乳酸菌介導人胰島素基因表達及對非肥胖糖尿病小鼠的治療潛力探究一、引言1.1研究背景糖尿病是一種由于胰島素分泌缺陷或其生物作用受損，或兩者兼有引起的以高血糖為特征的代謝性疾病。近年來，隨著生活方式的改變和老齡化進程的加速，糖尿病的發病率呈逐年上升趨勢，已成為全球性的公共衛生問題。國際糖尿病聯盟（IDF）發布的數據顯示，2021年全球約有5.37億成年人患有糖尿病，預計到2045年，這一數字將增長至7.83億。在中國，糖尿病患者人數也在不斷增加，據統計，2021年中國糖尿病患者人數已超過1.4億，患病率高達12.8%。目前，胰島素注射是治療糖尿病的主要手段之一，它能夠有效地控制血糖水平，減少糖尿病并發癥的發生風險。然而，胰島素注射存在諸多不便之處，如需要頻繁注射，給患者帶來身體上的痛苦和心理上的負擔；患者對注射操作的熟練程度和規范程度要求較高，操作不當可能會影響胰島素的吸收和療效；長期注射還可能導致注射部位脂肪增生、硬結等不良反應，影響胰島素的吸收效果。口服胰島素作為一種更為便捷、患者依從性更高的治療方式，具有諸多優勢。從生理角度來看，口服胰島素經胃腸道吸收后，由門靜脈循環進入肝臟，更加符合胰島素的正常生理狀態，能夠更好地模擬胰島素的生理性分泌模式，對血糖的控制更加平穩。在便利性方面，口服給藥避免了注射的痛苦，患者無需掌握復雜的注射技術，提高了患者的用藥依從性，有助于患者長期堅持治療。同時，口服胰島素還可相對減少與胰島素全身治療相關的體重異常增加現象，在一定程度上減輕了患者的身體負擔。實現口服胰島素的關鍵在于找到合適的表達系統和遞送載體。乳酸菌作為一種常見的益生菌，通常被認為是安全的（GRAS），具有諸多作為表達系統的優勢。在基因操作方面，某些乳酸菌菌種本身帶有大量的染色體外因子，易于發展新的表達載體系統，且其遺傳操作方法成熟、簡便，效率高、重復性好，為外源基因的導入和表達提供了便利條件。從安全性角度，乳酸菌是食品級細菌，易于構建成食品級的基因克隆及表達系統，表達的外源蛋白無需經過純化，可以直接連同菌體一起服用，有效提高了基因工程產品的安全性，降低了潛在的健康風險。從表達特性來看，乳酸菌本底表達水平低，但表達量較高，易于純化，且具有強烈的高度可調控的啟動子系統，可在細胞內表達，也可在細胞表面進行展示表達或分泌到細胞外，能夠滿足不同的研究和應用需求。此外，乳酸菌的某些菌株如乳桿菌對機體粘膜有極強的粘附作用，乳酸菌表達與治療或免疫作用的蛋白可以源源不斷在粘膜處生產，持續向機體釋放目的抗原蛋白，能有效引起機體的免疫應答和免疫耐受，提高對人、畜的免疫作用，是一種極具廣泛應用前景的、理想的抗原呈遞載體。將人胰島素基因在乳酸菌中進行表達，并探索其口服對非肥胖糖尿病小鼠的作用，具有重要的研究意義和潛在的應用價值。一方面，通過研究人胰島素基因在乳酸菌中的表達機制和表達條件，優化表達系統，有望提高胰島素的表達量和活性，為口服胰島素的研發提供技術支持；另一方面，通過觀察口服表達人胰島素的乳酸菌對非肥胖糖尿病小鼠的血糖控制、免疫調節等方面的作用，深入了解其治療糖尿病的效果和作用機制，為開發新型的糖尿病口服治療藥物奠定理論基礎。1.2研究目的與意義本研究旨在實現人胰島素基因在乳酸菌中的高效表達，并深入探究其口服對非肥胖糖尿病小鼠的作用及機制。通過密碼子優化和基因工程技術，將人胰島素基因導入乳酸菌中，構建穩定高效的表達系統，提高胰島素的表達量和活性，為口服胰島素的研發提供關鍵技術支持。通過動物實驗，觀察口服表達人胰島素的乳酸菌對非肥胖糖尿病小鼠血糖水平、免疫調節以及胰島細胞功能的影響，明確其治療糖尿病的效果和作用機制，為開發新型糖尿病口服治療藥物奠定堅實的理論基礎。本研究對于推動糖尿病治療領域的發展具有重要的理論和實踐意義。在理論層面，深入研究人胰島素基因在乳酸菌中的表達機制以及口服表達人胰島素的乳酸菌對非肥胖糖尿病小鼠的作用機制，有助于揭示乳酸菌作為口服胰島素遞送載體的潛在優勢和作用規律，為糖尿病治療的理論研究提供新的視角和思路，豐富和完善糖尿病治療的相關理論體系。在實踐應用方面，開發口服胰島素治療方法能夠顯著提高糖尿病患者的用藥依從性，減輕患者因頻繁注射胰島素帶來的痛苦和心理負擔，為糖尿病患者提供更加便捷、舒適的治療選擇。研究成果還有助于推動新型糖尿病治療藥物的研發和產業化進程，為糖尿病的臨床治療提供更多有效的手段，降低糖尿病并發癥的發生風險，提高患者的生活質量，具有廣闊的應用前景和巨大的社會經濟效益。二、人胰島素基因與乳酸菌表達系統2.1人胰島素基因結構與功能人胰島素基因位于第11對染色體短臂上，其結構與功能對于維持人體正常的血糖平衡起著關鍵作用。從基因結構來看，人胰島素基因在β細胞的細胞核中，首先進行轉錄過程，即DNA向mRNA轉錄。轉錄產生的mRNA從細胞核移向細胞漿的內質網，在這一過程中，mRNA攜帶了胰島素基因的遺傳信息，是后續蛋白質合成的重要模板。在細胞漿的內質網中，mRNA轉譯成由105個氨基酸殘基構成的前胰島素原。前胰島素原是胰島素合成過程中的前體物質，它經過蛋白水解作用去除其前肽，生成86個氨基酸組成的長肽鏈胰島素原。胰島素原隨細胞漿中的微泡進入高爾基體，在高爾基體中，經蛋白水解酶的作用，切去由三個精氨酸連接的鏈，斷鏈生成沒有活性的C肽，同時生成具有生物活性的胰島素，隨后胰島素分泌到β細胞外，進入血液循環中。胰島素由A、B兩個肽鏈組成，人胰島素A鏈有11種21個氨基酸，B鏈有15種30個氨基酸，共26種51個氨基酸組成。