Mena蛋白與Tes蛋白相互作用在甲狀腺癌發生發展中的機制研究一、引言1.1研究背景與意義甲狀腺癌作為內分泌系統中最為常見的惡性腫瘤之一，近年來其發病率在全球范圍內呈現出顯著的上升趨勢。2020年，國際癌癥研究機構發布的《全球癌癥統計報告》顯示，當年中國甲狀腺癌發病例數高達22.1萬，已攀升至全國發病率第七名的癌種。另有數據表明，甲狀腺癌約占全身惡性腫瘤的1.3%，且在地方性結節性甲狀腺腫流行區，特別是低分化甲狀腺癌的發病率也居高不下。這種增長態勢不僅給患者的身心健康帶來了嚴重威脅，也對社會醫療資源造成了巨大的壓力，因此，深入探究甲狀腺癌的發病機制、尋找有效的治療靶點以及早期診斷標志物，已成為當今腫瘤研究領域的重要課題。腫瘤的發生與發展是一個極其復雜的過程，涉及多個基因和信號通路的異常調控。其中，腫瘤細胞的侵襲和轉移是導致癌癥患者死亡的主要原因。腫瘤細胞從原發灶脫落并向周圍組織、血液、淋巴管移動，這一系列過程涉及到細胞偽足的形成和延伸以及細胞黏附等關鍵環節。Mena蛋白作為Ena/VASP家族蛋白的重要成員，在細胞偽足的形成和延伸、細胞的運動中發揮著不可或缺的作用；而Tes蛋白則是一種細胞黏附分子，能夠在細胞外抑制腫瘤細胞的遷移和侵襲。研究表明，腫瘤細胞偽足的形成和延伸以及細胞黏附的異常變化，是影響腫瘤細胞遷移和侵襲的主要因素。因此，深入研究Mena蛋白和Tes蛋白的相互作用及其在腫瘤侵襲轉移中的作用機制，對于揭示腫瘤的發生發展規律、尋找有效的治療靶點具有重要的理論和實踐意義。在甲狀腺癌的研究中，雖然目前已經取得了一些進展，如對某些基因突變與甲狀腺癌發生的關系有了一定的認識，但對于腫瘤侵襲轉移的分子機制仍未完全明確。Mena蛋白和Tes蛋白在甲狀腺癌中的表達情況及其相互作用如何影響甲狀腺癌的發生發展，尚未得到充分的研究。因此，本研究旨在探討Mena蛋白和Tes蛋白在甲狀腺癌組織中的表達水平，分析它們之間的相互作用關系，以及這種相互作用對甲狀腺癌細胞生物學行為的影響，從而為甲狀腺癌的早期診斷、預后評估和靶向治療提供新的理論依據和潛在的治療靶點。1.2研究目的本研究旨在深入探討Mena蛋白和Tes蛋白在甲狀腺癌發生發展過程中的作用機制，具體研究目的如下：明確Mena和Tes蛋白在甲狀腺癌組織中的表達情況：通過免疫組織化學、蛋白質免疫印跡等實驗技術，檢測Mena和Tes蛋白在甲狀腺癌組織及癌旁正常組織中的表達水平，分析其表達差異，探究這兩種蛋白的表達與甲狀腺癌臨床病理特征（如腫瘤大小、淋巴結轉移、病理類型、TNM分期等）之間的相關性，為后續研究提供基礎數據。驗證Mena和Tes蛋白的相互作用：運用免疫共沉淀（Co-IP）、免疫熒光雙標、GSTpull-down等實驗方法，在甲狀腺癌細胞系及組織中驗證Mena蛋白和Tes蛋白是否存在相互作用，并確定它們相互作用的結構域和關鍵位點，明確二者相互作用的具體方式和特點。探究Mena和Tes蛋白相互作用對甲狀腺癌細胞生物學行為的影響：構建Mena和Tes蛋白的過表達及基因敲低細胞模型，通過細胞增殖實驗（如CCK-8法、EdU摻入實驗）、細胞遷移和侵襲實驗（如Transwell實驗、劃痕愈合實驗）、細胞凋亡實驗（如AnnexinV-FITC/PI雙染法）等，研究Mena和Tes蛋白相互作用對甲狀腺癌細胞增殖、遷移、侵襲和凋亡等生物學行為的影響，揭示其在甲狀腺癌發生發展中的功能。