產(chǎn)品中文名稱：尿路上皮癌相關(guān)8種基因檢測(cè)試劑 3 3 3 3 4 4 6 10 11 14杭州可幫基因科技有限公司浙江省杭州市臨平區(qū)余杭經(jīng)濟(jì)技術(shù)開發(fā)區(qū)新顏路22號(hào)7幢301M杭州市臨平區(qū)龍船塢路157號(hào)3幢5層502室；杭州市臨平區(qū)龍船塢路157號(hào)5幢3層1309、1310室一、產(chǎn)品概述（一）產(chǎn)品主要組成成分產(chǎn)品主要組成成分見表1：表1試劑盒主要組成成分123DNA聚合酶、脫氧核糖核苷三磷酸4567具體內(nèi)容詳見產(chǎn)品說明書。（二）產(chǎn)品預(yù)期用途本產(chǎn)品用于體外定性檢測(cè)人尿液脫落細(xì)胞樣本中編碼RNACA9、CCL18、ERBB2、IGF2、MMP12、PPP1R14D、SGK2和非編碼RNASWINGN共8種尿路上皮癌相關(guān)基因的表達(dá)水平。本產(chǎn)品用于疑似尿路上皮癌初診患者的輔助診斷。本產(chǎn)品采用熒光PCR方法對(duì)上述8個(gè)基因的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，適用于有血尿、膀胱刺激癥等臨床癥狀，或經(jīng)影像學(xué)等非侵入性方法顯示異常，臨床可能需進(jìn)一步檢查的疑似尿路上皮癌初診患者的輔助診斷，尤其是經(jīng)影像學(xué)等非侵入性方法無法決策病例是否進(jìn)行鏡檢的輔助診斷，可為患者提供一種尿路上皮癌的無創(chuàng)輔助診斷選擇，但不能作為腫瘤早期診斷或確診的依據(jù)。臨床醫(yī)生應(yīng)結(jié)合患者病情及其他實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)指標(biāo)等因素對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行綜合判斷。（三）產(chǎn)品包裝規(guī)格24測(cè)試/盒。（四）產(chǎn)品檢驗(yàn)原理本產(chǎn)品檢驗(yàn)原理主要包括RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄及熒光定量PCR三個(gè)步驟。通過核酸提取試劑提取尿液脫落細(xì)胞中的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)生cDNA。采用雙重PCR分別檢測(cè)8個(gè)尿路上皮癌相關(guān)靶基因，每個(gè)反應(yīng)管分別檢測(cè)1個(gè)靶基因和人源管家基因（GAPDH）的表達(dá)水平，通過ΔCt值反映細(xì)胞中8個(gè)靶基因的表達(dá)水平。人源管家基因GAPDH作為內(nèi)部參照（以下簡(jiǎn)稱內(nèi)參，InternalControl（IC））系統(tǒng)，對(duì)樣本RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄和PCR反應(yīng)過程進(jìn)行質(zhì)量控制，其Ct值參與計(jì)算。本產(chǎn)品利用特異性的引物對(duì)8個(gè)尿路上皮癌相關(guān)基因及內(nèi)標(biāo)基因GAPDH進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并通過TaqMan探針對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，在實(shí)時(shí)熒光PCR平臺(tái)上獲取樣本尿路上皮癌相關(guān)基因的表達(dá)Ct值。采用《尿路上皮癌基因分析軟件》對(duì)待測(cè)樣本的各基因表達(dá)Ct值進(jìn)行分析，計(jì)算樣本的綜合評(píng)分，獲得分析結(jié)果。二、臨床前研究概述（一）主要原材料1.主要原材料的選擇該產(chǎn)品的主要原材料包括引物、探針、dNTP、DNA聚合酶及對(duì)照品等。