備案號：DB42TechniqueguidelineondrugsensitivitytestofMycoplasmabovisinvitro湖北省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布I 1 1 1 1 2 2 2 2 3 3 4 6 7 9牛支原體(Mycoplasmabovis,M.bovis)是牛的一種重要病1牛支原體體外藥物敏感性檢測操作規(guī)程本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了牛支原體體外藥物敏感性檢測技術(shù)的縮略語、原理和操作步驟GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和CLSIM100-S22抗生素敏感性檢測操作標(biāo)準(zhǔn)Performancestandardsforantimicrobial3.2PPLO胸膜肺炎樣微生物Pleuropnenmonia-likeOr3.4CCU顏色變化單位Col3.5ATCC美國菌種保藏中心AmericanTypeCultureColl菌或殺菌作用時，因無牛支原體生長，培養(yǎng)抗生素抑制牛支原體生長的強弱以最低抑菌濃度(MIC)表示，用微量肉湯稀釋法測2改變檢測管顏色的藥物最高稀釋倍數(shù)所對應(yīng)5.1儀器與耗材Ⅱ級生物安全柜，二氧化碳培養(yǎng)箱，96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，微量可調(diào)移液器及標(biāo)準(zhǔn)菌株：美國微生物菌種保藏中心牛支原體參考株M.bovisPG45（ATCC255235.3操作步驟根據(jù)抗菌藥特性，用相應(yīng)溶劑（如1M氫氧化鈉、乙醇或去離子水）將抗菌藥溶解，然后用去離子水將抗菌藥稀釋成1mg/mL的儲存液，-80℃保存。使用前將儲存液用去離子水稀釋至所需工作液濃度，4℃保存?zhèn)溆茫魉幬镔A存液配制方法參照CLSIM100-S22，將保存于-20℃含20%甘油的菌液取出，吸取100μL將牛支原體用PPLO液體培養(yǎng)基作10倍遞增稀釋，置于普通培養(yǎng)箱中37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48單位，表示為CCU/mL，具體操作見附錄B.1。采用微量肉湯稀釋法測定牛支原體最低抑菌濃度。在96孔板內(nèi)，第1～9列每孔加入100CCUPPLO液體培養(yǎng)基pH值7.6，第1列加入工作濃度的抗菌藥，混勻后從各孔中取1稀釋至第9列，第9列棄去100μL，使生長陽性對照；第11列各孔加入200μLpH值6.8PPLO培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，菌量約為108～109CCU/m預(yù)先稀釋好的菌液；第10列加入100μL菌液；第11列和第12列不加菌3計算對應(yīng)孔的抗菌溶度(μg/mL）。.5.4結(jié)果判斷I)和耐藥（Resistant,R），判斷值參見附錄C表C.2。當(dāng)質(zhì)5.5實驗廢棄物的處理含抗生素的試驗廢棄物，按GB18597標(biāo)準(zhǔn)中的相關(guān)要求進(jìn)行收集和貯存，由具有資質(zhì)的專業(yè)機構(gòu)4 本附錄規(guī)定了抗菌藥工作濃度的配制方法以及PPLO培養(yǎng)基配制方法，以下試劑除特殊說明外，均A.1抗菌藥配制A.1.1注意事項基團的分子量為331.4g/mol，校正系數(shù)為33丙沙星時，只相當(dāng)于4.415mg環(huán)丙沙星基團（5mg*0.883=4.415mg）。將5mg鹽酸環(huán)丙沙星溶抗菌藥溶液定容前，將pH值調(diào)至7.0，以避免導(dǎo)致牛支原體培養(yǎng)物出現(xiàn)非特異性顏色A.1.2溶劑和稀釋液的配制參照CLSIM100-S22配制，具體見表A.1。表A.1抗菌藥貯存液與工作液配制所選擇水水1是水水1是水1是水水1是水水1否水5否水1否水1否5水1否水水1否水水1否水1否水3是水水1是水水1是水1是水水1否水水1否A.2PPLO培養(yǎng)基配制115℃滅菌高壓滅菌20min后，待溫40萬單位/mL青霉素溶液1mL，無菌1%酚紅溶液500μL（僅液體培養(yǎng)基加），pH值7.6。6測菌液，充分混勻后，吸取100μL加入第2管，混勻，再吸取100μL加入第3管，依此類推，到最后1標(biāo)準(zhǔn)，即如果第5管為最后發(fā)生顏色變化管，則顏色變化單位為7變顏色（圖C.1）的藥物最高稀釋倍數(shù)對應(yīng)管的抗菌藥濃度(μg/mL）即為MIC。藥（Resistant,R）。各藥物的具體判8藥物濃度(μg/mL）2a>8a>8a24-48a848a8a8--b達(dá)氟沙星與恩諾沙星的判斷標(biāo)準(zhǔn)引自于TerLaaketal.,1992a,b;1993，其它藥物的判斷標(biāo)準(zhǔn)均來自于CLSI9［1］TerLaak,E.A.,Noordergraaf,J.H.,Dieltjes,R.P.J.W..PrevalenceofmycoplasmasintherTractsofpneumoniccalves.JournalofVeterinaryMedicine.SeriesB,1992a,39(8),553–562.［2］TerLaak,E.A.,Noordergraaf,J.H.,Boomsluiter,E..Thenasalmycoplasmal?oraofhealthycalvesand［1］cows.JournalofVeterinaryMedicine.SeriesB,［