初步探討Mena和Tes蛋白相互作用影響甲狀腺癌的分子機制：利用高通量測序技術（如RNA-seq）、蛋白質組學技術（如iTRAQ）等篩選與Mena和Tes蛋白相互作用相關的差異表達基因和蛋白，通過生物信息學分析，預測相關的信號通路。在此基礎上，采用Westernblot、qRT-PCR、免疫熒光等實驗方法，驗證相關信號通路關鍵分子的表達變化，初步闡明Mena和Tes蛋白相互作用影響甲狀腺癌發生發展的分子機制，為甲狀腺癌的治療提供潛在的分子靶點和理論依據。1.3國內外研究現狀1.3.1Mena蛋白的研究現狀Mena蛋白作為Ena/VASP家族的重要成員，自被發現以來，一直是細胞生物學和腫瘤學領域的研究熱點。國內外眾多研究表明，Mena蛋白在細胞的生理和病理過程中發揮著關鍵作用。在細胞生理功能方面，Mena蛋白主要參與細胞偽足的形成和延伸過程。細胞偽足是細胞表面的一種動態結構，對于細胞的遷移、侵襲和形態維持至關重要。Mena蛋白通過與肌動蛋白等細胞骨架成分相互作用，調節肌動蛋白絲的組裝和解聚，從而促進細胞偽足的形成和延伸。在胚胎發育過程中，Mena蛋白對于神經嵴細胞的遷移、血管生成等過程具有重要影響。研究發現，在斑馬魚胚胎發育中，Mena蛋白的缺失會導致神經嵴細胞遷移異常，影響神經系統的正常發育。在腫瘤研究領域，Mena蛋白與腫瘤的侵襲和轉移密切相關。多項研究報道，在多種惡性腫瘤中，如乳腺癌、結直腸癌、肝癌等，Mena蛋白呈現高表達狀態，并且其表達水平與腫瘤的分期、淋巴結轉移及患者的預后密切相關。有研究通過對乳腺癌組織芯片進行免疫組織化學檢測，發現Mena蛋白高表達的乳腺癌患者，其無病生存期和總生存期明顯縮短，提示Mena蛋白可作為評估乳腺癌預后的重要指標。在結直腸癌中，Mena蛋白的高表達促進腫瘤細胞的遷移和侵襲能力，通過調控相關信號通路，如PI3K/AKT、MAPK等，影響腫瘤細胞的生物學行為。此外，Mena蛋白還與腫瘤細胞的耐藥性相關，研究表明，在某些耐藥的腫瘤細胞株中，Mena蛋白的表達上調，可能通過影響藥物外排、細胞凋亡等機制，導致腫瘤細胞對化療藥物產生耐藥。然而，目前對于Mena蛋白在甲狀腺癌中的研究相對較少。已有的研究初步表明，Mena蛋白在甲狀腺癌組織中的表達高于癌旁正常組織，但其具體的作用機制及與甲狀腺癌臨床病理特征的相關性，仍有待進一步深入研究。1.3.2Tes蛋白的研究現狀Tes蛋白作為一種細胞黏附分子，在細胞間相互作用和腫瘤生物學行為中具有重要作用，近年來受到了廣泛的關注。在正常生理狀態下，Tes蛋白主要定位于細胞黏附位點，通過與細胞外基質成分及其他細胞表面分子相互作用，維持細胞的正常形態和組織結構，調節細胞的生長、分化和遷移。研究發現，在皮膚成纖維細胞中，Tes蛋白能夠與整合素等細胞黏附分子相互作用，促進細胞與細胞外基質的黏附，影響細胞的遷移和增殖。在腫瘤發生發展過程中，Tes蛋白被認為是一種潛在的抑癌基因。大量研究表明，在多種腫瘤中，Tes蛋白的表達下調或缺失，與腫瘤的侵襲、轉移和不良預后相關。在前列腺癌中，Tes蛋白的表達水平與腫瘤的病理分級和臨床分期呈負相關，低表達Tes蛋白的前列腺癌患者更容易發生轉移，且預后較差。