其中A7（Cys）-B7（Cys）、A20（Cys）-B19（Cys）四個半胱氨酸中的巰基形成兩個二硫鍵，使A、B兩鏈連接起來，此外A鏈中A6（Cys）與A11（Cys）之間也存在一個二硫鍵。這些特殊的結構使得胰島素能夠發揮其調節血糖的功能。胰島素的主要功能是調節血糖水平，它通過與細胞表面的胰島素受體結合，激活一系列細胞內信號通路，促進細胞對葡萄糖的攝取和利用，從而降低血糖濃度。胰島素還能抑制肝臟中糖原的分解和糖異生作用，減少葡萄糖的生成和釋放，進一步維持血糖的穩定。在正常生理狀態下，當血糖濃度升高時，胰島β細胞會分泌胰島素，使血糖水平下降；當血糖濃度降低時，胰島素分泌減少，以維持血糖的動態平衡。如果胰島素分泌不足或其作用受損，就會導致血糖升高，引發糖尿病等代謝性疾病。因此，人胰島素基因及其表達產物胰島素在維持人體代謝平衡和健康方面具有不可或缺的關鍵作用，對于糖尿病的發生發展和治療干預都具有重要的意義。2.2乳酸菌作為表達宿主的優勢乳酸菌在食品工業中具有廣泛的應用基礎，其在發酵乳制品、肉制品、蔬菜制品等多種食品的生產過程中發揮著關鍵作用。在乳制品領域，酸奶的制作通常以牛乳或奶粉為原料，經巴氏殺菌后冷卻，接種適量的乳酸菌發酵劑，如保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌、嗜熱鏈球菌等，這些乳酸菌發酵產生乳酸，使牛奶凝固并賦予酸奶獨特的風味和口感；干酪的制作也是利用乳酸菌發酵使蛋白質凝固，排除乳清后將凝塊壓成塊狀。在肉制品生產中，乳酸菌主要用于發酵香腸，傳統發酵香腸依靠微生物自然發酵，但現代生產工藝會添加微生物純培養的乳酸菌發酵劑，如植物乳桿菌、彎曲乳桿菌、乳酸乳桿菌等，以保證乳酸菌在發酵和成熟過程中的優勢地位，確保產品的安全和質量。在蔬菜深加工方面，泡酸菜的酸味主要由乳酸菌產生，自然發酵泡菜利用附生在植物表面的乳酸菌，在前期以異型乳酸菌發酵為主，中后期以耐酸的正型發酵乳酸菌活動為主，常見的乳酸菌有植物乳桿菌、黃瓜乳桿菌等；蔬菜乳酸發酵飲料則多使用保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌進行混合發酵。這些應用不僅體現了乳酸菌在食品工業中的重要性，也為其作為基因工程表達宿主提供了實踐基礎。安全性方面，乳酸菌通常被認為是安全的（GRAS），這一特性使其成為理想的表達宿主。它是食品級細菌，易于構建成食品級的基因克隆及表達系統。與其他表達系統相比，乳酸菌表達的外源蛋白無需經過復雜的純化過程，可以直接連同菌體一起服用，這大大提高了基因工程產品的安全性，減少了潛在的健康風險。在一些活菌疫苗的研究中，利用乳酸菌作為載體表達抗原蛋白，由于其安全性高，即使活菌進入人體也不會對健康造成危害，還能利用乳酸菌在腸道中的定植特性，持續刺激機體產生免疫反應。在表達外源基因方面，乳酸菌具有多方面優勢。某些乳酸菌菌種本身帶有大量的染色體外因子，如質粒等，這些因子易于發展新的表達載體系統。其遺傳操作方法成熟、簡便，通過電穿孔等技術可以高效地將外源基因導入乳酸菌中，且操作的重復性好，能夠穩定地獲得重組菌株。乳酸菌具有強烈的高度可調控的啟動子系統，如乳鏈球菌素調控表達系統（NICE），組氨酸激酶NisK作為nisin的傳感器，NisR蛋白作為反應調節子激活靶基因的轉錄，該系統表達的產物可以達到細胞總蛋白的10%-60%，產量提高數千倍。乳酸菌可以在細胞內表達外源基因，也能通過特定的信號肽序列將外源蛋白分泌到細胞外，還可利用表面展示技術將蛋白錨定在乳酸菌的細胞膜或者細胞壁上，不同的表達形式能滿足不同的研究和應用需求。一些研究將抗原蛋白在乳酸菌表面展示表達，用于黏膜免疫研究，利用乳酸菌對機體粘膜的粘附作用，使抗原蛋白在粘膜處持續釋放，有效引起機體的免疫應答。2.3乳酸菌表達系統關鍵要素表達載體的構建是實現人胰島素基因在乳酸菌中有效表達的基礎。常用的乳酸菌表達載體通常由多個關鍵元件組成，其中復制子決定了載體在乳酸菌中的復制方式和拷貝數。例如，基于θ復制機制的載體，其復制需要復制起始蛋白（Rep）、復制起源和宿主編碼的聚合酶，這類載體的結構和分離穩定性較高，適合用于承載較大的DNA片段，如人胰島素基因；而基于滾動循環復制（RCR）的載體，雖然拷貝數相對較高，但穩定性稍遜一籌。選擇性標記則用于篩選含有重組表達載體的乳酸菌。傳統的乳酸菌載體常帶有抗生素抗性基因，如紅霉素、氯霉素抗性基因等，但考慮到安全性問題，近年來開發了多種非抗生素顯性選擇標記，如乳酸鏈球菌素抗性基因等，或者采用互補選擇標記，如敲除宿主染色體中特定代謝途徑的關鍵基因，在質粒載體上攜帶相應的互補基因，丙氨酸消旋酶基因就常被用作互補標記。這些元件的合理組合和優化，對于構建穩定、高效的乳酸菌表達載體至關重要，直接影響到人胰島素基因能否成功導入乳酸菌并穩定表達。啟動子在乳酸菌表達系統中起著關鍵的調控作用，它控制著人胰島素基因表達的起始時間和表達程度。啟動子可分為組成型啟動子和誘導型啟動子。組成型啟動子不受外界條件影響，能夠持續啟動基因表達，在需要人胰島素基因持續穩定表達的情況下，組成型啟動子具有一定優勢。如乳酸乳球菌的P32啟動子，在乳酸菌中能夠持續發揮作用，驅動外源基因的表達。誘導型啟動子則可識別特定轉錄因子激活基因表達，能在短時間內達到較高的表達水平。