第14課時蛋白質的提取和分離[學習導航]1.閱讀教材P74～75內容，理解電泳、同工酶和蛋白質組學。2.結合教材P73～75內容，進行乳酸脫氫酶同工酶的提取和電泳分離。3.結合教材P73～75內容，總結在瓊脂糖凝膠電泳中影響蛋白質遷移率的因素。[重難點擊]1.進行乳酸脫氫酶同工酶的提取和電泳分離。2.總結在瓊脂糖凝膠電泳中影響蛋白質遷移率的因素。一、電泳、同工酶和蛋白質組學帶電荷的物質在電場中的趨向運動稱為電泳。電泳的種類多，應用非常廣泛，它已成為分子生物學技術中分離生物大分子的重要手段。1.電泳(1)概念：帶電粒子在電場的作用下發生遷移的過程。(2)原理①帶電粒子：許多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解離的基團，在一定的pH下，這些基團會帶上正電或負電。②遷移動力與方向：在電場的作用下，帶電分子會向著與其所帶電荷相反的電極移動。③分離依據：電泳利用了待分離樣品中各種分子帶電性質的差異以及分子本身的大小、形狀的不同，使帶電分子產生不同的遷移速度，從而實現樣品中各種分子的分離。(3)常用的電泳方法①瓊脂糖凝膠電泳：在電泳緩沖液和凝膠中加入瓊脂糖，蛋白質分子的遷移速率主要取決于其所帶凈電荷以及分子的大小和形狀等因素。②變性膠電泳：在電泳緩沖液和凝膠中加入十二烷基硫酸鈉(SDS)變性劑，蛋白質都變為橢圓形，SDS帶有大量的負電荷，掩蓋了不同蛋白質的電荷差異，因此變性膠電泳中影響蛋白質的遷移速率的主要因素是蛋白質分子的大小。2.同工酶同工酶是指催化相同的化學反應而酶蛋白的分子結構、理化性質乃至免疫學性質不同的一組酶。乳酸脫氫酶一般含有5種同工酶，其相對分子質量相同，但所帶電荷不同。3.蛋白質組學蛋白質組學指的是在大規模水平上研究蛋白質的特征，包括蛋白質的氨基酸組成分析、立體結構研究和蛋白質的人工合成等。由此獲得蛋白質水平上的關于疾病發生、細胞代謝等過程的整體而全面的認識。蛋白質組學的研究不僅能分析生物體內蛋白質的組成，還可以揭示各種蛋白質在生物體內的相互作用與聯系。1.從電荷方面思考，適合電泳法分離的各種分子需具備什么條件？答案各種分子應帶有不同種類和不同量的電荷。2.變性膠電泳分離蛋白質是否依據蛋白質所帶電荷的差異？為什么？答案否。因為SDS能與蛋白質結合，形成蛋白質－SDS復合物，SDS所帶負電荷的量遠大于蛋白質分子原有的電荷量，因而掩蓋了不同蛋白質間的電荷差異，使電泳遷移率完全由蛋白質分子的大小決定。歸納總結瓊脂糖凝膠電泳和變性膠電泳的兩點區別1分離原理不同①瓊脂糖凝膠電泳依據分子所帶電荷的差異和分子大小、形狀等。②變性膠電泳則完全取決于分子大小，而非電荷性質和分子形狀。2用途不同①瓊脂糖凝膠電泳廣泛應用于核酸的研究中，用于分離大分子核酸。②變性膠電泳則廣泛應用于分離蛋白質和相對分子質量較小的核酸。1.帶電荷的蛋白質在電場中移動的速度主要取決于()A.所帶的電荷多少B.蛋白質的分子大小C.蛋白質的相對分子質量D.蛋白質的分子大小和所帶的電荷多少答案D2.下列說法中，不正確的是()A.同工酶催化的化學反應相同，但結構不完全相同B.同工酶的相對分子質量一定不同C.蛋白質的多樣性決定了其功能的多樣性D.蛋白質組學是21世紀生命科學研究領域新的前沿答案B解析同工酶催化的化學反應相同，但結構不完全相同，乳酸脫氫酶的5種同工酶的相對分子質量是相同的。特別提醒同工酶存在于生物的同一種屬或同一個體的不同組織、甚至同一組織或細胞中。產生同工酶的主要原因是在進化過程中基因發生變異，而其變異程度尚不足以成為一個新酶。二、乳酸脫氫酶同工酶的提取和分離下面我們以乳酸脫氫酶同工酶的提取和分離為例，體驗蛋白質的提取和分離技術。1.乳酸脫氫酶同工酶的提取(1)取5g新鮮的動物心臟，漂洗干凈后剪碎到預冷的玻璃勻漿器中，加入25mL磷酸提取緩沖液，然后冰浴研磨成勻漿(如圖1)。