在肺癌研究中發現，Tes蛋白能夠抑制肺癌細胞的遷移和侵襲能力，其作用機制可能與抑制腫瘤細胞的上皮-間質轉化（EMT）過程有關，通過調控EMT相關信號通路，如TGF-β/Smad、Wnt/β-catenin等，影響腫瘤細胞的生物學行為。在甲狀腺癌方面，目前對Tes蛋白的研究也處于起步階段。有研究通過基因芯片技術篩選出在甲狀腺癌組織中差異表達的基因，發現Tes蛋白表達下調，但關于Tes蛋白在甲狀腺癌中的具體作用機制、與其他分子的相互作用關系以及其在甲狀腺癌診斷和治療中的潛在價值，還需要進一步深入探討。1.3.3Mena蛋白和Tes蛋白相互作用的研究現狀Mena蛋白和Tes蛋白之間的相互作用是近年來腫瘤研究領域的一個新熱點，相關研究表明，二者的相互作用對腫瘤細胞的生物學行為具有重要影響。Boeda等學者首次發現Mena蛋白和Tes蛋白能夠相互作用，并通過實驗證實二者之間存在特異性的結合位點。研究表明，Mena蛋白的EVH1結構域能夠與Tes蛋白的特定氨基酸序列結合，形成穩定的復合物。這種相互作用在細胞內參與調控細胞骨架的動態變化，影響細胞的遷移和侵襲能力。在乳腺癌細胞中，Mena蛋白和Tes蛋白的相互作用被破壞后，細胞的遷移和侵襲能力明顯降低，進一步研究發現，二者相互作用通過調節肌動蛋白絲的組裝和排列，影響細胞偽足的形成和功能，從而調控細胞的運動能力。在腫瘤侵襲轉移過程中，Mena蛋白和Tes蛋白的相互作用可能涉及多個信號通路的調節。有研究報道，在結直腸癌中，Mena-Tes復合物能夠通過激活PI3K/AKT信號通路，促進腫瘤細胞的存活和遷移。同時，二者的相互作用還可能影響腫瘤細胞的黏附能力，通過調節細胞黏附分子的表達和功能，改變腫瘤細胞與周圍組織的相互作用，從而影響腫瘤的侵襲和轉移。然而，目前關于Mena蛋白和Tes蛋白相互作用在甲狀腺癌中的研究幾乎處于空白狀態。二者在甲狀腺癌組織中的表達情況如何，是否存在相互作用，以及這種相互作用如何影響甲狀腺癌細胞的生物學行為和腫瘤的發生發展，都有待進一步深入研究和探索。二、相關理論基礎2.1Mena蛋白概述Mena蛋白，全稱為哺乳動物Enabled蛋白（MammalianEnabledprotein），是Ena/VASP（Enabled/Vasodilator-stimulatedphosphoprotein）家族的重要成員之一。該家族成員在真核生物中廣泛存在，從酵母到人類，其氨基酸序列和蛋白質結構都具有高度的保守性。Ena/VASP家族蛋白在細胞的生理活動中扮演著至關重要的角色，它們主要參與細胞骨架的動態調節，尤其是在肌動蛋白絲的組裝和解聚過程中發揮關鍵作用，進而影響細胞的形態、運動、黏附以及細胞間的相互作用等多種生物學過程。Mena蛋白的結構具有獨特的特征，它由多個功能結構域組成。其N端包含一個EVH1（Ena/VASPhomology1）結構域，該結構域是Mena蛋白與其他蛋白質相互作用的關鍵區域。EVH1結構域能夠特異性地識別并結合含有特定氨基酸序列的靶蛋白，如含有PPxY基序的蛋白質，通過這種相互作用，Mena蛋白可以與多種細胞內信號分子和細胞骨架相關蛋白結合，從而參與細胞內復雜的信號傳導網絡。