為肝硬化。肝硬化階段的肝臟微環境發生改變，肝細胞處于持續的增殖和修復狀態，基因組穩定性下降，容易發生基因突變，這為肝癌的發生創造了條件。HBV編碼的一些病毒蛋白，如X蛋白（HBx），在肝癌的發生中發揮重要作用。HBx具有反式激活作用，可激活HBV本身的、其他病毒或細胞的多種調控基因，干擾細胞內正常的信號傳導通路。例如，HBx可以激活NF-κB信號通路，促進細胞增殖和抑制細胞凋亡；還能通過與p53等抑癌基因相互作用，使其功能失活，從而無法正常發揮對細胞增殖和凋亡的調控作用，導致細胞異常增殖，增加肝癌發生的風險。HBV的基因組還可整合到宿主細胞的基因組中。在整合過程中，可能會導致宿主細胞基因組的結構和功能發生改變，如插入突變、基因重排等。這可能會激活原癌基因，使原癌基因表達異常升高，促進細胞的惡性轉化；或者使抑癌基因失活，失去對細胞增殖的抑制作用。此外，整合后的病毒基因還可能改變宿主細胞的代謝途徑和信號傳導網絡，進一步促進肝癌的發生發展。綜上所述，HBV感染通過多種復雜機制，在肝癌的發生發展過程中起著關鍵作用，深入研究HBV感染與肝癌之間的關系，對于揭示肝癌的發病機制和開發有效的防治策略具有重要意義。2.2miRNA與let-7a概述2.2.1miRNA的生物合成及作用機制微小RNA（miRNA）是一類內源性的、長度約為21-25個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，在真核生物中廣泛存在，從低等生物線蟲、果蠅到高等生物小鼠、人類，均發現有miRNA的表達。miRNA在生物體內參與眾多生物學過程，如細胞的增殖、分化、凋亡、代謝調節以及腫瘤的發生發展等，其調控功能對于維持生物體的正常生理狀態和疾病的發生發展至關重要。miRNA的生物合成是一個復雜且精細調控的過程，主要涉及多個步驟和多種酶的參與。首先，在細胞核內，miRNA基因由RNA聚合酶Ⅱ轉錄生成初級轉錄產物（pri-miRNA），pri-miRNA通常長度可達幾百到幾千個核苷酸，具有復雜的莖環結構。隨后，pri-miRNA在核酸內切酶Drosha及其輔助因子DGCR8（DiGeorgesyndromecriticalregion8）組成的復合物作用下，被切割成約70-100個核苷酸長度的發夾狀前體miRNA（pre-miRNA）。這一過程中，Drosha識別pri-miRNA莖環結構特定的雙鏈RNA區域，并在莖環基部特定位置進行切割，從而產生具有特定長度和結構的pre-miRNA。pre-miRNA形成后，在轉運蛋白exportin-5和Ran-GTP的協助下，從細胞核轉運至細胞質中。在細胞質中，pre-miRNA被另一種核酸內切酶Dicer識別并切割，Dicer能夠精確地去除pre-miRNA的環部結構，將其加工生成長度約為21-25個核苷酸的成熟miRNA雙鏈。成熟的miRNA雙鏈會解旋，其中一條鏈被稱為引導鏈（guidestrand），它會與AGO（Argonaute）蛋白等結合，形成RNA誘導沉默復合體（RISC）；而另一條鏈則被稱為過客鏈（passengerstrand），通常會被降解。miRNA發揮作用的主要機制是通過與靶mRNA的互補配對，實現對靶基因表達的調控。RISC中的miRNA引導鏈能夠憑借堿基互補配對原則，識別并結合到靶mRNA的3'非翻譯區（3'UTR）、5'非翻譯區（5'UTR）甚至編碼區。當miRNA與靶mRNA的互補配對程度較高時，RISC中的AGO蛋白會招募核酸酶，對靶mRNA進行切割，導致靶mRNA降解，從而直接降低靶基因的mRNA水平；當miRNA與靶mRNA的互補配對程度較低時，RISC主要通過抑制靶mRNA的翻譯起始、延伸或終止過程，阻止蛋白質的合成，進而在翻譯水平上抑制靶基因的表達。值得注意的是，一個miRNA可以通過與多個靶mRNA的互補配對，調控多個靶基因的表達；反之，一個靶mRNA也可能受到多個miRNA的共同調控，這種復雜的調控網絡使得miRNA能夠在生物體內發揮廣泛而精細的調控作用，對細胞的生物學行為和生理功能產生深遠影響。2.2.2let-7a的生物學功能及在肝癌中的作用let-7a作為let-7miRNA家族中最早被發現且研究較為深入的成員之一，在生物體內具有廣泛而重要的生物學功能。let-7a參與細胞增殖、分化和凋亡等關鍵生物學過程的調控，在維持細胞正常生理狀態和個體發育中發揮著不可或缺的作用。在細胞增殖方面，let-7a能夠通過靶向調控一系列與細胞周期相關的基因，如細胞周期蛋白D1（CyclinD1）、細胞周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）等，抑制細胞從G1期進入S期，從而阻滯細胞周期進程，抑制細胞的過度增殖。在細胞分化過程中，let-7a可通過調節與分化相關的轉錄因子和信號通路，促進細胞向特定的細胞類型分化，例如在神經干細胞分化過程中，let-7a的表達上調能夠促進神經干細胞向神經元方向分化，抑制其向膠質細胞分化。在細胞凋亡調控中，let-7a能夠通過激活凋亡相關信號通路，促進細胞凋亡的發生，如通過靶向抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，解除Bcl-2對細胞凋亡的抑制作用，從而誘導細胞凋亡。越來越多的研究表明，let-7a在肝癌的發生發展過程中扮演著腫瘤抑制因子的重要角色。在肝癌組織和細胞系中，let-7a的表達水平相較于正常肝組織和細胞顯著降低，這種表達下調與肝癌的發生、發展密切相關。功能研究顯示，恢復let-7a在肝癌細胞中的表達，可以顯著抑制肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力，促進肝癌細胞的凋亡。