(2)將勻漿收集到冰浴的離心管中，在4℃條件下12000rpm離心10min。吸取上清液，然后在4℃條件下保存備用(如圖2)。2.瓊脂糖凝膠電泳分離(1)制備瓊脂糖凝膠：用TBE電泳緩沖液配制質量分數為1%的瓊脂糖凝膠，加熱溶解后混勻，緩慢倒入膠床中，插入適當的梳子，室溫冷卻至凝膠凝固。拔出梳子，將凝膠放入電泳槽中，然后向電泳槽中加入適量TBE電泳緩沖液(如圖3)。(2)加樣：取適量同工酶提取液與等量載樣緩沖液(質量分數40%的蔗糖溶液、0.25%溴酚藍)混勻，然后取20μL加入樣品孔內。(3)電泳：100V條件下進行電泳約30min。(4)染色：當溴酚藍指示劑電泳到凝膠底部時切斷電源，取出膠板浸入染色液中，37℃染色15～30min，水洗后觀察電泳結果。3.結果分析由圖中電泳結果可以看出：(1)每個器官形成了5個條帶說明乳酸脫氫酶有5種同工酶。(2)LDH2在心臟中含量最高，在骨骼肌中含量最低，說明不同的器官同一種同工酶的含量不同。(3)骨骼肌中含量最高的是LDH5，含量最低的是LDH1，說明同一器官不同的同工酶含量不同。1.提取和分離乳酸脫氫酶同工酶過程中為什么要保持酶的活性？答案酶作為一類特殊的蛋白質(具有生物催化活性)，在其提取和分離過程中必須保持其生物活性，這樣分離出的酶才有可能用來研究其生化性質及相關功能。2.制備乳酸脫氫酶同工酶提取液的過程中，哪些是為了保持酶活性而采取的措施？答案①提供必要的緩沖系統，以維持pH的相對穩定，防止破壞其活性；②保持低溫環境，如將玻璃勻漿器和離心管預冷，低溫離心；③避免引入其他雜質或變性劑，導致酶變性，如對材料進行漂洗。3.溴酚藍為什么能作為乳酸脫氫酶同工酶的指示劑？答案溴酚藍能和乳酸脫氫酶同工酶發生特定的反應，形成特殊的藍紫色產物。歸納總結1實驗步驟概括：取材→剪碎→漂洗→勻漿→離心→制凝膠→加樣→電泳→染色→沖洗→觀察。2實驗操作要點①所有提取乳酸脫氫酶同工酶用到的器具最好都提前在冰箱中預冷處理，這樣能更好地保持酶的活性。②蛋白質樣品在上樣之前，要與等量載體緩沖液混勻。載樣緩沖液中的蔗糖可增加蛋白質樣品的比重，防止加樣時發生“漂樣”現象；溴酚藍作為一種電泳前沿指示劑，判斷電泳的進行程度。③將蛋白質樣品加在電泳槽的負極段的加樣孔，因為在堿性緩沖液中帶負電荷的蛋白質在外加電場作用下會向正極移動。3.在乳酸脫氫酶同工酶分離過程中，使用緩沖液的作用是()A.維持溶液濃度不變B.維持溶液酸堿度不變C.催化蛋白質分離過程順利完成D.無實際意義答案B解析分離蛋白質時加入緩沖液，其原因是緩沖液在一定范圍內能抵制外界酸和堿對反應溶液pH的影響，保持pH基本不變。4.下列說法不正確的是()A.在酶的提取和分離過程中必須保持其生物活性B.將心臟研磨成勻漿時要在冰浴下進行，是為了保證酶的活性C.載樣緩沖液中的溴酚藍是一種酸堿緩沖物質，維持pH穩定D.電泳結果出現了5個條帶，說明乳酸脫氫酶有5種同工酶答案C解析酶提取之后要進行一系列活性條件下的研究，因此在酶的提取和分離過程中必須保持其生物活性，將心臟研磨成勻漿時要在冰浴下進行，就是為了保證酶的活性。載樣緩沖液中的溴酚藍是一種指示劑，指示酶的遷移位置；電泳結果出現了5個條帶說明乳酸脫氫酶有5種同工酶。特別提醒瓊脂糖凝膠電泳的優點(1)瓊脂糖含液體量大，近似自由電泳。(2)瓊脂糖作為支持體有均勻、區帶整齊、分辨率高、重復性好等優點。(3)電泳速度快。(4)區帶易染色，樣品易回收，有利于制備。(5)操作簡單、快速、靈敏。1.下列有關同工酶的概念，描述正確的是()A.催化相同的化學反應，酶蛋白的分子結構、理化性質不同，電泳行為不同B.催化不同的化學反應C.催化不同的化學反應，酶蛋白的分子結構、理化性質相同，電泳行為相同D.