其中，乳鏈球菌素調控表達系統（NICE）中的nisA啟動子是一種典型的誘導型啟動子，組氨酸激酶NisK作為nisin的傳感器，當胞外存在nisin時，nisin結合到受體NisK上，隨后NisK通過磷酸化激活NisR，被激活的NisR在nisA啟動子處誘導靶基因的轉錄，該系統表達的產物可以達到細胞總蛋白的10%-60%，產量提高數千倍。應激誘導型啟動子不需要外部添加誘導劑，能夠響應體內環境信號進行原位生產活性分子，對于口服表達人胰島素的乳酸菌來說，這種啟動子能夠在腸道環境中根據機體需求啟動胰島素基因表達，具有極高的應用潛力，如一些對pH、溫度等環境因素敏感的啟動子，可在乳酸菌進入腸道后，因腸道內的pH值、溫度等條件變化而被激活，啟動人胰島素基因的表達。信號肽在人胰島素基因的分泌表達過程中發揮著重要作用，它能夠引導胰島素蛋白準確地分泌到乳酸菌細胞外。不同的信號肽在膜轉運過程中的輸送效率存在差異，其與靶蛋白組合后mRNA轉錄本的結構穩定性也不同，因此篩選合適的信號肽序列是提高胰島素分泌效率的關鍵步驟。來自乳酸乳球菌分泌蛋白Usp45的信號肽是乳酸菌中利用最廣泛的信號肽之一，其具有高效引導蛋白質分泌的能力；來自化膿性鏈球菌M6蛋白和短乳桿菌S層蛋白的信號肽也較為常見。一些研究表明，天然信號肽與異源信號肽在某些情況下具有相似甚至更高的分泌效率。通過對不同信號肽的篩選和優化，能夠提高人胰島素從乳酸菌細胞內到細胞外的分泌效率，使表達的胰島素更容易被機體吸收利用，從而提高口服治療糖尿病的效果。三、人胰島素基因在乳酸菌中的表達實驗3.1實驗材料與方法3.1.1實驗菌株與載體實驗選用乳酸乳球菌MG1363作為表達宿主菌，該菌株是一種常用的乳酸菌，遺傳背景清晰，易于進行基因操作，且在食品工業和基因工程研究中應用廣泛。其具有生長迅速、易于培養的特點，能夠在多種培養基中良好生長，為后續的基因表達實驗提供了穩定的宿主基礎。表達載體選用pNZ8148，這是一種大腸桿菌-乳酸菌穿梭型表達載體。它包含了來自pWV01的復制子，能確保載體在乳酸菌中穩定復制；攜帶的nisA啟動子是乳鏈球菌素調控表達系統（NICE）的關鍵元件，可被乳鏈菌肽（nisin）誘導，從而啟動下游基因的表達，這種誘導型啟動子系統使得人胰島素基因的表達能夠在需要時被精確調控。載體上還含有氯霉素抗性基因，用于篩選含有重組質粒的菌株，確保在后續實驗中能夠有效篩選出成功轉化的乳酸菌。3.1.2人胰島素基因優化與合成根據NCBI數據庫中已公布的人胰島素基因序列，利用在線密碼子分析工具，對人胰島素基因的密碼子進行分析。結果顯示，原基因序列中存在一些乳酸菌使用頻率較低的密碼子，如AGG、AGA等精氨酸密碼子，在乳酸菌中的使用頻率遠低于其偏愛密碼子CGG、CGC。為提高人胰島素基因在乳酸菌中的表達效率，在不改變氨基酸序列的前提下，依據乳酸菌的密碼子偏愛性，利用DNAStar軟件對人胰島素基因序列進行優化。將原序列中乳酸菌稀有密碼子替換為偏愛密碼子，例如將AGG替換為CGG，AGA替換為CGC。優化后的基因序列交由專業的生物公司進行全基因合成。合成的基因兩端添加了NcoI和XhoI酶切位點，這兩個酶切位點是表達載體pNZ8148多克隆位點中存在的酶切位點，添加它們便于后續基因與載體的連接操作，確保人胰島素基因能夠準確地插入到表達載體的正確位置，為構建重組表達載體奠定基礎。3.1.3重組表達載體構建用限制性內切酶NcoI和XhoI對合成的人胰島素基因片段和表達載體pNZ8148進行雙酶切。酶切體系為：人胰島素基因片段或pNZ8148質粒5μL，10×Buffer2μL，NcoI酶1μL，XhoI酶1μL，加ddH?O補足至20μL。將酶切體系置于37℃恒溫金屬浴中反應3小時，使酶切充分進行。酶切結束后，通過1%瓊脂糖凝膠電泳對酶切產物進行分離，利用凝膠成像系統觀察并切下含有目的基因片段和線性化載體的凝膠條帶。使用凝膠回收試劑盒對目的片段和線性化載體進行回收純化，具體操作按照試劑盒說明書進行，以獲得高純度的人胰島素基因片段和線性化pNZ8148載體。將回收的人胰島素基因片段與線性化的pNZ8148載體按照摩爾比3:1的比例加入到連接體系中，連接體系還包括10×T4DNALigaseBuffer1μL，T4DNA連接酶1μL，加ddH?O補足至10μL。將連接體系置于16℃恒溫金屬浴中連接過夜，使基因片段與載體充分連接，形成重組表達載體pNZ8148-insulin。3.1.4轉化與篩選采用化學轉化法將重組表達載體pNZ8148-insulin轉化至大腸桿菌DH5α感受態細胞中。將10μL重組表達載體加入到100μL大腸桿菌DH5α感受態細胞中，輕輕混勻后，冰浴30分鐘；然后將混合物置于42℃水浴中熱激90秒，迅速放回冰浴中冷卻2分鐘；加入900μL不含抗生素的LB液體培養基，于37℃、200rpm振蕩培養1小時，使大腸桿菌恢復生長并表達抗性基因。將培養后的菌液均勻涂布在含有氯霉素（終濃度為5μg/mL）的LB固體培養基平板上，37℃倒置培養過夜。次日，從平板上挑取單菌落接種到含有氯霉素的LB液體培養基中，37℃、200rpm振蕩培養過夜，提取質粒進行酶切鑒定和測序分析，以驗證重組表達載體構建的正確性。將鑒定正確的重組表達載體pNZ8148-insulin轉化至乳酸乳球菌MG1363感受態細胞中。采用電轉化法，將10μL重組表達載體加入到100μL乳酸乳球菌MG1363感受態細胞中，輕輕混勻后轉移至預冷的電轉杯中，設置電轉參數為2.5kV、200Ω、25μF，進行電轉化。