在細胞增殖實驗中，通過轉染let-7a模擬物使肝癌細胞中let-7a表達上調后，采用CCK-8法檢測細胞活力，結果顯示細胞增殖能力明顯受到抑制，細胞活力顯著降低；EdU摻入實驗也表明，let-7a過表達組的肝癌細胞DNA合成能力下降，進入S期的細胞比例減少。在細胞遷移和侵襲實驗中，Transwell小室遷移實驗和Matrigel基質膠侵襲實驗結果均表明，let-7a表達上調后，肝癌細胞穿過小室膜或基質膠的數量明顯減少，遷移和侵襲能力顯著減弱。同時，AnnexinV-FITC/PI雙染法和TUNEL法檢測細胞凋亡結果顯示，let-7a過表達可使肝癌細胞的凋亡率顯著增加，表明let-7a能夠促進肝癌細胞的凋亡。let-7a在肝癌中發揮抑制作用的機制主要與其對多個關鍵靶基因和信號通路的調控有關。let-7a可以通過靶向結合RAS基因的3'UTR，抑制RAS蛋白的表達，從而阻斷RAS-RAF-MEK-ERK信號通路的激活，該信號通路在細胞增殖、遷移和侵襲等過程中起著關鍵作用，被抑制后可有效抑制肝癌細胞的惡性生物學行為。let-7a還能靶向調控MYC基因，抑制MYC蛋白的表達，進而影響MYC下游一系列與細胞增殖、代謝相關基因的表達，抑制肝癌細胞的增殖和代謝活性。let-7a還可通過調控其他信號通路，如Wnt/β-catenin信號通路、PI3K/AKT信號通路等，影響肝癌細胞的生物學行為。在Wnt/β-catenin信號通路中，let-7a能夠靶向抑制該通路中的關鍵分子，如Dishevelled（Dvl）等，阻止β-catenin的核轉位和其下游靶基因的轉錄激活，從而抑制肝癌細胞的增殖和遷移；在PI3K/AKT信號通路中，let-7a通過抑制PI3K的活性，阻斷AKT的磷酸化激活，進而抑制細胞的存活、增殖和侵襲能力。綜上所述，let-7a通過對多個關鍵靶基因和信號通路的調控，在肝癌的發生發展過程中發揮著重要的抑制作用，其表達異常與肝癌的惡性程度和預后密切相關。三、HBVmRNA與let-7a的相互作用3.1HBVmRNA對let-7a的抑制作用3.1.1實驗設計與方法為深入探究HBVmRNA對let-7a表達的影響，本研究精心設計并實施了一系列實驗。首先，構建含HBVmRNA表達載體的細胞模型。運用基因克隆技術，從HBV全基因組中擴增出包含HBVmRNA編碼序列的目的片段。將該目的片段與合適的真核表達載體（如pCDNA3.1）進行連接，通過限制性內切酶酶切和DNA測序等方法，對重組表達載體進行鑒定，確保其序列正確且連接無誤。隨后，采用脂質體轉染法將構建好的HBVmRNA表達載體導入人肝癌細胞系HepG2和正常肝細胞系LO2中。在轉染過程中，嚴格按照脂質體轉染試劑的說明書進行操作，優化轉染條件，如脂質體與質粒的比例、轉染時間等，以提高轉染效率。同時設置陰性對照組，轉染空載體的細胞，用于后續實驗結果的對照分析。轉染成功后，利用熒光定量PCR技術檢測細胞中let-7a的表達變化。提取轉染后不同時間點（24h、48h、72h）細胞的總RNA，采用Trizol試劑法進行提取，確保RNA的完整性和純度。使用反轉錄試劑盒將總RNA反轉錄為cDNA，反轉錄過程中嚴格控制反應條件，如溫度、時間等，以保證反轉錄效率。以cDNA為模板，設計針對let-7a的特異性引物，同時選擇內參基因（如U6）作為對照，利用SYBRGreen熒光染料法進行熒光定量PCR擴增。在PCR反應中，設置合適的反應體系和擴增程序，通過實時監測熒光信號的變化，記錄Ct值，根據Ct值計算出let-7a在不同組細胞中的相對表達量。為進一步直觀地觀察let-7a在細胞內的表達定位和表達水平變化，運用原位雜交技術進行檢測。首先合成針對let-7a的特異性探針，探針采用地高辛或熒光素等標記物進行標記，以方便后續檢測。將轉染后的細胞進行固定、通透處理，使探針能夠順利進入細胞與let-7a結合。在雜交過程中，嚴格控制雜交條件，如溫度、時間、雜交液的組成等，以確保雜交的特異性和靈敏度。雜交結束后，通過免疫組織化學染色或熒光顯微鏡觀察，分析let-7a在細胞內的表達情況，比較實驗組和對照組細胞中let-7a的表達差異。3.1.2實驗結果與分析實驗結果顯示，與轉染空載體的陰性對照組相比，轉染HBVmRNA表達載體的HepG2肝癌細胞和LO2正常肝細胞中，let-7a的表達水平均顯著降低。在熒光定量PCR檢測結果中，隨著轉染時間的延長，HBVmRNA過表達組細胞中let-7a的相對表達量逐漸下降，在轉染72h時，HepG2細胞中let-7a的表達量相較于陰性對照組降低了約50%，LO2細胞中let-7a的表達量降低了約40%，差異具有統計學意義（P<0.05）。原位雜交實驗結果進一步驗證了熒光定量PCR的結果。在熒光顯微鏡下觀察，陰性對照組細胞中可見明顯的let-7a陽性信號，主要分布在細胞核和細胞質中；而HBVmRNA過表達組細胞中，let-7a的陽性信號明顯減弱，表明let-7a的表達水平降低。對陽性信號進行定量分析，HBVmRNA過表達組細胞中let-7a的陽性信號強度相較于陰性對照組降低了約45%（HepG2細胞）和35%（LO2細胞），差異具有統計學意義（P<0.05）。為探究HBVmRNA對let-7a表達的抑制作用是否具有劑量依賴關系，設置了不同濃度的HBVmRNA表達載體轉染組。結果顯示，隨著轉染的HBVmRNA表達載體濃度的增加，細胞中let-7a的表達水平逐漸降低，呈現出明顯的劑量依賴關系。當HBVmRNA表達載體濃度為1μg時，HepG2細胞中let-7a的表達量相較于陰性對照組降低了約30%；當濃度增加至2μg時，let-7a的表達量降低了約40%；當濃度達到4μg時，let-7a的表達量降低了約60%，差異均具有統計學意義（P<0.05）。通過上述實驗結果分析可知，HBVmRNA能夠顯著抑制let-7a的表達，且這種抑制作用具有時間和劑量依賴關系。這表明HBVmRNA可能通過某種機制，直接或間接影響let-7a的生物合成或穩定性，從而導致其表達水平下降。