其中對(duì)照品為申請(qǐng)人自行生產(chǎn)，其他原材料均通過外購的方式獲得。申請(qǐng)人對(duì)主要原材料進(jìn)行了供應(yīng)商的選擇，通過功能性實(shí)驗(yàn)篩選出合格供應(yīng)商，制定了各主要原材料的技術(shù)要求和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)并經(jīng)檢驗(yàn)合格。2.企業(yè)參考品和對(duì)照品的設(shè)置情況該產(chǎn)品企業(yè)參考品包括陽性參考品、陰性參考品、檢測(cè)限參考品和重復(fù)性參考品，均由臨床樣本制備而成。陽性參考品：8份，來源于試劑盒涵蓋的不同臨床分期和病理分級(jí)的尿路上皮癌樣本。陰性參考品：5份，來源于試劑盒檢測(cè)范圍外的其他泌尿系統(tǒng)良惡性疾病樣本。檢測(cè)限參考品：2份，分別為產(chǎn)品檢出限參考品和基因表達(dá)檢出限參考品。重復(fù)性參考品：4份，包含弱陽性、強(qiáng)陽性濃度水平的產(chǎn)品重復(fù)性參考品和基因表達(dá)重復(fù)性參考品。基因表達(dá)檢出限參考品和重復(fù)性參考品均由臨床尿路上皮癌RNA樣本經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA后，采用數(shù)字PCR方法測(cè)定拷貝數(shù)后進(jìn)行制備而成；其余參考品均由臨床樣本提取的RNA制備而成。該試劑盒同時(shí)設(shè)置了陽性對(duì)照和陰性對(duì)照，用于檢測(cè)過程中試劑和儀器的質(zhì)量控制。此外，每個(gè)樣本均檢測(cè)內(nèi)參基因，用于結(jié)果的判讀及評(píng)估樣本的質(zhì)量。（二）生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系研究申請(qǐng)人對(duì)試劑盒反應(yīng)體系的研究包括引物探針濃度、PCR擴(kuò)增預(yù)混液用量、逆轉(zhuǎn)錄酶和逆轉(zhuǎn)錄預(yù)混試劑用量的確定等；對(duì)反應(yīng)條件的研究包括逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)程序、PCR反應(yīng)程序和基線的確定等；對(duì)樣本采集處理、樣本保存時(shí)間、樣本用量和核酸提取進(jìn)行了研究。通過功能性實(shí)驗(yàn)，最終確定了最佳的反應(yīng)體系。申請(qǐng)人根據(jù)試劑盒中試劑及組件的主要生產(chǎn)工藝的研究結(jié)果，確定了最佳的生產(chǎn)工藝。（三）分析性能評(píng)估該產(chǎn)品分析性能評(píng)估內(nèi)容包括準(zhǔn)確度、分析特異性（交叉反應(yīng)和干擾物質(zhì)研究）、檢出限和精密度。1.準(zhǔn)確度研究在準(zhǔn)確度研究中，申請(qǐng)人收集了若干例經(jīng)臨床確診為尿路上皮癌或泌尿系統(tǒng)其他良惡性疾病的臨床樣本，進(jìn)行真實(shí)臨床樣本的陽性/陰性符合率的測(cè)試，以評(píng)估產(chǎn)品檢測(cè)的準(zhǔn)確度。測(cè)試結(jié)果符合要求。2.分析特異性分析特異性研究采用三批次試劑盒進(jìn)行了交叉反應(yīng)和干擾物在交叉反應(yīng)研究中，申請(qǐng)人對(duì)臨床確診為非尿路上皮癌的樣本，包括泌尿系統(tǒng)良性病變和其他泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤；以及對(duì)靶基因的同源序列進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果均顯示申報(bào)產(chǎn)品無交叉反應(yīng)。