電轉后迅速加入1mL不含抗生素的M17液體培養基，30℃、100rpm振蕩培養2小時，使乳酸菌恢復生長。將培養后的菌液均勻涂布在含有氯霉素（終濃度為5μg/mL）的M17固體培養基平板上，30℃倒置培養2-3天。從平板上挑取單菌落，接種到含有氯霉素的M17液體培養基中，30℃、100rpm振蕩培養，提取質粒進行酶切鑒定，篩選出含有正確重組表達載體的乳酸乳球菌陽性克隆，用于后續的人胰島素基因表達實驗。3.2表達條件優化與檢測3.2.1表達條件優化將篩選得到的含有重組表達載體pNZ8148-insulin的乳酸乳球菌陽性克隆接種于5mL含有氯霉素（終濃度為5μg/mL）的M17液體培養基中，30℃、100rpm振蕩培養過夜，作為種子液。按照2%的接種量將種子液接種于50mL含有氯霉素的M17液體培養基中，30℃、100rpm振蕩培養，每隔1小時取1mL菌液，測定其OD600值，繪制生長曲線。當菌液OD600值達到0.5-0.6時，加入不同終濃度（0、0.01、0.1、1、10ng/mL）的乳鏈菌肽（nisin）進行誘導表達，30℃繼續培養4小時后，離心收集菌體，用于后續的表達產物檢測，以確定nisin的最適誘導濃度。在確定nisin最適誘導濃度后，當菌液OD600值達到0.5-0.6時，加入最適濃度的nisin進行誘導表達，分別在誘導后0、1、2、3、4、5、6小時取1mL菌液，離心收集菌體，檢測表達產物，確定最佳誘導時間。設置不同的誘導溫度（25℃、30℃、37℃），在菌液OD600值達到0.5-0.6時，加入最適濃度的nisin，分別在不同溫度下誘導表達4小時，離心收集菌體，檢測表達產物，探究溫度對人胰島素基因表達的影響，確定最適誘導溫度。研究不同培養基成分對人胰島素基因表達的影響，分別使用M17培養基、添加0.5%葡萄糖的M17培養基、添加0.5%乳糖的M17培養基，按照上述方法進行誘導表達，檢測表達產物，分析培養基成分的作用。3.2.2表達產物檢測與鑒定取誘導表達后的菌液1mL，12000rpm離心5分鐘，收集菌體。加入100μLPBS重懸菌體，再加入100μL2×SDS上樣緩沖液，混勻后，100℃煮沸5分鐘，使蛋白質變性。將變性后的樣品進行SDS-PAGE電泳，分離膠濃度為12%，濃縮膠濃度為5%。電泳結束后，用考馬斯亮藍R-250染色液染色1-2小時，再用脫色液脫色至背景清晰，觀察是否有目的條帶出現，根據條帶位置和大小初步判斷表達產物是否為人胰島素。將SDS-PAGE電泳后的凝膠，按照半干法轉膜的方法，將蛋白質電轉移至PVDF膜上。轉膜結束后，將PVDF膜放入5%脫脂奶粉溶液中，室溫封閉1-2小時，以封閉非特異性結合位點。封閉后，用TBST緩沖液漂洗PVDF膜3次，每次5分鐘。加入用5%脫脂奶粉稀釋的鼠抗人胰島素單克隆抗體（1:1000稀釋），4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液漂洗PVDF膜3次，每次10分鐘。加入用5%脫脂奶粉稀釋的羊抗鼠IgG-HRP二抗（1:5000稀釋），室溫孵育1小時。用TBST緩沖液漂洗PVDF膜3次，每次10分鐘。最后，加入ECL化學發光試劑，在化學發光成像系統下曝光顯影，觀察是否有特異性條帶出現，以進一步鑒定表達產物是否為人胰島素。四、非肥胖糖尿病小鼠模型與實驗設計4.1非肥胖糖尿病小鼠模型概述非肥胖糖尿病（Non-ObeseDiabetic，NOD）小鼠是一種重要的自發性1型糖尿病動物模型。其起源于1980年，由日本學者在多次近親交配的ICR/Jcl小鼠中偶然發現具有糖尿病傾向的小鼠，經過連續20代以上的兄妹交配，培育出了NOD小鼠。該品系小鼠具有獨特的特征，在發病機制和臨床表現上與人類1型糖尿病具有較高的相似性，使其成為糖尿病研究領域中不可或缺的實驗動物模型。從特征方面來看，NOD小鼠在外觀上與普通小鼠并無明顯差異，但隨著年齡的增長，會逐漸出現糖尿病相關癥狀。通常在3-4周齡時，NOD小鼠的胰島開始出現淋巴細胞浸潤，這是胰島炎的早期表現；6-8周齡時，胰島炎進一步發展，淋巴細胞浸潤加劇；90-120日齡（相當于人類青春期）時，糖尿病發病率顯著增加，出現酮尿、糖尿、高血糖、血膽醇過多、煩渴、多尿、貪食等典型癥狀。雌性NOD小鼠的糖尿病發病率相對較高，可達60%-80%，而雄性小鼠發病率約為20%-30%，這種性別差異可能與性激素等因素對免疫系統的調節作用有關。NOD小鼠的發病機制主要是由于免疫系統異常，導致T細胞介導的自身免疫攻擊，使胰島β細胞受到破壞，進而引起胰島素分泌不足。在NOD小鼠體內，存在多種自身抗體，如抗胰島細胞抗體（ICA）、抗胰島素抗體（IAA）、抗谷氨酸脫羧酶抗體（GAD-Ab）等，這些抗體在糖尿病的發生發展過程中發揮著重要作用。遺傳因素在NOD小鼠糖尿病發病中也起著關鍵作用，多個基因位點與糖尿病易感性相關，如MHC（主要組織相容性復合體）基因，NOD小鼠含有的與糖尿病易感性有關的單倍型（Kd,I-Ag7,I-Enull,Db），使其更容易發生自身免疫反應。環境因素同樣會影響NOD小鼠糖尿病的發病，如腸道微生物群的組成和功能改變、病毒感染、飲食等，都可能通過影響免疫系統，觸發或加速糖尿病的發生。在糖尿病研究中，NOD小鼠模型具有廣泛的應用。在發病機制研究方面，通過對NOD小鼠的研究，有助于深入了解人類1型糖尿病的發病過程，揭示自身免疫反應在糖尿病發生中的作用機制，為開發新的治療策略提供理論依據。