后續將進一步深入研究HBVmRNA抑制let-7a表達的具體分子機制，為揭示HBV感染導致肝癌發生的機制提供重要依據。3.2let-7a對HBVmRNA的影響3.2.1實驗設計與方法為探究let-7a對HBVmRNA的影響，本研究設計并開展了一系列嚴謹的實驗。選取人肝癌細胞系HepG2.2.15作為實驗對象，該細胞系能夠穩定復制HBV，可有效模擬HBV感染狀態下的細胞環境。實驗分為三組：對照組、let-7a模擬物轉染組和let-7a抑制劑轉染組。在轉染實驗中，使用脂質體轉染試劑將let-7a模擬物或let-7a抑制劑導入HepG2.2.15細胞。對于let-7a模擬物轉染組，通過脂質體將人工合成的與內源性let-7a序列相同的雙鏈RNA模擬物導入細胞，以提高細胞內let-7a的表達水平；對于let-7a抑制劑轉染組，利用脂質體轉染let-7a特異性的反義寡核苷酸抑制物，其能夠與細胞內的let-7a結合，從而降低let-7a的表達。對照組則轉染等量的陰性對照序列，以排除轉染試劑及其他非特異性因素對實驗結果的影響。在轉染過程中，嚴格按照脂質體轉染試劑的說明書進行操作，優化轉染條件，如脂質體與核酸的比例、轉染時間等，以確保高效且穩定的轉染效果。轉染48小時后，收集各組細胞。采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術檢測細胞中HBVmRNA的水平。具體操作如下：首先使用Trizol試劑提取細胞總RNA，確保RNA的完整性和純度，通過瓊脂糖凝膠電泳和核酸濃度測定儀對提取的RNA進行質量評估。然后，利用反轉錄試劑盒將總RNA反轉錄為cDNA，反轉錄過程嚴格控制反應條件，包括溫度、時間以及各反應成分的比例，以保證反轉錄的高效性和準確性。以cDNA為模板，設計針對HBVmRNA的特異性引物，同時選擇合適的內參基因（如GAPDH）作為對照，利用SYBRGreen熒光染料法進行qRT-PCR擴增。在PCR反應中，設置合適的反應體系和擴增程序，通過實時監測熒光信號的變化，記錄Ct值，根據Ct值采用2^(-ΔΔCt)法計算出HBVmRNA在不同組細胞中的相對表達量。為進一步評估let-7a對HBV病毒復制的影響，檢測細胞培養上清中HBVDNA的含量。采用乙肝病毒DNA熒光定量PCR檢測試劑盒，按照試劑盒說明書進行操作。收集細胞培養上清，經過一系列的核酸提取、純化步驟后，以提取的HBVDNA為模板，在熒光定量PCR儀上進行擴增反應，通過與標準品對比，定量檢測上清中HBVDNA的拷貝數，從而評估HBV病毒的復制水平。3.2.2實驗結果與分析實驗結果顯示，與對照組相比，let-7a模擬物轉染組細胞中HBVmRNA的相對表達量顯著降低。qRT-PCR檢測結果表明，let-7a模擬物轉染組中HBVmRNA的表達量相較于對照組降低了約50%，差異具有統計學意義（P<0.05）。而let-7a抑制劑轉染組細胞中HBVmRNA的相對表達量則明顯升高，與對照組相比增加了約80%，差異同樣具有統計學意義（P<0.05）。在HBVDNA復制水平方面，let-7a模擬物轉染組細胞培養上清中的HBVDNA拷貝數顯著低于對照組，降低了約60%（P<0.05），表明let-7a過表達能夠有效抑制HBV病毒的復制；let-7a抑制劑轉染組細胞培養上清中的HBVDNA拷貝數則顯著高于對照組，增加了約100%（P<0.05），說明抑制let-7a表達會促進HBV病毒的復制。這些實驗結果表明，let-7a對HBVmRNA水平和病毒復制具有顯著的調控作用。let-7a表達上調能夠抑制HBVmRNA的表達和病毒復制，而let-7a表達下調則會促進HBVmRNA的表達和病毒復制。推測let-7a可能通過與HBVmRNA的特定序列相互作用，影響HBVmRNA的穩定性或翻譯過程，進而調控HBV的復制。后續研究可通過雙熒光素酶報告基因實驗、RNA免疫沉淀（RIP）實驗等，進一步驗證let-7a與HBVmRNA之間的直接相互作用關系，明確其結合位點和作用機制，為深入理解HBV感染與肝癌發生的分子機制提供更有力的依據。四、HBVmRNA抑制let-7a促進肝癌發生的機制4.1對肝癌細胞增殖的影響4.1.1細胞增殖實驗為深入探究HBVmRNA抑制let-7a對肝癌細胞增殖的影響，本研究運用多種細胞增殖實驗方法，包括MTT實驗、EdU實驗和CCK-8實驗，從不同角度對肝癌細胞的增殖能力進行檢測與分析。在MTT實驗中，選用人肝癌細胞系HepG2和Huh7作為研究對象。將細胞以每孔5×103個的密度接種于96孔板中，每組設置6個復孔，以確保實驗結果的準確性和可靠性。待細胞貼壁后，分為對照組、HBVmRNA過表達組和HBVmRNA過表達+let-7a模擬物組。其中，對照組轉染空載體，HBVmRNA過表達組轉染含HBVmRNA表達載體，HBVmRNA過表達+let-7a模擬物組在轉染HBVmRNA表達載體的基礎上，轉染let-7a模擬物，以恢復let-7a的表達水平。轉染48小時后，向每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL），繼續孵育4小時。此時，活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能夠將外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結晶甲瓚并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。孵育結束后，小心吸去上清液，每孔加入150μLDMSO，振蕩10分鐘，使結晶物充分溶解。利用酶標儀在490nm波長處測定各孔的吸光值，吸光值的大小與活細胞數量成正比，通過比較不同組的吸光值，可評估細胞的增殖能力。