催化相似的化學反應答案A解析同工酶是指催化相同的化學反應而酶蛋白的分子結構、理化性質以及免疫學性質不同的一組酶。2.乳酸脫氫酶有幾種同工酶()A.2B.3C.4D.5答案D解析乳酸脫氫酶的同工酶共有5種。3.下列各項中，除哪項外均為電泳使樣品中各分子分離的原因()A.分子帶電性質的差異B.分子的大小C.分子的形狀D.分子的變性溫度答案D解析電泳是指帶電粒子在電場作用下發生遷移的過程。樣品分子的帶電性質不同、分子的大小和形狀不同都會影響帶電粒子在電場中的遷移速度，與分子的變性溫度無關，故選D項。4.科學家發現蠅體內存在一種抗菌活性蛋白。這種蛋白質具有極強的抗菌能力，受到研究者的重視。分離該抗菌蛋白可用電泳法，其原理是根據蛋白質分子的__________、大小及形狀不同，在電場中的__________不同而實現的分離。答案電荷(帶電情況)遷移速度解析電泳利用了待分離樣品中各種分子帶電性質的差異以及分子本身的大小、形狀的不同，使帶電分子產生不同的遷移速度，從而實現樣品中各種分子的分離。課時作業[基礎過關]1.電泳是指帶電粒子在電場的作用下向著與其所帶電荷__________的電極移動()A.相同 B.相反C.相對 D.相向答案B解析在一定的pH下，生物大分子中有某些可解離的基團，這些基團會帶上正電荷或負電荷，在電場作用下，這些帶電分子會向著與其所帶電荷相反的電極移動。2.電泳實現樣品中各種分子的分離是利用了()A.各種分子帶電性質的差異B.分子本身的大小不同C.分子形狀的不同D.以上都正確答案D解析電泳利用了待分離樣品中各種分子帶電性質的差異以及分子本身的大小和形狀差異，使帶電分子產生不同的遷移速度，從而實現樣品中各種分子的分離。3.下列關于同工酶的敘述正確的是()A.同工酶是由多個亞基以共價鍵結合形成的復合物B.同工酶對同一種底物有不同的專一性C.同工酶是催化同一種反應，但結構不完全相同的同一種酶的多種形式D.各種同工酶在電場電泳時，遷移速率相同答案C解析同工酶是指催化相同的化學反應而酶蛋白的分子結構、理化性質乃至免疫學性質不同的一組酶。4.在進行瓊脂糖凝膠電泳前，用什么溶液溶解瓊脂糖()A.蒸餾水 B.自來水C.緩沖液 D.蔗糖溶液答案C解析用電泳緩沖液溶解瓊脂糖，如TBE，這樣就能保證凝膠中的離子濃度與電泳液中的離子濃度相同，在電場中活動一致。5.各種動物血清內乳酸脫氫酶同工酶的組成是不同的。可以通過比較各種動物乳酸脫氫酶同工酶差異的大小來判斷動物之間親緣關系的遠近。下列各種實驗方法中，不能采用的是()A.測乳酸脫氫酶同工酶的氨基酸序列B.測控制乳酸脫氫酶同工酶合成的基因堿基序列C.用電泳法比較各種動物乳酸脫氫酶同工酶的電泳帶D.檢測不同動物的乳酸脫氫酶同工酶的pH答案D解析生物是由共同的原始祖先進化而來的，各種生物之間具有或近或遠的親緣關系，親緣關系越近，則其對應基因的堿基序列的相似程度就越高，而基因控制蛋白質的合成，故其對應的蛋白質的氨基酸序列相似程度也就越高。因此，可以采用測定基因或蛋白質序列的方法進行判斷。若蛋白質的相似程度高，則進行電泳時，電泳帶的相似程度也就越高。不同動物的乳酸脫氫酶同工酶組成雖然不相同，但不能說明其pH就一定不相同。6.下圖表示對某蛋白質溶液進行變性膠電泳的結果(類似于紙層析法分離色素)，下列相關敘述不正確的是()A.蛋白質上某些基團解離后可使蛋白質帶電，電場中帶電的蛋白質分子(或多肽)會向著與其所帶電荷相反的電極移動B.蛋白質在變性膠中的遷移速率完全取決于其所帶凈電荷多少C.蛋白質在變性膠中的遷移速率基本取決于其相對分子質量大小D.電泳結果表明溶液中蛋白質可能有兩種，但也可能只有一種答案B解析蛋白質的氨基與羧基可發生解離，使其帶正電或負電，在電場中發生遷移。變性膠電泳所加的SDS可完全掩蓋蛋白質本身所帶電荷，故其遷移速率與本身所帶電荷無關，而由其分子大小決定。