在干擾物質(zhì)研究中，申請(qǐng)人對(duì)18種與尿液相關(guān)的內(nèi)源和外源性潛在干擾物質(zhì)（血、葡萄糖、蛋白質(zhì)、乙醇、氯化鈉、血紅蛋白、左氧氟沙星、布洛芬、維生素C、大腸桿菌、白色念球菌、金黃色葡萄球菌、淋球菌、解脲脲原體、絲裂霉素、吡柔比星、吉西他濱、卡介苗）進(jìn)行了不同濃度下的對(duì)比測(cè)試，分析干擾物質(zhì)在高濃度條件下對(duì)樣本檢測(cè)結(jié)果的影響，結(jié)果表明產(chǎn)品特異性良好，均未產(chǎn)生非特異性反應(yīng)。3.檢出限研究檢出限研究包括產(chǎn)品檢出限和基因表達(dá)檢出限研究。申請(qǐng)人采用多例樣本和多批試劑分別進(jìn)行了建立和驗(yàn)證研究，建立確定產(chǎn)品檢出限為RNA濃度不高于6.5ng/μL，基因表達(dá)檢出限為不高于40拷貝/μL；并使用三批次試劑盒進(jìn)行驗(yàn)證，均符合要求。4.精密度在精密度研究中，申請(qǐng)人采用三批次試劑盒對(duì)不同的臨床樣本進(jìn)行連續(xù)檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)其檢測(cè)結(jié)果，并對(duì)批內(nèi)、批間、日內(nèi)、日間、不同操作者以及實(shí)驗(yàn)室間精密度等進(jìn)行了評(píng)價(jià)。研究結(jié)果表明，各基因擴(kuò)增Ct值的變異系數(shù)CV均不高于5%，檢測(cè)結(jié)果（綜合評(píng)分）的變異系數(shù)CV均不高于15%。對(duì)三批次試劑盒采用企業(yè)強(qiáng)陽性產(chǎn)品重復(fù)性參考品和弱陽性產(chǎn)品重復(fù)性參考品進(jìn)行重復(fù)性檢測(cè)，每批試劑盒每份參考品重復(fù)檢測(cè)10次，檢測(cè)結(jié)果均一致。對(duì)三批次試劑盒采用企業(yè)強(qiáng)陽性基因表達(dá)重復(fù)性參考品和弱陽性基因表達(dá)重復(fù)性參考品進(jìn)行重復(fù)性檢測(cè)，每批試劑盒每份參考品重復(fù)檢測(cè)10次，每個(gè)靶基因的Ct值變異系數(shù)CV均不高于5%。（四）陽性判斷值研究本研究分為陽性判斷值的建立和驗(yàn)證兩部分。納入的陽性病例120例，包括膀胱尿路上皮癌、腎盂尿路上皮癌和輸尿管尿路上皮癌；陰性病例共納入192例，包括泌尿系統(tǒng)良性病變、泌尿系統(tǒng)其他腫瘤等，共計(jì)312例。本產(chǎn)品根據(jù)各基因檢測(cè)結(jié)果Ct值，使用《尿路上皮癌基因分析軟件》計(jì)算分析獲得樣本的綜合評(píng)分。采用ROC曲線分析對(duì)綜合評(píng)分進(jìn)行分析，確定本產(chǎn)品的陽性判斷值：綜合評(píng)分50；然后再采用驗(yàn)證集進(jìn)行獨(dú)立樣本驗(yàn)證，確認(rèn)本試劑盒的陽性判斷值設(shè)置合理。（五）穩(wěn)定性研究申請(qǐng)人對(duì)產(chǎn)品的貨架穩(wěn)定性（實(shí)時(shí)穩(wěn)定性）、運(yùn)輸穩(wěn)定性和使用穩(wěn)定性（包括開瓶穩(wěn)定性、凍融穩(wěn)定性）及樣本穩(wěn)定性進(jìn)行貨架有效期穩(wěn)定性：將三批次試劑盒置于規(guī)定儲(chǔ)存條件下保存，分別于不同時(shí)間點(diǎn)領(lǐng)取完整包裝的試劑盒，使用企業(yè)參考品對(duì)試劑盒的性能進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明試劑盒產(chǎn)品有效期為12個(gè)此外，申請(qǐng)人對(duì)產(chǎn)品的運(yùn)輸穩(wěn)定性、使用穩(wěn)定性和樣本穩(wěn)定性分別進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示，產(chǎn)品的性能均滿足產(chǎn)品說明書的三、臨床評(píng)價(jià)概述申請(qǐng)人在復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院、浙江省人民醫(yī)院、浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院3家臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)進(jìn)行臨床試驗(yàn)，采用試驗(yàn)體外診斷試劑與臨床參考標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較研究，確認(rèn)本產(chǎn)品的臨床性能。