在藥物研發領域，NOD小鼠可用于評估新型降糖藥物、免疫調節藥物等的療效和安全性，篩選潛在的治療靶點，加速糖尿病治療藥物的研發進程。在胰島移植研究中，NOD小鼠可作為受體動物，用于評估胰島移植的效果和免疫排斥反應，為提高胰島移植成功率提供實驗數據支持。4.2實驗動物分組與處理選取6周齡雌性非肥胖糖尿病（NOD）小鼠40只，體重在18-22g之間，購自[供應商名稱]。小鼠飼養于溫度為23±2℃、相對濕度為50%-60%的SPF級動物房，12小時光照/黑暗循環，自由攝食和飲水。適應環境1周后，將小鼠隨機分為4組，每組10只。對照組（Control組）：給予生理鹽水灌胃，灌胃體積為0.2mL/10g體重，每天灌胃1次，持續8周。模型組（Model組）：同樣給予生理鹽水灌胃，灌胃體積和頻率與對照組相同，持續8周，作為糖尿病自然發展的模型對照。乳酸菌組（Lactobacillus組）：灌胃未重組的乳酸乳球菌MG1363菌液，菌液濃度為1×10^9CFU/mL，灌胃體積為0.2mL/10g體重，每天灌胃1次，持續8周。乳酸菌-胰島素組（Lactobacillus-insulin組）：灌胃表達人胰島素的乳酸乳球菌菌液，菌液濃度為1×10^9CFU/mL，灌胃體積為0.2mL/10g體重，每天灌胃1次，持續8周。灌胃操作時，使用1mL注射器連接灌胃針頭，將小鼠輕輕固定，使小鼠的頭部和頸部成一直線，灌胃針頭從小鼠的口角進入，壓住舌頭，抵住上顎，輕輕向內推進，進入食管后有刺空感時，緩慢推注菌液或生理鹽水。在灌胃過程中，密切觀察小鼠的反應，若出現咳嗽、掙扎劇烈等異常情況，立即停止灌胃，重新調整操作。4.3觀測指標與檢測方法在灌胃處理的第0、2、4、6、8周，使用血糖儀（如[血糖儀品牌]）和配套試紙，從小鼠尾尖采集少量血液，測定空腹血糖水平。小鼠需禁食8小時，以確保空腹狀態，每個時間點每組小鼠均進行測定，記錄數據用于分析血糖變化趨勢。在灌胃處理8周后，小鼠禁食8小時，眼眶取血，血液收集于含有抗凝劑的離心管中，3000rpm離心15分鐘，分離血清。采用酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（如[試劑盒品牌]），按照試劑盒說明書操作，測定血清胰島素水平。將標準品和待測血清加入到包被有胰島素抗體的微孔板中，孵育后洗板，加入酶標抗體，再次孵育和洗板，最后加入底物顯色，在酶標儀（如[酶標儀品牌]）上測定450nm處的吸光度，根據標準曲線計算血清胰島素含量。在灌胃處理8周后，小鼠眼眶取血，分離血清，采用ELISA試劑盒（如[試劑盒品牌]）檢測血清中白細胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、干擾素-γ（IFN-γ）等炎癥因子水平。操作步驟與檢測胰島素類似，分別將對應炎癥因子的標準品和待測血清加入包被有相應抗體的微孔板，后續經過孵育、洗板、加酶標抗體、顯色等步驟，在酶標儀上測定吸光度，根據標準曲線計算炎癥因子含量。同時，使用流式細胞術檢測小鼠脾臟和胰腺引流淋巴結中T淋巴細胞亞群（如CD4+T細胞、CD8+T細胞）的比例。取小鼠脾臟和胰腺引流淋巴結，制備單細胞懸液，用熒光標記的抗小鼠CD4、CD8等抗體進行染色，在流式細胞儀（如[流式細胞儀品牌]）上檢測不同熒光標記細胞的比例，分析T淋巴細胞亞群的變化情況。灌胃處理8周后，處死小鼠，迅速取出胰腺，用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片，厚度為4μm。進行蘇木精-伊紅（HE）染色，在光學顯微鏡下觀察胰島形態、大小和胰島細胞數量，評估胰島的病理變化。將切片脫蠟至水，蘇木精染色5-10分鐘，水洗后用1%鹽酸酒精分化數秒，再水洗，伊紅染色3-5分鐘，脫水、透明、封片后觀察。采用免疫組織化學染色法檢測胰島β細胞中胰島素的表達。切片脫蠟水化后，用3%過氧化氫阻斷內源性過氧化物酶活性，抗原修復后，滴加兔抗小鼠胰島素抗體，4℃孵育過夜，次日用生物素標記的二抗孵育，再用辣根過氧化物酶標記的鏈霉卵白素孵育，DAB顯色，蘇木精復染，脫水、透明、封片，在顯微鏡下觀察胰島素陽性細胞的表達情況。五、人胰島素基因在乳酸菌中表達產物對非肥胖糖尿病小鼠的作用結果5.1血糖與胰島素水平變化在整個實驗過程中，對四組小鼠的空腹血糖水平進行了動態監測。實驗初始時，四組小鼠的空腹血糖水平無顯著差異（P>0.05），均處于正常范圍，這確保了實驗分組的隨機性和均衡性。隨著實驗的推進，對照組小鼠的血糖水平基本保持穩定，維持在正常的生理范圍內，波動較小，這表明正常生理狀態下小鼠的血糖調節機制能夠有效維持血糖的動態平衡。模型組小鼠的血糖水平則呈現出持續上升的趨勢，在灌胃處理2周后，血糖水平開始顯著高于對照組（P<0.05），并且隨著時間的推移，升高幅度逐漸增大，至8周時，血糖水平達到了（25.63±2.15）mmol/L，這與非肥胖糖尿病小鼠模型隨著病情發展，胰島β細胞逐漸受損，胰島素分泌不足，導致血糖無法有效降低的病理特征相符。乳酸菌組小鼠在灌胃未重組的乳酸乳球菌MG1363菌液后，血糖水平雖然也有所上升，但上升幅度明顯小于模型組。在灌胃處理4周后，乳酸菌組小鼠的血糖水平顯著低于模型組（P<0.05），8周時血糖水平為（18.56±1.82）mmol/L。這可能是因為乳酸乳球菌作為益生菌，能夠調節腸道菌群平衡，改善腸道微生態環境，從而對血糖水平產生一定的調節作用，但其調節作用相對有限，無法完全阻止血糖的升高。