限制酶的選擇基因表達載體的構建之2025年“湘道杯”大賽道縣第二中學

周蓉3.2基因工程的基本操作程序二輪復習微專題載體（質粒）DNA分子（含目的基因）限制酶處理帶有黏性末端或平末端的切口帶有相同黏性末端或平末端的目的基因片段DNA連接酶重組DNA分子（重組質粒）同同種知識點回顧：基因表達載體的構建過程限制酶的選擇原則（一）1、不破壞

原則2、質粒的酶切位點位于

之間3、不能破壞

。4、確保出現相同

原則目的基因啟動子和終止子標記基因、啟動子、終止子、復制原點黏性末端僅用一種限制酶切割目的基因和載體的缺點：缺點：1、目的基因與目的基因、質粒與質粒自身環化2、目的基因與質粒之間反向連接

僅用一種限制酶切割目的基因和載體的缺點：限制酶的選擇原則（二）雙酶切雙酶切法可避免自身環化和反向連接一、能找到兩種限制酶同時切割目的基因和載體PstⅠ和EcoRⅠ1.若要構建基因表達載體，最應選擇的限制酶是____________________。酶B和酶C2.若要構建基因表達載體，最應選擇的限制酶是___________________。注意1：

質粒上兩個標記基因，應破壞一個并保留另一個。（雙標記法篩選重組DNA分子）MspISmaI3.若利用酶切法獲得目的基因，最應選擇的限制酶是____________________。注意2：一種酶的識別序列中包含另一種酶的識別序列。二、不能找到兩種限制酶同時切割目的基因和載體（一）同尾酶的利用：不同的限制酶切不同的識別序列產生相同的黏性末端。4.用圖中質粒和目的基因構建基因表達載體時，應該選擇限制酶

切割質粒，選擇限制酶

(只選擇一種)切割目的基因。用該方法切割目的基因、質粒后______(填“能”或“不能”)防止目的基因的自身環化或與質粒的反向連接。

BamHⅠSau3A不能（一）同尾酶的利用：不同的限制酶切不同的識別序列產生相同的黏性末端。5.要在乳酸桿菌中表達W基因，需使用圖1中的質粒為載體。圖2為克隆得到的含W基因的DNA片段，W基因以乙鏈為轉錄模板鏈。限制酶EcoRIBamHIKpnIMfeIHindⅢ識別序列及切割位點

為獲得能正確表達W基因的重組質粒，應選用限制酶____________切割圖1中的質粒，選用限制酶____________切割圖2中含W基因的DNA片段。注意3：本題除了注意不同的酶切不同的識別序列產生相同的黏性末端，還要注意雙酶切時目的基因與質粒的連接方向要正確。5′→3′3′5′5.要在乳酸桿菌中表達W基因，需使用圖1中的質粒為載體。圖2為克隆得到的含W基因的DNA片段，W基因以乙鏈為轉錄模板鏈。（1）目的基因與質粒連接時的連接方向：

①以乙鏈為模板進行轉錄時，mRNA的合成方向為

（填“5′→3′”或者“3′→5′”）

②構建表達載體時，乙鏈的

（填

5′或3′）端靠近質粒上的啟動子

，乙鏈的

（填

5′或3′）

端靠近質粒上的終止子

5′→3′3′5′限制酶EcoRIBamHIKpnIMfeIHindⅢ識別序列及切割位點

（2）限制酶的選擇：

①W基因的右端只有一種限制酶的酶切位點，即

，（填限制酶）且質粒上也有該酶的酶切位點，所以目的基因和質?？赏瑫r選擇該種限制酶進行切割。（選出一種）②為了保證連接方向正確，此時質粒上選擇的限制酶是

，但W基因的左端沒有相同的限制酶切位點，可選用其同尾酶

進行切割，得到相同的黏性末端。HindⅢMfeⅠEcoRⅠ5.要在乳酸桿菌中表達W基因，需使用圖1中的質粒為載體。圖2為克隆得到的含W基因的DNA片段，W基因以乙鏈為轉錄模板鏈。限制酶EcoRIBamHIKpnIMfeIHindⅢ識別序列及切割位點

為獲得能正確表達W基因的重組質粒，應選用限制酶

切割圖1中的質粒，選用限制酶

切割圖2中含W基因的DNA片段。HindⅢ和MfeⅠHindⅢ和EcoRⅠ（二）在目的基因上添加與質粒相對應的酶切位點二、不能找到兩種限制酶同時切割目的基因和載體（二）在目的基因上添加與質粒相對應的酶切位點方法：在引物5′端添加限制酶的識別序列，通過PCR技術擴增目的基因結果：在目的基因上添加了限制酶的識別序列目的基因5′3′3′5′6.在下面的目的基因上添加EcoRⅠ的識別序列5′-GAATTC3′-CTTAAGGAATTC-3′CTTAAG-5′課堂小結1、選擇雙酶切可避免自身環化和反向連接2、進行雙酶切時應注意以下幾點：

①

質粒上有雙標記基因，應破壞一個并保留另一個。（雙標記法篩選重組DNA分子）②一種酶的識別序列中包含另一種酶的識別序列。