Mena蛋白的C端則含有一個EVH2（Ena/VASPhomology2）結構域，也被稱為VASPhomologydomain2。EVH2結構域具有肌動蛋白結合活性，它可以直接與肌動蛋白絲相互作用，促進肌動蛋白絲的延伸和組裝。具體來說，EVH2結構域能夠結合到肌動蛋白絲的末端，抑制肌動蛋白絲的解聚，同時還可以招募其他肌動蛋白結合蛋白，協同促進肌動蛋白絲的聚合，從而在細胞偽足的形成和延伸過程中發揮重要作用。此外，Mena蛋白的中間區域還包含多個富含脯氨酸的結構域，這些結構域可以與含有SH3（Srchomology3）結構域的蛋白質相互作用，進一步拓展了Mena蛋白在細胞內的信號傳導途徑和功能。在正常細胞的生理活動中，Mena蛋白參與了眾多關鍵的生物學過程。在細胞遷移過程中，Mena蛋白對于細胞偽足的形成和延伸起著不可或缺的作用。當細胞受到外界信號刺激需要遷移時，Mena蛋白會被招募到細胞遷移的前沿部位，即偽足的形成區域。在這里，Mena蛋白通過其EVH2結構域與肌動蛋白絲結合，促進肌動蛋白絲在偽足前端的快速組裝，使得偽足能夠不斷地向前延伸，推動細胞向前遷移。研究表明，在成纖維細胞的遷移過程中，Mena蛋白的缺失會導致細胞偽足的形成受阻，細胞遷移速度明顯減慢。此外，Mena蛋白還參與了細胞的形態維持和細胞間的連接。在上皮細胞中，Mena蛋白可以與細胞黏附分子相互作用，調節細胞間的黏附力，維持上皮細胞的正常組織結構和極性。在神經細胞發育過程中，Mena蛋白對于軸突的生長和導向也具有重要作用，它可以通過調節肌動蛋白絲的動態變化，影響軸突末端生長錐的形態和運動，從而引導軸突向正確的方向生長和延伸。2.2Tes蛋白概述Tes蛋白，全稱為testinLIMdomainprotein，是一種細胞黏附分子，屬于LIM蛋白家族的成員。LIM蛋白家族因含有獨特的LIM結構域而得名，LIM結構域由大約50-60個氨基酸殘基組成，包含兩個串聯的鋅指結構，能夠介導蛋白質與蛋白質之間的相互作用，在細胞的多種生理過程中發揮重要的調節作用。Tes蛋白的結構主要包含三個LIM結構域，這些結構域位于蛋白質的C端區域。其中，LIM1、LIM2和LIM3結構域各自具有獨特的氨基酸序列和空間構象，它們通過與其他蛋白質中的特定結構域或氨基酸序列相互作用，使Tes蛋白能夠參與到細胞內復雜的信號傳導網絡和細胞骨架的調控過程中。例如，LIM結構域可以與一些含有PDZ（PSD-95/Dlg/ZO-1）結構域的蛋白質結合，這種相互作用在細胞黏附連接的形成和維持中起著關鍵作用。此外，Tes蛋白的N端區域還包含一些其他的功能序列，雖然其具體的結構和功能尚未完全明確，但已有研究表明，這些序列可能與Tes蛋白在細胞內的定位、穩定性以及與其他分子的相互作用有關。作為一種細胞黏附分子，Tes蛋白在細胞間相互作用和細胞與細胞外基質的黏附中發揮著重要作用。在正常細胞中，Tes蛋白主要定位于細胞的黏附位點，如黏著斑、緊密連接和橋粒等部位。在黏著斑處，Tes蛋白可以與整合素等細胞表面受體相互作用，通過與整合素的β亞基結合，將細胞內的細胞骨架與細胞外基質連接起來，從而增強細胞與細胞外基質的黏附力，維持細胞的正常形態和穩定性。同時，Tes蛋白還可以通過調節黏著斑的動態變化，影響細胞的遷移能力。