其中，尿路上皮癌和其他惡性腫瘤病例采用病理診斷確診，其他疾病根據(jù)相關(guān)診療指南進(jìn)行綜合診斷確診。入組病例包括：有血尿、膀胱刺激癥等臨床癥狀的病例，或經(jīng)影像學(xué)等非侵入性方法顯示異常，臨床需進(jìn)一步檢查的疑似尿路上皮癌初診患者，以及經(jīng)影像學(xué)等非侵入性方法無法決策是否進(jìn)行鏡檢的病例。樣本類型為尿液。臨床試驗(yàn)共納入臨床有效病例955例，其中尿路上皮癌病例338例（覆蓋尿路上皮癌的所有分期及病理分型），非尿路上皮癌的其他病例617例（包括其他易產(chǎn)生干擾的腫瘤及各種良性疾病病例）。試驗(yàn)結(jié)果顯示：本產(chǎn)品臨床靈敏度為95.86%（95%CI：93.17%-97.52%），臨床特異度為94.49%（95%CI：92.40%-96.03%），總符合率為94.97%（95%CI：93.40%-96.19%）。上述結(jié)果顯示試驗(yàn)體外診斷試劑具有較好的臨床靈敏度和特異度，滿足臨床使用需求。此外，采用試驗(yàn)體外診斷試劑對(duì)41例尿路上皮癌患者手術(shù)前后的樣本進(jìn)行監(jiān)測(cè)，41例樣本術(shù)前檢測(cè)結(jié)果為陽性，其中39例術(shù)后檢測(cè)結(jié)果為陰性；2例術(shù)后檢測(cè)結(jié)果仍為陽性。結(jié)果表明尿路上皮癌患者手術(shù)切除后尿液中mRNA水平降低。綜上所述，臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示該產(chǎn)品臨床性能滿足技術(shù)審四、產(chǎn)品受益風(fēng)險(xiǎn)判定根據(jù)《YY/T0316-2016醫(yī)療器械風(fēng)險(xiǎn)管理對(duì)醫(yī)療器械的應(yīng)用》及其內(nèi)部質(zhì)量管理體系規(guī)定執(zhí)行風(fēng)險(xiǎn)管理相關(guān)活動(dòng)，對(duì)該產(chǎn)品進(jìn)行受益風(fēng)險(xiǎn)判定。（一）受益評(píng)估本產(chǎn)品采用熒光PCR方法對(duì)上述8個(gè)基因的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，適用于有血尿、膀胱刺激癥等臨床癥狀，或經(jīng)影像學(xué)等非侵入性方法顯示異常，臨床可能需進(jìn)一步檢查的疑似尿路上皮癌初診患者的輔助診斷，尤其是經(jīng)影像學(xué)等非侵入性方法無法決策病例是否進(jìn)行鏡檢的輔助診斷，可為患者提供一種尿路上皮癌的無創(chuàng)輔助診斷選擇，但不能作為腫瘤早期診斷或確診的依據(jù)。臨床醫(yī)生應(yīng)結(jié)合患者病情及其他實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)指標(biāo)等因素對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行綜合判斷。臨床應(yīng)用的主要受益為：該產(chǎn)品為臨床上疑似尿路上皮癌患者提供了一種輔助診斷方法的選擇。依據(jù)現(xiàn)有的臨床試驗(yàn)結(jié)果，其對(duì)尿路上皮癌的診斷性能與臨床參考標(biāo)準(zhǔn)相比，具有較好的一致性，可滿足臨床應(yīng)用基本要求。