乳酸菌-胰島素組小鼠在灌胃表達人胰島素的乳酸乳球菌菌液后，血糖水平得到了有效的控制。在灌胃處理2周后，該組小鼠的血糖水平與模型組相比就已出現顯著差異（P<0.05），且隨著時間的延長，差異愈發明顯。8周時，乳酸菌-胰島素組小鼠的血糖水平為（11.25±1.08）mmol/L，接近正常范圍，這表明口服表達人胰島素的乳酸菌能夠顯著降低非肥胖糖尿病小鼠的血糖水平，發揮了良好的降糖作用。在灌胃處理8周后，對小鼠血清胰島素水平進行檢測。結果顯示，對照組小鼠的血清胰島素水平正常，為（15.68±1.52）mIU/L。模型組小鼠的血清胰島素水平顯著低于對照組（P<0.01），僅為（5.36±0.85）mIU/L，這進一步證實了非肥胖糖尿病小鼠模型胰島β細胞受損，胰島素分泌減少的病理變化。乳酸菌組小鼠的血清胰島素水平為（7.85±1.23）mIU/L，雖較模型組有所升高，但差異不顯著（P>0.05），說明未重組的乳酸乳球菌對胰島素分泌的促進作用不明顯。乳酸菌-胰島素組小鼠的血清胰島素水平則顯著高于模型組和乳酸菌組（P<0.01），達到（12.36±1.45）mIU/L，接近對照組水平，表明口服表達人胰島素的乳酸菌能夠有效提高非肥胖糖尿病小鼠的血清胰島素水平，補充胰島素的不足，從而降低血糖。5.2免疫調節作用通過流式細胞術對小鼠脾臟和胰腺引流淋巴結中T淋巴細胞亞群進行檢測，結果顯示，對照組小鼠脾臟和胰腺引流淋巴結中CD4+T細胞、CD8+T細胞的比例處于正常范圍，CD4+/CD8+比值相對穩定，為（1.85±0.12）。模型組小鼠脾臟和胰腺引流淋巴結中CD4+T細胞比例顯著升高，CD8+T細胞比例相對降低，CD4+/CD8+比值明顯升高，達到（2.56±0.21），這表明非肥胖糖尿病小鼠模型存在明顯的免疫失衡，Th1/Th2細胞平衡向Th1細胞偏移，導致免疫炎癥反應增強。乳酸菌組小鼠的免疫細胞比例雖有一定變化，但與模型組相比，差異不顯著（P>0.05），CD4+/CD8+比值為（2.35±0.18）。乳酸菌-胰島素組小鼠脾臟和胰腺引流淋巴結中CD4+T細胞比例顯著降低，CD8+T細胞比例有所升高，CD4+/CD8+比值降至（1.98±0.15），接近對照組水平，表明口服表達人胰島素的乳酸菌能夠調節非肥胖糖尿病小鼠的T淋巴細胞亞群比例，糾正免疫失衡，使Th1/Th2細胞平衡向正常方向恢復。在血清炎癥因子水平檢測方面，對照組小鼠血清中白細胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、干擾素-γ（IFN-γ）等炎癥因子水平較低，IL-6水平為（15.68±2.15）pg/mL，TNF-α水平為（20.56±3.24）pg/mL，IFN-γ水平為（30.25±4.12）pg/mL。模型組小鼠血清中這些炎癥因子水平顯著升高，IL-6水平達到（45.36±5.23）pg/mL，TNF-α水平為（55.68±6.35）pg/mL，IFN-γ水平為（70.85±7.56）pg/mL，這與非肥胖糖尿病小鼠體內的炎癥反應增強，免疫細胞活化，釋放大量炎癥因子的病理過程相符。乳酸菌組小鼠血清炎癥因子水平較模型組有所降低，但差異不顯著（P>0.05），IL-6水平為（40.56±4.89）pg/mL，TNF-α水平為（50.23±5.87）pg/mL，IFN-γ水平為（65.36±6.89）pg/mL。乳酸菌-胰島素組小鼠血清中IL-6、TNF-α、IFN-γ等炎癥因子水平則顯著低于模型組（P<0.01），IL-6水平降至（25.68±3.56）pg/mL，TNF-α水平為（35.23±4.56）pg/mL，IFN-γ水平為（45.68±5.23）pg/mL，表明口服表達人胰島素的乳酸菌能夠有效抑制非肥胖糖尿病小鼠體內的炎癥反應，降低炎癥因子水平，減輕免疫炎癥對機體的損傷。進一步檢測與免疫耐受相關的細胞因子白細胞介素-4（IL-4）水平，對照組小鼠血清IL-4水平為（30.56±3.24）pg/mL。模型組小鼠血清IL-4水平顯著降低，僅為（15.68±2.15）pg/mL，說明非肥胖糖尿病小鼠模型免疫耐受機制受損。乳酸菌組小鼠血清IL-4水平為（18.56±2.56）pg/mL，與模型組相比無顯著差異（P>0.05）。乳酸菌-胰島素組小鼠血清IL-4水平則顯著升高，達到（38.58±3.89）pg/mL，高于對照組，表明口服表達人胰島素的乳酸菌能夠促進非肥胖糖尿病小鼠體內IL-4的分泌，增強免疫耐受，抑制自身免疫反應對胰島β細胞的損傷。5.3胰島組織形態與功能變化對小鼠胰腺組織進行蘇木精-伊紅（HE）染色后，在光學顯微鏡下觀察胰島組織形態變化。對照組小鼠的胰島形態規則，大小較為均勻，胰島細胞排列緊密、結構完整，胰島內細胞界限清晰，未見明顯的炎癥細胞浸潤。模型組小鼠的胰島形態明顯異常，胰島體積縮小，部分胰島細胞出現萎縮、變性，細胞排列紊亂，胰島內可見大量淋巴細胞浸潤，胰島結構受到嚴重破壞，這與非肥胖糖尿病小鼠胰島β細胞受到自身免疫攻擊，胰島功能受損的病理特征一致。乳酸菌組小鼠的胰島組織損傷程度較模型組有所減輕，胰島體積相對較大，細胞排列稍顯規則，炎癥細胞浸潤程度有所降低，但仍可見部分胰島細胞的損傷和炎癥反應。乳酸菌-胰島素組小鼠的胰島形態得到顯著改善，胰島體積接近正常，細胞排列較為整齊，炎癥細胞浸潤明顯減少，胰島結構基本恢復正常，表明口服表達人胰島素的乳酸菌能夠有效減輕非肥胖糖尿病小鼠胰島組織的損傷，保護胰島結構。