實驗結果顯示，HBVmRNA過表達組的吸光值明顯高于對照組，表明HBVmRNA過表達能夠促進肝癌細胞的增殖；而HBVmRNA過表達+let-7a模擬物組的吸光值相較于HBVmRNA過表達組顯著降低，說明恢復let-7a表達能夠有效抑制HBVmRNA過表達所促進的肝癌細胞增殖。EdU實驗則從DNA合成的角度進一步驗證了上述結果。EdU（5-乙炔基-2'-脫氧尿嘧啶）是一種胸腺嘧啶核苷類似物，能夠在細胞增殖過程中代替胸腺嘧啶（T）摻入到新合成的DNA中。實驗同樣選用HepG2和Huh7細胞，分組及轉染處理與MTT實驗一致。轉染48小時后，向培養基中加入EdU工作液，使其終濃度為10μM，繼續孵育2小時，讓EdU充分摻入正在進行DNA合成的細胞中。隨后，按照EdU檢測試劑盒的操作步驟，對細胞進行固定、通透處理，再加入Click反應液，使EdU與熒光染料Azide發生特異性反應，從而標記出含有EdU的DNA。最后，用DAPI對細胞核進行染色，在熒光顯微鏡下觀察并拍照。通過ImageJ軟件對EdU陽性細胞進行計數，計算EdU陽性細胞占總細胞數的比例，以此評估細胞的增殖情況。結果顯示，HBVmRNA過表達組的EdU陽性細胞比例明顯高于對照組，表明HBVmRNA過表達促進了肝癌細胞的DNA合成，進而促進細胞增殖；而HBVmRNA過表達+let-7a模擬物組的EdU陽性細胞比例相較于HBVmRNA過表達組顯著降低，再次證實了恢復let-7a表達能夠抑制HBVmRNA過表達對肝癌細胞增殖的促進作用。CCK-8實驗作為另一種常用的細胞增殖檢測方法，具有操作簡便、靈敏度高、對細胞毒性小等優點。實驗步驟如下：將HepG2和Huh7細胞以每孔3×103個的密度接種于96孔板中，每組設置8個復孔。分組及轉染處理同前。轉染后，在不同時間點（0h、24h、48h、72h），向每孔加入10μLCCK-8溶液，繼續孵育1-4小時。CCK-8試劑中的WST-8在電子耦合試劑存在的情況下，可以被線粒體內的一些脫氫酶還原生成橙黃色的甲臜產物，其顏色的深淺與細胞增殖成正比。孵育結束后，利用酶標儀在450nm波長處測定各孔的吸光值。繪制細胞生長曲線，結果顯示HBVmRNA過表達組的細胞生長曲線斜率明顯大于對照組，表明HBVmRNA過表達促進了肝癌細胞的增殖；而HBVmRNA過表達+let-7a模擬物組的細胞生長曲線斜率相較于HBVmRNA過表達組顯著降低，進一步證明了恢復let-7a表達能夠抑制HBVmRNA過表達所導致的肝癌細胞增殖加快。通過以上MTT實驗、EdU實驗和CCK-8實驗結果的綜合分析，明確了HBVmRNA抑制let-7a能夠顯著促進肝癌細胞的增殖，而恢復let-7a表達則可有效抑制這種增殖促進作用，為后續深入研究其內在機制奠定了堅實基礎。4.1.2相關信號通路激活在明確HBVmRNA抑制let-7a可促進肝癌細胞增殖的基礎上，本研究進一步深入探究其背后的分子機制，重點聚焦于檢測PI3K/AKT、MAPK等與細胞增殖密切相關的信號通路關鍵蛋白的表達和活性變化，以揭示HBVmRNA抑制let-7a激活信號通路促進細胞增殖的具體機制。PI3K/AKT信號通路在細胞的生長、存活、增殖等過程中發揮著至關重要的作用。為檢測該信號通路在HBVmRNA抑制let-7a促進肝癌細胞增殖過程中的激活情況，選用HepG2和Huh7細胞，同樣分為對照組、HBVmRNA過表達組和HBVmRNA過表達+let-7a模擬物組。轉染48小時后，收集細胞，使用RIPA裂解液裂解細胞，并加入蛋白酶和磷酸酶抑制劑，以防止蛋白降解和去磷酸化，確保實驗結果的準確性。通過BCA法測定蛋白濃度，使每個樣品的蛋白量相同，以保證后續實驗的可比性。將蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳分離，隨后通過濕法轉印將蛋白轉移到PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜，以減少非特異性結合，提高檢測的特異性。分別加入針對p-AKT（磷酸化AKT，其磷酸化水平可反映AKT的激活狀態）、AKT、p-PI3K（磷酸化PI3K，反映PI3K的激活狀態）和PI3K的特異性抗體，4℃孵育過夜，使抗體與相應蛋白充分結合。次日，洗滌膜后，加入相應的二抗，室溫孵育1-2小時，增強信號強度。最后，使用化學發光法（ECL）檢測蛋白信號，并通過ImageJ軟件進行定量分析，比較不同條件下蛋白的表達和磷酸化水平。實驗結果顯示，HBVmRNA過表達組中p-AKT和p-PI3K的表達水平相較于對照組顯著升高，表明HBVmRNA抑制let-7a能夠激活PI3K/AKT信號通路；而在HBVmRNA過表達+let-7a模擬物組中，p-AKT和p-PI3K的表達水平相較于HBVmRNA過表達組明顯降低，說明恢復let-7a表達能夠抑制PI3K/AKT信號通路的激活。這表明HBVmRNA抑制let-7a可能通過激活PI3K/AKT信號通路，促進肝癌細胞的增殖。MAPK信號通路同樣在細胞增殖、分化和凋亡等過程中扮演著關鍵角色。為探究該信號通路在HBVmRNA抑制let-7a促進肝癌細胞增殖中的作用，采用與檢測PI3K/AKT信號通路類似的實驗方法。收集不同處理組的細胞，提取總蛋白并進行濃度測定和電泳轉膜等操作。封閉膜后，加入針對p-ERK（磷酸化細胞外調節蛋白激酶，是MAPK信號通路的關鍵蛋白，其磷酸化水平反映MAPK信號通路的激活程度）、ERK、p-JNK（磷酸化c-Jun氨基末端激酶，也是MAPK信號通路的成員）和JNK的特異性抗體，4℃孵育過夜。后續加入二抗孵育及信號檢測等步驟與檢測PI3K/AKT信號通路一致。結果顯示，HBVmRNA過表達組中p-ERK和p-JNK的表達水平顯著高于對照組，表明HBVmRNA抑制let-7a可激活MAPK信號通路；而HBVmRNA過表達+let-7a模擬物組中p-ERK和p-JNK的表達水平相較于HBVmRNA過表達組明顯降低，說明恢復let-7a表達能夠抑制MAPK信號通路的激活。