（二）風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估申請(qǐng)人對(duì)已知危險(xiǎn)（源）進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)，按照風(fēng)險(xiǎn)可接受準(zhǔn)則判斷每個(gè)危險(xiǎn)（源）的風(fēng)險(xiǎn)是否達(dá)到可接受水平，對(duì)合理可行降低的風(fēng)險(xiǎn)、不經(jīng)過風(fēng)險(xiǎn)/收益分析既判定為不可接受的風(fēng)險(xiǎn)采取控制措施，并對(duì)具體措施進(jìn)行實(shí)施驗(yàn)證，同時(shí)重新對(duì)采取措施后的風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行估計(jì)，確認(rèn)其風(fēng)險(xiǎn)水平是否可接受。盡管目前認(rèn)為該試劑盒的受益大于風(fēng)險(xiǎn)，但為保證用械安全，基于對(duì)主要剩余風(fēng)險(xiǎn)的防控，已在該試劑盒說明書中提示以下信1.預(yù)期用途本產(chǎn)品采用熒光PCR方法對(duì)上述8個(gè)基因的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，適用于有血尿、膀胱刺激癥等臨床癥狀，或經(jīng)影像學(xué)等非侵入性方法顯示異常，臨床可能需進(jìn)一步檢查的疑似尿路上皮癌初診患者的輔助診斷，尤其是經(jīng)影像學(xué)等非侵入性方法無法決策病例是否進(jìn)行鏡檢的輔助診斷，可為患者提供一種尿路上皮癌的無創(chuàng)輔助診斷選擇，但不能作為腫瘤早期診斷或確診的依據(jù)。臨床醫(yī)生應(yīng)結(jié)合患者病情及其他實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)指標(biāo)等因素對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行綜合判斷。2.警示及注意事項(xiàng)：該試劑盒說明書中明確了該試劑盒檢驗(yàn)方法的局限性及使用中的注意事項(xiàng)。依據(jù)《醫(yī)療器械監(jiān)督管理?xiàng)l例》（國(guó)務(wù)院令第739號(hào)）、《體外診斷試劑注冊(cè)與備案管理辦法》（國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局令第48號(hào)）等相關(guān)醫(yī)療器械法規(guī)與配套規(guī)章，經(jīng)對(duì)申請(qǐng)人提交的注冊(cè)申報(bào)材料進(jìn)行系統(tǒng)評(píng)價(jià)，申報(bào)產(chǎn)品符合安全性、有效性的要求，符合現(xiàn)有認(rèn)知水平，建議準(zhǔn)予注冊(cè)。通用名稱：尿路上皮癌相關(guān)8種基因檢測(cè)試劑盒（PCR熒本產(chǎn)品采用熒光PCR方法對(duì)上述8個(gè)基因的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，適用癥等臨床癥狀，或經(jīng)影像學(xué)等非侵入性方法顯示異常，臨床可能需進(jìn)皮癌初診患者的輔助診斷，尤其是經(jīng)影像學(xué)等非侵入性方法無法決策病助診斷，可為患者提供一種尿路上皮癌的無創(chuàng)輔助診斷選擇，但不能診的依據(jù)。臨床醫(yī)生應(yīng)結(jié)合患者病情及其他實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)指標(biāo)等因素尿路上皮癌的診斷主要依靠尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查和膀胱鏡/輸尿管鏡檢查等是診斷尿路上皮癌最可靠的方法，但是內(nèi)鏡檢查是侵入性檢查，不僅適，還可能造成感染和創(chuàng)傷[2,3]。