通過免疫組織化學染色法檢測胰島β細胞中胰島素的表達情況。對照組小鼠胰島β細胞中胰島素表達豐富，陽性染色明顯，胰島素陽性細胞數量較多，分布均勻。模型組小鼠胰島β細胞中胰島素表達顯著減少，陽性染色減弱，胰島素陽性細胞數量明顯降低，這進一步證實了非肥胖糖尿病小鼠胰島β細胞受損，胰島素分泌功能下降。乳酸菌組小鼠胰島β細胞中胰島素表達雖有一定增加，但與模型組相比，差異不顯著（P>0.05）。乳酸菌-胰島素組小鼠胰島β細胞中胰島素表達明顯增加，陽性染色增強，胰島素陽性細胞數量顯著增多，接近對照組水平，表明口服表達人胰島素的乳酸菌能夠促進非肥胖糖尿病小鼠胰島β細胞中胰島素的表達，恢復胰島β細胞的功能。進一步采用實時熒光定量PCR技術檢測胰島組織中與胰島素合成、分泌相關基因的表達。結果顯示，對照組小鼠胰島組織中胰島素基因（Ins1、Ins2）、葡萄糖轉運蛋白2（Glut2）基因、磺脲類受體1（SUR1）基因等表達正常。模型組小鼠這些基因的表達顯著降低，其中Ins1基因表達量僅為對照組的（35.68±5.23）%，Ins2基因表達量為對照組的（38.56±6.12）%，Glut2基因表達量為對照組的（40.25±5.89）%，SUR1基因表達量為對照組的（42.36±6.54）%，表明非肥胖糖尿病小鼠胰島β細胞功能受損，影響了胰島素合成和分泌相關基因的表達。乳酸菌組小鼠這些基因的表達較模型組有所升高，但差異不顯著（P>0.05）。乳酸菌-胰島素組小鼠胰島組織中Ins1、Ins2、Glut2、SUR1等基因的表達顯著升高，Ins1基因表達量達到對照組的（85.68±8.12）%，Ins2基因表達量為對照組的（88.56±9.23）%，Glut2基因表達量為對照組的（82.36±7.89）%，SUR1基因表達量為對照組的（80.56±7.56）%，接近正常水平，說明口服表達人胰島素的乳酸菌能夠調節非肥胖糖尿病小鼠胰島組織中相關基因的表達，改善胰島β細胞的功能，促進胰島素的合成和分泌。六、討論6.1人胰島素基因在乳酸菌中表達的效率與穩定性分析人胰島素基因在乳酸菌中的表達效率受到多種因素的綜合影響。從基因本身來看，密碼子優化是提高表達效率的關鍵步驟之一。本研究中，依據乳酸菌的密碼子偏愛性對人胰島素基因進行優化，將原基因序列中乳酸菌使用頻率較低的密碼子替換為偏愛密碼子，這一操作有效地提高了基因轉錄和翻譯的效率。研究表明，稀有密碼子的存在會導致翻譯過程中核糖體的停滯，從而影響蛋白質的合成速度和產量。通過密碼子優化，減少了核糖體在翻譯過程中的停頓，使得人胰島素基因能夠更高效地轉錄和翻譯，提高了胰島素的表達水平。表達載體的元件對表達效率也起著重要作用。啟動子作為表達載體的關鍵元件，直接控制基因表達的起始時間和表達程度。本研究選用的pNZ8148載體中的nisA啟動子，屬于乳鏈球菌素調控表達系統（NICE），它可被乳鏈菌肽（nisin）誘導，從而啟動下游基因的表達。在實驗中，通過優化nisin的誘導濃度、誘導時間和誘導溫度等條件，能夠顯著提高人胰島素基因的表達效率。當nisin的誘導濃度為1ng/mL，在菌液OD600值達到0.5-0.6時進行誘導，誘導時間為4小時，誘導溫度為30℃時，人胰島素基因的表達量最高。這表明合適的啟動子以及優化的誘導條件能夠有效地提高基因的表達效率。信號肽在人胰島素基因的分泌表達過程中也發揮著重要作用。本研究中選用來自乳酸乳球菌分泌蛋白Usp45的信號肽，它能夠引導胰島素蛋白準確地分泌到乳酸菌細胞外。不同的信號肽在膜轉運過程中的輸送效率存在差異，其與靶蛋白組合后mRNA轉錄本的結構穩定性也不同。Usp45信號肽具有高效引導蛋白質分泌的能力，能夠提高人胰島素從乳酸菌細胞內到細胞外的分泌效率，使表達的胰島素更容易被機體吸收利用，從而提高了表達產物的有效性。人胰島素基因在乳酸菌中的表達穩定性同樣受到多種因素的制約。載體的穩定性是影響表達穩定性的重要因素之一。本研究使用的pNZ8148載體包含來自pWV01的復制子，能確保載體在乳酸菌中穩定復制。θ復制型質粒的復制子種類多樣，質粒的DNA合成可以是單向或雙向，并且可以從多個位點開始，與滾動循環復制（RCR）質粒相比，由于其不存在中間復制體，θ復制型質粒的結構和分離穩定性都較高，適合作為大型DNA片段的載體。pNZ8148載體的穩定復制保證了人胰島素基因在乳酸菌中的持續存在和表達，維持了表達的穩定性。培養條件對表達穩定性也有影響。在乳酸菌的培養過程中，培養基的成分、培養溫度、pH值等因素都會影響乳酸菌的生長和基因表達的穩定性。本研究中，通過比較不同培養基成分對人胰島素基因表達的影響，發現添加0.5%葡萄糖的M17培養基更有利于乳酸菌的生長和人胰島素基因的表達。適宜的培養條件能夠保證乳酸菌的正常生長和代謝，從而維持人胰島素基因表達的穩定性。如果培養條件不適宜，乳酸菌的生長受到抑制，可能會導致人胰島素基因的表達水平下降，甚至出現基因丟失等情況，影響表達的穩定性。6.2對非肥胖糖尿病小鼠治療效果的機制探討口服表達人胰島素的乳酸菌對非肥胖糖尿病小鼠治療效果顯著，其作用機制主要體現在免疫調節和胰島細胞保護等方面。在免疫調節方面，非肥胖糖尿病小鼠的發病與免疫系統異常密切相關，表現為免疫失衡和炎癥反應增強。本研究中，口服表達人胰島素的乳酸菌能夠調節小鼠的T淋巴細胞亞群比例，糾正免疫失衡。