腫瘤藥物敏感實驗第一頁，共二十二頁。化療的重要性自1946年Gillman和Phillip報道氮芥類藥物治療造血系統(tǒng)腫瘤以來，化學(xué)治療巳取得很大的進(jìn)步。目前化學(xué)治療已使絨癌、惡性淋巴瘤、睪丸精原細(xì)胞瘤、小細(xì)胞肺癌等多種惡性腫瘤獲得治愈的時機(jī)，大多數(shù)惡性腫瘤能得到緩解，化療在惡性腫瘤的治療中具有不可替代的地位。第二頁，共二十二頁。腫瘤化療的局限性腫瘤的化學(xué)治療在半個世紀(jì)以來，雖然取得顯著進(jìn)展，但臨床抗腫瘤藥物治療的總有效率并不高，阻礙化學(xué)治療取得更好療效的原因眾多，主要包括：

第三頁，共二十二頁。抗腫瘤藥物研究說明，即使是相同組織學(xué)類型的腫瘤對同一抗腫瘤藥物的反響也并不盡一致，對不同臟器或不同組織學(xué)類型的腫瘤采用相同的用藥方案，效果更是千差萬別。目前大多數(shù)化療是采用的對某種臟器既定的聯(lián)合方案,仍有一定的盲目性。1.