隨著測(cè)序和芯片技術(shù)的發(fā)展，研究表明，液中的高頻率以及基因表達(dá)譜的信息性，通過尿液樣本進(jìn)行RNA表達(dá)譜檢測(cè)可癌的檢測(cè)[4]。通過核酸提取試劑提取尿液脫落細(xì)胞中的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反采用雙重PCR分別檢測(cè)8個(gè)尿路上皮癌相關(guān)靶基因，每個(gè)反應(yīng)管分別檢測(cè)1個(gè)靶源管家基因（GAPDH）的表達(dá)水平，通過ΔCt值反映細(xì)胞中8個(gè)靶基因的表達(dá)水平。人源基因GAPDH作為內(nèi)部參照（以下簡(jiǎn)稱內(nèi)參，InternalControl（IC系統(tǒng)，對(duì)樣本RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄和PCR反應(yīng)過程進(jìn)行質(zhì)量控制并通過TaqMan探針對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，在實(shí)時(shí)熒光PCR圖1檢測(cè)流程圖表1試劑盒組成及組分表編號(hào)1劑2液3Mg2+4條567探針引物預(yù)混條采用8聯(lián)PCR管設(shè)計(jì)，每一個(gè)8聯(lián)PCR管可檢測(cè)1份樣本，8聯(lián)PCR管上標(biāo)1-8（8聯(lián)PCR管示意圖請(qǐng)見圖2）。8聯(lián)PCR管1-8號(hào)管內(nèi)裝有相應(yīng)的尿（Gene1~Gene8）和內(nèi)參基因（GAPDH）檢測(cè)試劑（IC尿路上皮癌相關(guān)基因探編號(hào)檢測(cè)試劑熒光信號(hào)123456782）核酸提取或純化試劑：杭州可幫基因科技有限公司的尿液脫落細(xì)胞RNA提取試劑盒（吸3）分析軟件：杭州可幫基因科技有限公司的尿路上皮癌基因分析軟件，醫(yī)療器械注冊(cè)證書編微量紫外分光光度計(jì)、掌上離心機(jī)（帶適用于8聯(lián)PCR管的轉(zhuǎn)子）、移液器、4.運(yùn)輸條件：本試劑盒可在-15℃~-25℃溫度下運(yùn)輸；也可在泡沫箱加冰袋的條件下運(yùn)輸，箱時(shí)溫度應(yīng)不超過8℃,運(yùn)輸時(shí)間不超過84小時(shí)。本試劑盒適用于西安天隆科技有限公司的全自動(dòng)醫(yī)用PCR分析系統(tǒng)（Gentier96E）。2.樣本收集和保存：直接采用杭州可幫基因科技有限公司的樣本保存液（浙杭械備20201184號(hào)）進(jìn)行尿液收集和保存。樣本保存液被預(yù)置分裝在材質(zhì)為聚烯烴塑料的收集管中，規(guī)格為4mL/瓶。使用裝有樣本保存液的收集管直接3.使用杭州可幫基因科技有限公司的尿液脫落細(xì)胞RNA提取試劑盒（吸附柱法浙杭械備/3）取1μLRNA溶液，測(cè)定其濃度和純度。RNA濃度應(yīng)≥6.5ng/μL且RNA吸注意：1）微量紫外分光光度計(jì)，其RNA吸收光譜的掃描波長(zhǎng)范圍應(yīng)涵蓋220nm-2）可根據(jù)計(jì)算公式計(jì)算RNA濃度或微量紫外分光光度計(jì)直接給出濃度所需檢測(cè)樣本數(shù)量按下表比例計(jì)算，并在無核酸酶的離心管/PCR管中配個(gè)待測(cè)樣本RNA上樣濃度應(yīng)≥6.5ng/μL；每次檢測(cè)應(yīng)），體積(μL）/管422.2將所有反應(yīng)管充分混勻，≥5000rpm瞬時(shí)離心10秒，放入PCR儀或恒溫金屬浴中進(jìn)行表3逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)程序∞2.3逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)完成后，反應(yīng)產(chǎn)物cDNA溶液可用于后續(xù)PCR擴(kuò)增，若不能立即進(jìn)行擴(kuò)增將cDNA溶液存放在2℃~8℃,保存時(shí)間不宜超過24小時(shí)；或者-15℃~-25℃保存，保存時(shí)間不3.1取離心管或PCR管，在管中加入：90μLPCR擴(kuò)增預(yù)混液、20μL待測(cè)樣本的cDNA和33.2將探針引物預(yù)混條解凍，≥5000rpm轉(zhuǎn)速離心1分鐘，使得每個(gè)反應(yīng)孔3.3使用移液器吸取步驟3.1中的混合液16μL，分別加入至探針引物預(yù)混條4.1將探針引物預(yù)混條放入熒光PCR儀；其中1號(hào)管朝上放置。