變性膠電泳會使蛋白質水解成肽鏈，故結果所示可能只有一種蛋白質(有兩種肽鏈)，也可能是兩種蛋白質。7.下圖是心臟、骨骼肌和腦中的乳酸脫氫酶同工酶的電泳圖譜，據圖分析下列說法中不正確的是()A.3種器官中都含有5種乳酸脫氫酶同工酶B.LDH2在心臟中含量最高，在骨骼肌中含量最低C.骨骼肌中含量最高的是LDH5，含量最低的LDH1D.不同的器官同一種同工酶的含量不同，同一器官不同的同工酶含量差別不大答案D解析電泳圖譜中每個器官形成了5個條帶，說明乳酸脫氫酶有5種同工酶。根據條帶的寬度可以判斷，LDH2在心臟中含量最高，在骨骼肌中含量最低，說明不同的器官同一種同工酶的含量不同。骨骼肌中含量最高的是LDH5，含量最低的是LDH1，說明同一器官不同的同工酶含量不同。[能力提升]8.下列說法不正確的是()A.在一定范圍內，緩沖溶液能夠抵制外界的酸和堿對溶液pH的影響，維持pH基本不變B.緩沖溶液通常由1～2種緩沖劑溶解于水中配制而成C.電泳是指帶電粒子在電場的作用下發生遷移的過程D.透析袋能使大分子自由進出，而將小分子保留在袋內答案D解析透析袋一般是用硝酸纖維素(又叫玻璃紙)制成的。透析袋能使小分子自由進出，而將大分子保留在袋內。透析可以除去樣品中分子量較小的雜質，或用于更換樣品的緩沖液。9.蛋白質的分離與純化是蛋白質研究的重要技術。下列有關敘述中，不正確的是()A.根據蛋白質分子不能透過半透膜的特性，可將樣品中各種不同的蛋白質分離B.根據蛋白質分子所帶電荷性質的差異及分子大小等，可利用電泳法分離蛋白質C.根據蛋白質相對分子質量的大小，可通過凝膠色譜法分離蛋白質D.根據蛋白質的分子大小、密度不同，可通過離心沉降法分離蛋白質答案A解析蛋白質分子是生物大分子，都不能通過半透膜，因此不能利用半透膜分離蛋白質；蛋白質分子所帶電荷性質的差異及分子大小，可以使蛋白質分子在電場中獲得不同的遷移速度，因此可以利用電泳法分離蛋白質；蛋白質相對分子質量的大小不同，通過凝膠柱的時間不同，可通過凝膠色譜法分離蛋白質；蛋白質的分子大小、密度不同，具有不同的離心力，可通過離心沉降法分離蛋白質。10.蛋白質各種特性的差異，可以用來分離不同種類的蛋白質。下列正確的是()A.分子的形狀、大小和溶解度B.所帶電荷的性質和多少C.對其他分子的親和力D.以上三項都是答案D解析根據蛋白質各種特性的差異，如分子的形狀和大小、所帶電荷的性質和多少、溶解度和吸附的性質及對其他分子的親和力等，都可以用來分離不同蛋白質。11.下列關于電泳的說法，不正確的是()A.電泳是指帶電粒子在電場的作用下發生遷移的過程B.帶電分子會向著與其所帶電荷相反的電極移動C.蛋白質在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決于它所帶凈電荷的多少D.用SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳，蛋白質的電泳遷移率完全取決于分子的大小答案C解析蛋白質在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決于它所帶凈電荷的多少以及分子的大小等因素，SDS能與各種蛋白質形成蛋白質—SDS復合物，SDS所帶負電荷的量大大超過了蛋白質分子原有的電荷量，因而掩蓋了不同種蛋白質間的電荷差異，使電泳遷移率完全取決于分子的大小。12.電泳技術是在外電場作用下，利用分子攜帶的凈電荷不同，把待測分子的混合物放在一定的介質(如瓊脂糖凝膠)中進行分離和分析的實驗技術。利用電泳技術可以分離氨基酸、多肽、蛋白質、核苷酸、核酸等物質和做親子鑒定。下列圖甲～丁是電泳裝置及相應電泳結果。