現(xiàn)行化療的盲目性第四頁，共二十二頁。2.化學(xué)治療的抗藥性

有些腫瘤對某些藥物存在先天耐藥,還有些腫瘤經(jīng)化療緩解，腫瘤敏感株殺滅，耐藥株成為復(fù)發(fā)的根源，而且對以后的化療抵抗。第五頁，共二十二頁。3.抗癌藥物的毒性所有抗腫瘤藥物在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時，也殺傷正常的組織細(xì)胞，尤其是增殖旺盛的骨髓造血細(xì)胞和胃腸道細(xì)胞。期望通過增大劑量、增加用藥品種、縮短間隔時間的方法來提高抗癌效果，那么將進(jìn)一步加重毒性作用。第六頁，共二十二頁。如何解決這些問題？腫瘤化療個體化:研究發(fā)現(xiàn)，根據(jù)藥敏檢測結(jié)果指導(dǎo)選藥，有效率可在原來固定化療方案的根底上提高一倍以上，于是提出了腫瘤化療個體化的概念(即預(yù)見性化療)。根據(jù)個體腫瘤敏感性檢測的結(jié)果，選用敏感的藥物的聯(lián)合方案，無疑將會大大提高腫瘤的治療水平。第七頁，共二十二頁。腫瘤藥敏的可行性七十年代細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的突破，新型培養(yǎng)材料、培養(yǎng)基的問世。1983年Mosmann建立了MTT法，方法簡便，設(shè)備要求不高，檢測時間短，便于在臨床上廣泛開展。新的抗癌藥不斷問世，同一種腫瘤有多種聯(lián)合化療方案可供選擇。第八頁，共二十二頁。腫瘤藥敏的方法學(xué)裸鼠皮下移植裸鼠腎包膜下移植裸鼠原位移植腫瘤細(xì)胞藥敏體內(nèi)法體外法染料排斥法集落形成法同位素法四唑藍(lán)比色法第九頁，共二十二頁。裸鼠腎包膜下移植裸鼠腎包膜下移植實驗是腫瘤細(xì)胞藥敏體內(nèi)實驗最常用的方法，但由于裸鼠需要在無菌條件下飼養(yǎng)，而且腎包膜下移植實驗操作復(fù)雜，實驗周期長，不易在臨床廣泛開展。第十頁，共二十二頁。染料排斥實驗原理是細(xì)胞死亡后膜通透性增加，染料通過細(xì)胞膜而使細(xì)胞著色，故通過計數(shù)未著色細(xì)胞可計算出藥物的殺傷率。但由于某些受殺傷尚未死亡的細(xì)胞也不易著色，故假陰性率較高。另外在計數(shù)時主觀的因素會出現(xiàn)較大的誤差，目前較少應(yīng)用。第十一頁，共二十二頁。集落形成法集落法(HumanTumorCellCloningAssay,HTCA〕腫瘤組織由增殖和非增殖細(xì)胞組成，其中僅有1％具有旺盛的增殖能力，是腫瘤浸潤擴(kuò)散和復(fù)發(fā)的根源。這種細(xì)胞具有形成細(xì)胞集落的能力,故又稱為腫瘤干細(xì)胞。測定腫瘤干細(xì)胞對藥物的敏感性符合臨床藥物治療的需要。第十二頁，共二十二頁。集落形成法方法學(xué)雙層瓊酯法：底層參加0.5%的瓊脂培養(yǎng)液,上層加含腫瘤細(xì)胞懸液的0.3%瓊脂培養(yǎng)液。上層培養(yǎng)液供腫瘤細(xì)胞生長，下層防止細(xì)胞貼壁及成纖維細(xì)胞的過度生長。玻璃毛細(xì)管法:培養(yǎng)基0.6ml，瘤細(xì)胞懸液0.1ml,抗癌藥0.1ml,1％瓊脂糖0.2ml加在一起混勻后向玻璃毛細(xì)管內(nèi)參加50μl，冷卻凝固后置37℃二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。第十三頁，共二十二頁。集落形成法的優(yōu)點抑制纖維母細(xì)胞的增殖，不受腫瘤細(xì)胞以外的細(xì)胞的影響。下層滋養(yǎng)層可參加各種輔助分子，更利于腫瘤的生長。直接測定藥物對腫瘤細(xì)胞中最活潑的成分腫瘤干細(xì)胞的影響。第十四頁，共二十二頁。集落形成法的缺點高純度單細(xì)胞懸液的制備困難。所形成的細(xì)胞集落并非都是腫瘤細(xì)胞集落。成功率低，有一定的難度。培養(yǎng)周期長，需10天左右。第十五頁，共二十二頁。放射性同位素標(biāo)記的核苷酸容易摻入DNA和RNA分子中放射性同位素發(fā)靈敏度高，重復(fù)性好。時間短，可較快地得到結(jié)果。儀器設(shè)備要求高。由于具有放射性，故操作時需要一定的防護(hù)措施。廢料需特別處理。放射同位素法3H的β射線能量低，分辨率高，半衰期長達(dá)12年,3H標(biāo)記胸腺嘧啶核苷(3HTdR)為最常用。第十六頁，共二十二頁。3HTdR摻入法用培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/ml。將此濃度的細(xì)胞接種于微量培養(yǎng)板，每孔100μl，每3孔為一組，參加100μl含有化療藥的培養(yǎng)基，培養(yǎng)52小時，參加20μl3HTdR,實驗結(jié)束后，吸棄上清，參加0.3％胰蛋白酶消化細(xì)胞，用多頭細(xì)胞收集器收集細(xì)胞。最后用液體閃爍計數(shù)儀測定每分鐘脈沖數(shù)〔CPM〕值。第十七頁，共二十二頁。四唑藍(lán)比色法〔MTT法〕原理：活細(xì)胞內(nèi)線粒體脫氫酶能將四甲基偶氮唑鹽轉(zhuǎn)化為藍(lán)紫色結(jié)晶物(formazan)，用二甲亞砜〔DMSO〕溶解后，可在酶標(biāo)儀上記錄吸光度。優(yōu)點:1.操作簡便，設(shè)備要求不高，時間短。2.實驗精確，重復(fù)性好，而且無主觀人為因素影響，臨床符合率85％。3.成功率高，約為80－90％第十八頁，共二十二頁。MTT法操作方法用培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/ml后接種于微量培養(yǎng)板，每孔100，每組設(shè)三個平行孔，參加100μl含有化療藥的培養(yǎng)基,置培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)68小時，參加20μlMTT后再培養(yǎng)4小時,吸棄上清，每孔加二甲亞砜200μl,用微量震蕩器震蕩,使結(jié)晶產(chǎn)物充分溶解，在自動酶標(biāo)儀上比色，測出波長570nm處的吸光度，最后計算細(xì)胞殺傷活性。第十九頁，共二十二頁。MTT法本卷須知血供豐富的腫瘤組織在制取腫瘤單細(xì)胞懸液時，大量的紅細(xì)胞影響測定，可用紅細(xì)