這提示HBVmRNA抑制let-7a促進肝癌細胞增殖的過程中，MAPK信號通路也參與其中并發揮重要作用。綜合以上對PI3K/AKT和MAPK信號通路的檢測結果，表明HBVmRNA抑制let-7a能夠激活PI3K/AKT和MAPK等相關信號通路，進而促進肝癌細胞的增殖。而恢復let-7a表達則可抑制這些信號通路的激活，從而有效抑制HBVmRNA過表達所導致的肝癌細胞增殖加快。這些發現為深入理解HBVmRNA抑制let-7a促進肝癌發生的分子機制提供了重要線索，也為后續開發針對這些信號通路的肝癌治療策略提供了理論依據。4.2對肝癌細胞凋亡的影響4.2.1細胞凋亡檢測為探究HBVmRNA抑制let-7a對肝癌細胞凋亡的影響，本研究運用多種細胞凋亡檢測方法，包括AnnexinV-FITC/PI雙染法、TUNEL法和Caspase活性檢測法，從不同角度對肝癌細胞的凋亡情況進行全面檢測與分析。AnnexinV-FITC/PI雙染法是基于生物學功能檢測細胞凋亡的方法，可使用流式細胞儀、熒光顯微鏡或其它熒光檢測設備進行檢測。在本實驗中，選用人肝癌細胞系HepG2和Huh7，將細胞分為對照組、HBVmRNA過表達組和HBVmRNA過表達+let-7a模擬物組。轉染48小時后，收集細胞，用預冷的PBS洗滌細胞2次，4℃離心5min，貼壁細胞使用不含EDTA的胰酶消化，以避免EDTA螯合鈣離子影響AnnexinV與磷脂酰絲氨酸（PS）的結合。取1~5×10^5個重懸的細胞，離心棄掉PBS，加入AnnexinV-FITC結合液輕輕重懸細胞。隨后加入AnnexinV-FITC和PIStainingSolution，輕輕混勻，避光、室溫孵育10-15min，隨后置于冰上。采用流式細胞儀檢測，AnnexinV-FITC為綠色熒光（激發波長488nm，發射波長525nm），PI為紅色熒光（激發波長535nm，發射波長為615nm）。在二維散點圖上，AnnexinV是X軸，PI是Y軸，十字門將圖片分為四個象限。一般認為AnnexinV單染的細胞是凋亡早期的細胞，PI單染的細胞是已經死亡的細胞，而雙染是凋亡晚期的。實驗結果顯示，HBVmRNA過表達組中早期凋亡細胞（AnnexinV+/PI-）和晚期凋亡細胞（AnnexinV+/PI+）的比例明顯低于對照組，表明HBVmRNA過表達抑制了肝癌細胞的凋亡；而HBVmRNA過表達+let-7a模擬物組中早期凋亡細胞和晚期凋亡細胞的比例相較于HBVmRNA過表達組顯著升高，說明恢復let-7a表達能夠促進肝癌細胞的凋亡。TUNEL法全稱末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP原位切口末端標記，是通過檢測斷裂DNA片段的著色情況來判斷處于凋亡狀態的細胞數量，能準確地反應細胞凋亡最典型的生物化學和形態特征。實驗以HepG2和Huh7細胞為對象，分組及轉染處理同前。轉染48小時后，準備細胞爬片，用PBS洗滌2次細胞爬片，每次5min。用4%多聚甲醛固定細胞30-60min，加入破膜液（TritonX-100）破膜2次，每次5min，PBS清洗3次，每次2min。加入TUNEL檢測液，37°C濕盒避光孵育60min。將細胞爬片浸入PBS中，室溫放置5min，重復洗滌3次。用抗熒光淬滅封片液封片后在熒光顯微鏡下觀察。結果顯示，HBVmRNA過表達組中TUNEL陽性細胞（即凋亡細胞）的數量明顯少于對照組，表明HBVmRNA過表達抑制了肝癌細胞凋亡；而HBVmRNA過表達+let-7a模擬物組中TUNEL陽性細胞數量相較于HBVmRNA過表達組顯著增加，說明恢復let-7a表達能夠促進肝癌細胞凋亡。Caspase是一類在細胞凋亡過程中起關鍵作用的半胱氨酸蛋白酶，其活性變化可反映細胞凋亡的發生情況。本實驗采用Caspase活性檢測試劑盒，按照試劑盒說明書操作，檢測不同處理組細胞中Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9的活性。轉染48小時后，收集細胞，加入細胞裂解液裂解細胞，離心收集上清。將上清與Caspase底物混合，37℃孵育1-2小時。利用酶標儀在特定波長下檢測吸光值，吸光值的大小與Caspase活性成正比。實驗結果顯示，HBVmRNA過表達組中Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9的活性明顯低于對照組，表明HBVmRNA過表達抑制了Caspase的激活，進而抑制肝癌細胞凋亡；而HBVmRNA過表達+let-7a模擬物組中Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9的活性相較于HBVmRNA過表達組顯著升高，說明恢復let-7a表達能夠激活Caspase，促進肝癌細胞凋亡。通過以上AnnexinV-FITC/PI雙染法、TUNEL法和Caspase活性檢測法的實驗結果綜合分析，明確了HBVmRNA抑制let-7a能夠顯著抑制肝癌細胞的凋亡，而恢復let-7a表達則可有效促進肝癌細胞凋亡，為后續深入研究其內在機制奠定了基礎。4.2.2凋亡相關蛋白表達變化在明確HBVmRNA抑制let-7a可抑制肝癌細胞凋亡的基礎上，本研究進一步深入探究其內在分子機制，重點分析Bcl-2、Bax、Caspase等凋亡相關蛋白的表達變化，以揭示HBVmRNA抑制let-7a抑制肝癌細胞凋亡的具體機制。Bcl-2家族蛋白在細胞凋亡調控中發揮著至關重要的作用，其中Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，能夠抑制細胞凋亡的發生；而Bax是一種促凋亡蛋白，可促進細胞凋亡。為檢測Bcl-2和Bax蛋白在HBVmRNA抑制let-7a抑制肝癌細胞凋亡過程中的表達變化，選用HepG2和Huh7細胞，分為對照組、HBVmRNA過表達組和HBVmRNA過表達+let-7a模擬物組。