請問答：(1)利用瓊脂糖凝膠電泳分離乳酸脫氫酶同工酶時，需將提取的蛋白質樣品加在圖甲中的________(填“正極”或“負極”)，理由是________________________________________。電泳過程中分子的遷移率除與本身所帶凈電荷的多少有關外，你認為還受什么因素的影響？(列出2種)_______________________________________________________________。(2)進行乳酸脫氫酶同工酶瓊酯糖凝膠電泳時，當圖乙中出現__________________________的現象，即可停止電泳。(3)圖丙是把含有21個氨基酸的多肽進行水解，得到的氨基酸混合物進行電泳的結果。故可推知該多肽由______________種氨基酸組成。(4)圖丁是通過提取某小孩和其母親以及待測定4位男性的DNA，分別由酶處理并擴增后，生成含有若干DNA片段的混合物，然后進行電泳所得到的一組DNA指紋圖譜，該小孩真正生物學上的父親是______________，理由是________________________________________________________________________。答案(1)負極在堿性緩沖液中帶負電荷的蛋白質在外加電場作用下會向正極移動電泳的電壓、被測分子的大小、被測分子的形狀、凝膠的種類密度等(2)溴酚藍指示劑電泳到凝膠底部(3)6(4)F2C和F2兩者的DNA指紋圖譜完全相同解析(1)將蛋白質樣品加在電泳槽的負極段的加樣孔，因為在堿性緩沖液中帶負電荷的蛋白質在外加電場作用下會向正極移動，電泳過程中分子的遷移率除受自身電荷的性質、電荷多少的影響外，還受電泳的電壓、被測分子的大小、被測分子的形狀、凝膠的種類密度等因素影響。(2)乳酸脫氫酶同工酶提取液加樣前，需與載體緩沖液混合，載體緩沖液中含有溴酚藍指示劑，作為電泳進行程度的指示劑，當溴酚藍指示劑電泳到凝膠底部意味著電泳結束。(3)圖中電泳結果出現6條帶，意味著含有6種氨基酸。(4)分析DNA指紋圖譜可知，C和F2兩者的DNA指紋圖譜完全相同。13.試回答下列“蛋白質的提取和分離實驗”的有關問題：(1)為了提取和分離血紅蛋白，首先對紅細胞進行洗滌以去除雜質蛋白，洗滌時應使用生理鹽水而不使用蒸餾水的原因是__________________________________。(2)若要去除血清蛋白中的小分子雜質，采用圖1裝置。透析液是________________，一段時間后，若向燒杯中加入雙縮脲試劑，透析袋內溶液是否出現紫色？并說明判斷的依據：________________________________________________________________________。(3)圖2、圖3分別表示電泳法分離蛋白質和紙層析法分離葉綠體中色素的結果。不同蛋白質得以分離是因為________________________________________________________________；不同色素得以分離是因為__________________________________。條帶c呈__________色。答案(1)防止紅細胞吸水漲破(2)(磷酸)緩沖液出現紫色。雙縮脲試劑可以透過半透膜，與袋內血紅蛋白反應，生成紫色物質(3)不同蛋白質所帶電荷性質、分子大小和形狀不同，導致電泳時遷移速度不同不同色素在層析液中溶解度不同，導致層析時擴散速度不同黃綠14.某生物興趣小組在“蛋白質的提取和分離”實驗中，準備從豬的血液中初步提取血紅蛋白，設計的“血紅蛋白提取、分離流程圖”如下：eq\x(實驗準備配制緩沖液、血細胞懸液)→eq\x(樣品處理洗滌、破碎、離心等)→eq\x(蛋白質粗分離透析)→eq\x(純化、純度鑒定凝膠色譜法、電泳等)請回答下列有