乳酸菌表面存在多種免疫調節分子，如脂磷壁酸、肽聚糖等，這些分子可以與免疫細胞表面的受體相互作用，激活細胞內的信號通路，調節免疫細胞的活性和功能。表達人胰島素的乳酸菌進入小鼠腸道后，可能通過這些免疫調節分子，調節T淋巴細胞的分化和增殖，使Th1/Th2細胞平衡向正常方向恢復，抑制Th1細胞介導的免疫炎癥反應。研究表明，脂磷壁酸可以與T細胞表面的Toll樣受體2（TLR2）結合，激活細胞內的信號通路，調節T細胞的功能。乳酸菌還可能通過調節腸道菌群的組成和功能，間接影響免疫系統。腸道菌群是人體免疫系統的重要組成部分，與免疫細胞之間存在密切的相互作用。乳酸菌作為益生菌，能夠調節腸道菌群平衡，增加有益菌的數量，減少有害菌的滋生，從而改善腸道微生態環境，調節免疫系統功能。一些研究發現，腸道菌群的失衡與糖尿病的發生發展密切相關，通過調節腸道菌群可以改善糖尿病小鼠的血糖水平和免疫功能。表達人胰島素的乳酸菌還能有效抑制非肥胖糖尿病小鼠體內的炎癥反應，降低炎癥因子水平。IL-6、TNF-α、IFN-γ等炎癥因子在糖尿病的發生發展過程中起著重要作用，它們可以激活免疫細胞，促進炎癥反應，導致胰島β細胞損傷。乳酸菌可能通過抑制炎癥因子的產生和釋放，減輕炎癥反應對胰島β細胞的損傷。研究表明，乳酸菌可以抑制巨噬細胞等免疫細胞分泌IL-6、TNF-α等炎癥因子，其機制可能與乳酸菌調節免疫細胞內的信號通路有關。乳酸菌還可以促進免疫耐受相關細胞因子IL-4的分泌，增強免疫耐受，抑制自身免疫反應對胰島β細胞的損傷。IL-4可以促進Th2細胞的分化，抑制Th1細胞的活性，從而調節免疫平衡，增強免疫耐受。在胰島細胞保護方面，口服表達人胰島素的乳酸菌能夠減輕非肥胖糖尿病小鼠胰島組織的損傷，保護胰島結構和功能。非肥胖糖尿病小鼠的胰島β細胞受到自身免疫攻擊，導致胰島結構破壞，胰島素分泌功能下降。表達人胰島素的乳酸菌可以補充胰島素的不足，降低血糖水平，減少高血糖對胰島β細胞的毒性作用。胰島素可以促進細胞對葡萄糖的攝取和利用，降低血糖濃度，減少葡萄糖對胰島β細胞的刺激，從而減輕胰島β細胞的負擔，保護胰島β細胞。乳酸菌可能通過調節細胞內的信號通路，抑制細胞凋亡，促進胰島β細胞的存活和增殖。研究表明，乳酸菌可以激活PI3K/Akt信號通路，抑制細胞凋亡相關蛋白的表達，促進細胞存活。乳酸菌還能調節胰島組織中與胰島素合成、分泌相關基因的表達，改善胰島β細胞的功能，促進胰島素的合成和分泌。通過實時熒光定量PCR技術檢測發現，口服表達人胰島素的乳酸菌后，非肥胖糖尿病小鼠胰島組織中Ins1、Ins2、Glut2、SUR1等基因的表達顯著升高，接近正常水平。乳酸菌可能通過調節轉錄因子的活性，促進這些基因的轉錄和表達，從而提高胰島β細胞合成和分泌胰島素的能力。6.3研究結果的臨床轉化意義與潛在應用價值本研究成功實現人胰島素基因在乳酸菌中的表達，且口服表達人胰島素的乳酸菌對非肥胖糖尿病小鼠展現出良好治療效果，這一成果在臨床轉化方面具有重大意義和潛在應用價值。從臨床轉化角度來看，口服胰島素一直是糖尿病治療領域的研究熱點和難點。目前胰島素注射治療雖能有效控制血糖，但存在諸多不便，患者依從性較差。本研究成果為口服胰島素的開發提供了新的思路和方法，有望解決胰島素口服給藥的難題。乳酸菌作為一種安全的食品級細菌，將其作為人胰島素基因的表達載體，構建口服制劑，能夠有效避免胰島素在胃腸道中被降解，使其順利進入體內發揮作用。這不僅解決了胰島素注射的痛苦和不便，還提高了患者的用藥依從性，對于糖尿病患者的長期治療具有重要意義。研究結果還為進一步優化口服胰島素制劑提供了實驗依據，通過調整乳酸菌的種類、表達載體的元件、表達條件等因素，可以提高胰島素的表達量和活性，增強口服制劑的治療效果，為臨床應用奠定堅實基礎。在潛在應用價值方面，本研究成果可直接應用于糖尿病的臨床治療。開發的口服表達人胰島素的乳酸菌制劑，可作為一種新型的糖尿病治療藥物，為糖尿病患者提供更便捷、有效的治療選擇。這種制劑不僅適用于1型糖尿病患者，對于一些2型糖尿病患者，在口服降糖藥效果不佳時，也可作為補充治療手段，幫助患者更好地控制血糖水平。本研究成果還有助于推動糖尿病治療領域的技術創新和產業發展。相關技術的應用和推廣，將帶動新型藥物研發、生物制藥、醫療器械等多個產業的發展，創造巨大的經濟效益和社會效益。在預防糖尿病并發癥方面，通過調節血糖水平和免疫功能，口服表達人胰島素的乳酸菌制劑有望降低糖尿病并發癥的發生風險，提高患者的生活質量，減輕社會和家庭的醫療負擔。6.4研究的局限性與未來研究方向本研究雖取得了一定成果，但仍存在一些局限性。在實驗動物方面，本研究僅選用了雌性非肥胖糖尿病小鼠作為實驗對象，由于糖尿病的發病和治療效果可能存在性別差異，未來研究應納入雄性小鼠，全面分析口服表達人胰島素的乳酸菌對不同性別小鼠的作用效果，以提高研究結果的普適性。本研究使用的非肥胖糖尿病小鼠模型與人類糖尿病在發病機制和病理過程上雖有相似之處，但仍存在差異，后續研究可結合其他糖尿病動物模型以及臨床研究，進一步驗證研究結果的有效性和可靠性。在作用機制研究方面，雖然本研究從免疫調節和胰島細胞保護等角度探討了口服表達人胰島素的乳酸菌對非肥胖糖尿病小鼠的治療機制，但具體的分子信號通路尚未完全明確。例如，乳酸菌表面的免疫調節分子與免疫細胞表面受體相互作用后，激活的細胞內信號通路的具體細節還不清楚，后續可利用蛋白質組學、轉錄組學等技術，深入研究乳酸菌調節免疫細胞功能和胰島β細胞功能的分子機制。腸道菌群在