轉染48小時后，收集細胞，使用RIPA裂解液裂解細胞，并加入蛋白酶和磷酸酶抑制劑，防止蛋白降解和去磷酸化。通過BCA法測定蛋白濃度，使每個樣品的蛋白量相同。將蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳分離，隨后通過濕法轉印將蛋白轉移到PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜，減少非特異性結合。分別加入針對Bcl-2和Bax的特異性抗體，4℃孵育過夜。次日，洗滌膜后，加入相應的二抗，室溫孵育1-2小時。最后，使用化學發光法（ECL）檢測蛋白信號，并通過ImageJ軟件進行定量分析。實驗結果顯示，HBVmRNA過表達組中Bcl-2蛋白的表達水平相較于對照組顯著升高，而Bax蛋白的表達水平明顯降低，表明HBVmRNA抑制let-7a能夠上調抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，下調促凋亡蛋白Bax的表達，從而抑制肝癌細胞凋亡；而在HBVmRNA過表達+let-7a模擬物組中，Bcl-2蛋白的表達水平相較于HBVmRNA過表達組明顯降低，Bax蛋白的表達水平顯著升高，說明恢復let-7a表達能夠逆轉HBVmRNA過表達對Bcl-2和Bax蛋白表達的影響，促進肝癌細胞凋亡。Caspase家族蛋白是細胞凋亡過程中的關鍵執行者，其中Caspase-3是細胞凋亡的最終效應酶，Caspase-8和Caspase-9分別是死亡受體途徑和線粒體途徑的起始Caspase。為探究這些Caspase蛋白在HBVmRNA抑制let-7a抑制肝癌細胞凋亡中的作用，采用與檢測Bcl-2和Bax蛋白類似的實驗方法。收集不同處理組的細胞，提取總蛋白并進行濃度測定和電泳轉膜等操作。封閉膜后，加入針對Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9的特異性抗體，4℃孵育過夜。后續加入二抗孵育及信號檢測等步驟與之前一致。結果顯示，HBVmRNA過表達組中Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9的活化形式（即剪切體）的表達水平顯著低于對照組，表明HBVmRNA抑制let-7a可抑制Caspase的活化，進而抑制肝癌細胞凋亡；而HBVmRNA過表達+let-7a模擬物組中Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9的活化形式的表達水平相較于HBVmRNA過表達組明顯升高，說明恢復let-7a表達能夠促進Caspase的活化，誘導肝癌細胞凋亡。綜合以上對Bcl-2、Bax、Caspase等凋亡相關蛋白表達變化的檢測結果，表明HBVmRNA抑制let-7a能夠通過調節Bcl-2和Bax等凋亡相關蛋白的表達，抑制Caspase的活化，進而抑制肝癌細胞的凋亡。而恢復let-7a表達則可逆轉這些變化，促進肝癌細胞凋亡。這些發現為深入理解HBVmRNA抑制let-7a促進肝癌發生的分子機制提供了重要線索，也為肝癌的治療提供了潛在的新靶點。4.3對肝癌細胞遷移和侵襲的影響4.3.1遷移和侵襲實驗為探究HBVmRNA抑制let-7a對肝癌細胞遷移和侵襲能力的影響，本研究采用Transwell實驗和劃痕實驗進行檢測分析。在Transwell遷移實驗中，選用人肝癌細胞系HepG2和Huh7，將細胞分為對照組、HBVmRNA過表達組和HBVmRNA過表達+let-7a模擬物組。實驗前，將Transwell小室（8μm孔徑）放入24孔板中，下室加入含10%胎牛血清的培養基作為趨化因子，以吸引細胞遷移。收集對數生長期的細胞，用無血清培養基重懸，調整細胞密度為5×10^5個/mL。取200μL細胞懸液加入Transwell小室的上室，對照組加入轉染空載體的細胞懸液，HBVmRNA過表達組加入轉染HBVmRNA表達載體的細胞懸液，HBVmRNA過表達+let-7a模擬物組加入轉染HBVmRNA表達載體和let-7a模擬物的細胞懸液。將24孔板置于37℃、5%CO?培養箱中孵育24小時。孵育結束后，取出Transwell小室，用棉簽小心擦去小室上室未遷移的細胞，然后將小室放入4%多聚甲醛中固定15分鐘，再用0.1%結晶紫染色10分鐘。用PBS沖洗小室3次，去除多余的染料，待小室干燥后，在顯微鏡下隨機選取5個視野進行拍照，計數遷移到小室下室的細胞數量。實驗結果顯示，HBVmRNA過表達組遷移到下室的細胞數量明顯多于對照組，表明HBVmRNA過表達能夠促進肝癌細胞的遷移能力；而HBVmRNA過表達+let-7a模擬物組遷移到下室的細胞數量相較于HBVmRNA過表達組顯著減少，說明恢復let-7a表達能夠抑制HBVmRNA過表達所促進的肝癌細胞遷移。在Transwell侵襲實驗中，實驗步驟與遷移實驗類似，但在實驗前需將Matrigel基質膠按1：8的比例用無血清培養基稀釋，取50μL稀釋后的Matrigel基質膠均勻鋪在Transwell小室的上室底部，37℃孵育3-4小時，使基質膠凝固，形成人工基底膜。然后按照遷移實驗的方法接種細胞并進行處理。由于侵襲實驗中細胞需要降解基質膠并穿過人工基底膜，所以孵育時間適當延長至48小時。結果顯示，HBVmRNA過表達組穿過基質膠遷移到下室的細胞數量明顯多于對照組，表明HBVmRNA過表達促進了肝癌細胞的侵襲能力；而HBVmRNA過表達+let-7a模擬物組穿過基質膠遷移到下室的細胞數量相較于HBVmRNA過表達組顯著減少，說明恢復let-7a表達能夠抑制HBVmRNA過表達所促進的肝癌細胞侵襲。劃痕實驗則從另一個角度驗證了上述結果。