對(duì)應(yīng)PCR反應(yīng)布局見表4。123…1…2…3…4…5…6…7…8…4.3選擇“樣本設(shè)置”，樣本類型設(shè)定為“待測(cè)”。選擇熒光信號(hào)“FAM”和“V“ROX”。本試劑盒內(nèi)包含陽性對(duì)照品和陰性對(duì)照品作為質(zhì)控，應(yīng)在每批次檢測(cè)中添加，通過質(zhì)控情況采用《尿路上皮癌基因分析軟件》進(jìn)行分析，綜合評(píng)分應(yīng)≥85，判讀結(jié)果為尿<30<36<27<31<33<36<36<38陰性對(duì)照品的內(nèi)參基因的Ct值均應(yīng)≤30；將檢測(cè)結(jié)果采用《尿路上皮癌5.4待測(cè)樣本的內(nèi)參基因的Ct值應(yīng)≤30，如果不符合，說明該樣本RNA可能存5.5待測(cè)樣本應(yīng)至少有1個(gè)靶基因Ct值（FAM38，如果不符合，說明該樣本RNA未能提供6.2打開《尿路上皮癌基因分析軟件》（軟件版本：1.0）客戶端，上傳P6.3《尿路上皮癌基因分析軟件》自動(dòng)分析PCR數(shù)據(jù)，獲得分析結(jié)果（見圖3尿路上皮癌基因本產(chǎn)品根據(jù)各基因檢測(cè)結(jié)果Ct值，使用《尿路上皮癌基因分析本產(chǎn)品共采用312例臨床尿液樣本（尿路上皮癌陽性樣本12），ROC曲線下面積─約登指數(shù)法，進(jìn)行陽性判斷值的確定與驗(yàn)證研究。陽性樣本包括皮癌、腎盂尿路上皮癌、輸尿管尿路上皮癌；陰性樣本包括泌尿系統(tǒng)良性病變、綜合評(píng)分≥50，判定為尿路上皮癌陽性；綜合評(píng)分＜50，判定為尿路圖3尿路上皮癌基因檢測(cè)結(jié)果圖2.不合理的樣本采集、轉(zhuǎn)運(yùn)及處理，以及不當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)操作和實(shí)驗(yàn)環(huán)境均有可能1)試劑盒應(yīng)組分齊全，包裝外觀清潔、無泄漏、無破損；標(biāo)識(shí)、標(biāo)簽字跡清楚。試劑融化4)最低檢測(cè)限：檢測(cè)1份濃度3次，每個(gè)靶基因的Ct值均應(yīng)＜38。5)精度密：通過檢測(cè)產(chǎn)品重復(fù)性參考品、基因表達(dá)重復(fù)性參考品和臨床樣本對(duì)本試劑盒的②檢測(cè)2份基因表達(dá)重復(fù)性參考品，各重復(fù)檢測(cè)10次③檢測(cè)臨床樣本，評(píng)價(jià)本試劑盒不同重復(fù)、批次、時(shí)間、儀器、操作者和地點(diǎn)間的精6)分析特異性：檢測(cè)非尿路上皮癌的其他泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤臨床樣本，均未發(fā)生交叉反應(yīng)；檢測(cè)泌尿系統(tǒng)良性疾病樣本，均未發(fā)生交叉反應(yīng)；檢測(cè)相關(guān)靶基因的同源序列，均未發(fā)生交叉反應(yīng)。檢測(cè)以下：血液（2%v/v）、葡萄糖（55mmol/L）、蛋白質(zhì)（4g/L），左氧氟沙星（200mg/dL）、布洛芬（10mg/dL），維生素C（0.8mmol/L），白色念珠菌（1×109CFU/mL）、大腸桿菌（1×109CFU/mL）、金黃色葡萄球菌（1×109CFU/mL）、淋球菌（1×107CFU/mL）、解脲脲原體（5×106CFU/mL），絲裂霉素（200mg/L）、吡柔比星（170mg/L）、吉西他濱（6700mg/L）、卡介苗（400m