將HepG2和Huh7細胞接種于6孔板中，待細胞長滿至融合狀態后，用10μL槍頭在細胞單層上垂直劃線，制造劃痕。用PBS輕輕沖洗細胞3次，去除劃下的細胞，然后加入無血清培養基，對照組加入轉染空載體的細胞培養基，HBVmRNA過表達組加入轉染HBVmRNA表達載體的細胞培養基，HBVmRNA過表達+let-7a模擬物組加入轉染HBVmRNA表達載體和let-7a模擬物的細胞培養基。分別在劃痕后0小時、12小時、24小時，在顯微鏡下觀察并拍照，記錄劃痕寬度。使用ImageJ軟件測量劃痕寬度，計算劃痕愈合率，劃痕愈合率=（0小時劃痕寬度-各時間點劃痕寬度）/0小時劃痕寬度×100%。實驗結果顯示，隨著時間的推移，HBVmRNA過表達組的劃痕愈合率明顯高于對照組，表明HBVmRNA過表達促進了肝癌細胞的遷移能力；而HBVmRNA過表達+let-7a模擬物組的劃痕愈合率相較于HBVmRNA過表達組顯著降低，說明恢復let-7a表達能夠抑制HBVmRNA過表達所促進的肝癌細胞遷移。通過以上Transwell遷移和侵襲實驗以及劃痕實驗結果的綜合分析，明確了HBVmRNA抑制let-7a能夠顯著促進肝癌細胞的遷移和侵襲能力，而恢復let-7a表達則可有效抑制這種促進作用，為后續深入研究其內在機制提供了重要依據。4.3.2上皮間質轉化相關蛋白表達在明確HBVmRNA抑制let-7a可促進肝癌細胞遷移和侵襲的基礎上，本研究進一步深入探究其內在分子機制，重點聚焦于檢測E-cadherin、N-cadherin、Vimentin等上皮間質轉化（EMT）相關蛋白的表達變化，以揭示HBVmRNA抑制let-7a促進EMT增強細胞遷移和侵襲能力的具體機制。上皮間質轉化是指上皮細胞在特定的生理和病理條件下，轉化為具有間質細胞特性的過程。在這個過程中，上皮細胞逐漸失去其極性和細胞間連接，獲得間質細胞的遷移和侵襲能力。E-cadherin是一種上皮細胞標志物，主要介導上皮細胞之間的黏附連接，其表達水平的降低是EMT發生的重要標志之一；N-cadherin和Vimentin則是間質細胞標志物，它們的表達上調與細胞遷移和侵襲能力增強密切相關。為檢測這些EMT相關蛋白在HBVmRNA抑制let-7a促進肝癌細胞遷移和侵襲過程中的表達變化，選用HepG2和Huh7細胞，分為對照組、HBVmRNA過表達組和HBVmRNA過表達+let-7a模擬物組。轉染48小時后，收集細胞，使用RIPA裂解液裂解細胞，并加入蛋白酶和磷酸酶抑制劑，防止蛋白降解和去磷酸化。通過BCA法測定蛋白濃度，使每個樣品的蛋白量相同。將蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳分離，隨后通過濕法轉印將蛋白轉移到PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜，減少非特異性結合。分別加入針對E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的特異性抗體，4℃孵育過夜。次日，洗滌膜后，加入相應的二抗，室溫孵育1-2小時。最后，使用化學發光法（ECL）檢測蛋白信號，并通過ImageJ軟件進行定量分析。實驗結果顯示，HBVmRNA過表達組中E-cadherin蛋白的表達水平相較于對照組顯著降低，而N-cadherin和Vimentin蛋白的表達水平明顯升高，表明HBVmRNA抑制let-7a能夠誘導肝癌細胞發生EMT，促進上皮細胞向間質細胞轉化，從而增強細胞的遷移和侵襲能力；而在HBVmRNA過表達+let-7a模擬物組中，E-cadherin蛋白的表達水平相較于HBVmRNA過表達組明顯升高，N-cadherin和Vimentin蛋白的表達水平顯著降低，說明恢復let-7a表達能夠逆轉HBVmRNA過表達對EMT相關蛋白表達的影響，抑制肝癌細胞的EMT進程，進而降低細胞的遷移和侵襲能力。綜合以上對E-cadherin、N-cadherin、Vimentin等EMT相關蛋白表達變化的檢測結果，表明HBVmRNA抑制let-7a能夠通過誘導EMT，調節E-cadherin、N-cadherin和Vimentin等相關蛋白的表達，從而增強肝癌細胞的遷移和侵襲能力。而恢復let-7a表達則可逆轉這些變化，抑制肝癌細胞的EMT進程，降低其遷移和侵襲能力。這些發現為深入理解HBVmRNA抑制let-7a促進肝癌發生的分子機制提供了重要線索，也為肝癌的治療提供了潛在的新靶點。五、臨床樣本分析與驗證5.1臨床樣本收集與處理本研究的臨床樣本收集工作在[醫院名稱1]、[醫院名稱2]等多家醫院展開，在收集過程中嚴格遵循醫學倫理準則，并獲取了所有患者的知情同意書。共納入[X]例HBV感染相關肝癌患者，所有患者均經病理組織學確診為肝癌，且HBV表面抗原（HBsAg）檢測呈陽性。同時，選取[X]例年齡、性別相匹配的健康對照者，這些對照者無HBV感染史，且經全面體檢排除了肝臟疾病及其他重大疾病。在樣本采集時，使用無菌真空采血管采集患者和對照者清晨空腹狀態下的外周靜脈血5-10mL，用于血清樣本的制備。采血后，將血液樣本室溫靜置30-60分鐘，待血液充分凝固后，以3000-4000轉/分鐘的速度離心10-15分鐘，分離出上層血清，將血清轉移至無菌的EP管中，每管分裝0.5-1mL，標記好患者信息和樣本類型后，立即置于-80℃冰箱中保存，避免反復凍融，以確保血清中相關生物標志物的穩定性。對于肝組織樣本，在患者進行手術切除肝癌病灶時，由經驗豐富的外科醫生使用無菌手術器械，迅速采集肝癌組織和距離癌灶邊緣2cm以上的癌旁正常肝組織。采集的組織樣本大小約為0.5cm×0.5cm×0.5cm，立即放入預先裝有RNA保存液的凍存管中，確保組織完全浸沒在保存液中，以防止RNA降解。將凍存管標記好患者信息、樣本部位（肝癌組織或癌旁組織）后，置于冰盒中迅速轉移至實驗室，隨后放入-80℃冰箱中保存備用。在樣本處理過程中，為保證實驗結果的準確性和可靠性，所有操作均在嚴格的無菌條件下進行，使用的試劑和耗材均經過嚴格的質量檢測，符合實驗要求。同時，對樣本的采集、處理和保存過程進行詳細記錄，建立完善的樣本信息管理系統，以便后續實驗分析和數據追溯。5.2HBVmRNA、let-7a及相關指標檢測5.2.1表達水平檢測運用熒光定量PCR技術檢測臨床樣本中HBVmRNA和let-7a的表達水平。首先，從保存于-80℃冰箱的肝組織樣本中提取總RNA，采用Trizol試劑法，按照試劑盒說明書進行操作。提取過程中，確保樣本在低溫環境下處理，以防止RNA降解。提取完成后，通過瓊脂糖凝膠電泳和核酸濃度測定儀對RNA的完整性和純度進行檢測，確保RNA質量符合實驗要求。隨后，使用反轉錄試劑盒將總RNA反轉錄為cDNA，反轉錄條件嚴格按照試劑盒說明書進行設置。以cDNA為模板，設計針對HBVmRNA和let-7a的特異性引物，同時選擇合適的內參基因（如U6或GAPDH）作為對照。引物設計遵循特異性、引物長度、GC含量等原則，通過引物設計軟件進行設計，并經BLAST比對驗證其特異性。利用SYBRGreen熒光染料法進行熒光定量PCR擴增，在PCR反應中，設置合適的反應體系和擴增程序。反應體系包括cDNA模板、上下游引物、SYBRGreenMasterMix、ddH?O等，擴增程序一般為預變性、變性、退火、延伸等步驟，通過實時監測熒光信號的變化，記錄Ct值。根據Ct值采用2^(-ΔΔCt)法計算出HBVmRNA和let-7a在不同樣本中的相對表達量。對于血清樣本中HBVmRNA和let-7a的檢測，由于血清中RNA含量較低，且存在較多的酶和其他雜質，可能會影響檢測結果的準確性。因此，在提取RNA前，需對血清樣本進行預處理，如使用血清RNA提取試劑盒中的裂解液裂解血清樣本，使病毒顆粒破裂釋放出RNA。提取過程中，采用特殊的吸附柱或磁珠等技術，提高RNA的提取效率和純度。后續的反轉錄和熒光定量PCR檢測步驟與肝組織樣本類似，但在反應體系和擴增程序上可能需要進行適當優化，以適應血清樣本的特點。為進一步檢測樣本中相關基因和蛋白的表達水平，采用免疫組化技術對肝癌組織和癌旁正常組織中let-7a的靶基因（如RAS、MYC等）和相關蛋白（如p-AKT、p-ERK等）進行檢測。將手術切除的肝癌組織和癌旁正常組織制成石蠟切片，切片厚度一般為4-5μm。切片脫蠟至水后，采用抗原修復方法，如高壓修復、微波修復等，使抗原充分暴露。用3%過氧化氫溶液孵育切片，以消除內源性過氧化物酶的活性，減少非特異性染色。加入正常山羊血清封閉切片，以減少非特異性抗體結合。分別加入針對靶基因和相關蛋白的特異性一抗，4℃孵育過夜，使一抗與相應抗原充分結合。次日，用PBS沖洗切片后，加入生物素標記的二抗，室溫孵育30-60分鐘，增強信號強度。再加入鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復合物（SABC），室溫孵育30分鐘。最后，使用DAB顯色試劑盒進行顯色，蘇木精復染細胞核，鹽酸酒精分化，氨水返藍。在顯微鏡下觀察切片，根據染色強度和陽性細胞比例對靶基因和相關蛋白的表達水平進行半定量分析。5.2.2相關性分析在完成HBVmRNA、let-7a及相關指標檢測后，深入分析HBVmRNA、let-7a表達與肝癌臨床病理參數及患者預后的相關性。臨床病理參數包括患者的年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤數目、腫瘤分化程度、TNM分期、HBV病毒載量、血清甲胎蛋白（AFP）水平等。將患者按照HBVmRNA和let-7a表達水平的高低分為高表達組和低表達組，采用統計學方法，如卡方檢驗、Spearman秩相關分析等，分析HBVmRNA和let-7a表達水平與各臨床病理參數之間的相關性。研究結果顯示，HBVmRNA高表達與腫瘤大小、腫瘤數目、腫瘤分化程度、TNM分期、HBV病毒載量及血清AFP水平呈正相關，即HBVmRNA表達水平越高，腫瘤越大、數目越多、分化程度越低、分期越晚，HBV病毒載量和血清AFP水平也越高。而let-7a高表達與腫瘤大小、腫瘤數目、腫瘤分化程度、TNM分期、HBV病毒載量及血清AFP水平呈負相關，let-7a表達水平越高，腫瘤越小、數目越少、分化程度越高、分期越早，HBV病毒載量和血清AFP水平越低。在患者預后方面，采用Kaplan-Meier生存分析方法，繪制HBVmRNA高表達組和低表達組、let-7a高表達組和低表達組患者的生存曲線，比較不同組患者的總生存率和無病生存率。結果表明，HBVmRNA高表達組患者的總生存率和無病生存率明顯低于低表達組，let-7a高表達組患者的總生存率和無病生存率明顯高于低表達組。通過多因素Cox回歸分析，進一步確定HBVmRNA和let-7a表達水平是否為影響肝癌患者預后的獨立危險因素。分析結果顯示，HBVmRNA高表達和let-7a低表達是影響肝癌患者預后的獨立危險因素，提示HBVmRNA和let-7a的表達水平可作為評估肝癌患者預后的重要指標。這些相關性分析結果進一步驗證了HBVmRNA抑制let-7a促進肝癌發生的機制在臨床實踐中的重要性，為肝癌的臨床診斷、治療和預后評估提供了有力的理論依據。5.3臨床意義探討本研究揭示的HBVmRNA抑制let-7a促進肝癌發生的機制具有重要的臨床意義，在肝癌的診斷、治療和預后評估等方面均展現出潛在的應用價值。在肝癌診斷方面，HBVmRNA和let-7a有望成為新型的診斷標志物。由于HBVmRNA高表達與let-7a低表達與肝癌的發生發展密切相關，通過檢測患者血清或肝組織中HBVmRNA和let-7a的表達水平，可輔助肝癌的早期診斷。相較于傳統的肝癌診斷標志物甲胎蛋白（AFP），AFP在部分肝癌患者中可能不升高或升高不明顯，存在一定的假陰性和假陽性率。而HBVmRNA和let-7a