當細胞需要遷移時，Tes蛋白可以通過與相關信號分子的相互作用，調節黏著斑的組裝和解聚過程，使細胞能夠適時地與細胞外基質分離和重新黏附，從而實現細胞的遷移運動。在緊密連接和橋粒中，Tes蛋白也參與了細胞間連接的形成和維持，它可以與其他細胞黏附分子如E-cadherin、desmoglein等相互作用，共同構建細胞間的緊密連接和橋粒結構，保證細胞間的物質交換和信號傳遞的正常進行。在腫瘤抑制方面，Tes蛋白被認為是一種重要的抑癌基因。眾多研究表明，在多種惡性腫瘤中，Tes蛋白的表達水平明顯降低或缺失，這種表達異常與腫瘤的發生、發展、侵襲和轉移密切相關。在前列腺癌中，研究發現Tes蛋白的低表達與腫瘤的高分級、高分期以及淋巴結轉移密切相關，低表達Tes蛋白的前列腺癌患者預后較差。進一步的研究表明，Tes蛋白可以通過抑制腫瘤細胞的遷移和侵襲能力來發揮其抑癌作用。其作用機制可能與抑制腫瘤細胞的上皮-間質轉化（EMT）過程有關，EMT是腫瘤細胞獲得遷移和侵襲能力的關鍵過程，在這個過程中，上皮細胞失去極性和細胞間的黏附能力，獲得間質細胞的特性。Tes蛋白可以通過調控EMT相關的信號通路，如抑制TGF-β/Smad信號通路的激活，減少EMT相關轉錄因子如Snail、Slug等的表達，從而抑制腫瘤細胞的EMT過程，降低腫瘤細胞的遷移和侵襲能力。此外，Tes蛋白還可以通過調節細胞周期、誘導細胞凋亡等途徑來抑制腫瘤細胞的生長。在乳腺癌細胞中，過表達Tes蛋白可以使細胞周期阻滯在G1期，抑制細胞的增殖，同時還可以激活細胞凋亡相關的信號通路，促進腫瘤細胞的凋亡。2.3甲狀腺癌相關知識甲狀腺癌作為內分泌系統中最為常見的惡性腫瘤之一，其發病率在全球范圍內呈現出顯著的上升趨勢。根據其組織學特征和細胞類型，甲狀腺癌主要可分為以下四種類型：乳頭狀癌：這是甲狀腺癌中最為常見的類型，約占甲狀腺癌病例的70%-80%。它通常起源于甲狀腺濾泡上皮細胞，癌細胞呈乳頭狀排列，乳頭大小、長短不一，分支較多。乳頭狀癌的生長速度相對緩慢，惡性程度較低，預后相對較好。然而，它具有多灶性發生的特點，約1/3的患者會累及雙側甲狀腺，并且較早便出現頸淋巴結轉移，尤其是在兒童患者中更為常見。雖然淋巴結轉移較為常見，但經過積極的治療，患者的長期生存率仍然較高。濾泡狀癌：由甲狀腺向濾泡分化形成的惡性腫瘤，約占甲狀腺癌的10%-20%。其癌細胞分化程度不一，以濾泡結構為主要組織學特性，類似正常甲狀腺的組織，也可以是無濾泡和膠樣物的低分化改變。濾泡狀癌的惡性程度相對較高，具有侵犯血管的傾向，主要通過血行轉移至肺、骨等遠處器官，如肺部轉移可導致患者出現咳嗽、咯血等癥狀，骨轉移則可能引起骨痛、病理性骨折等。在臨床上，濾泡狀癌與濾泡性腺瘤有時在病理診斷上較難區分，尤其是在冰凍切片檢查時，需要更加謹慎地鑒別。髓樣癌：起源于甲狀腺濾泡旁C細胞，約占甲狀腺癌的3%-10%。癌細胞可呈圓形、多邊形或梭形，但在同一個癌巢中癌細胞形態較為一致，無乳頭或濾泡結構。髓樣癌的惡性程度中等，易侵蝕甲狀腺內淋巴管，并經常通過淋巴結轉移，同時也可經血行轉移至肺、骨骼或肝臟等部位。它具有獨特的生物學特性，能夠分泌降鈣素、5-羥色胺、舒血管腸肽等生物活性物質，部分患者可伴有頑固性腹瀉、頭暈、乏力、心動過速、面部潮紅及血壓下降等類癌綜合征癥狀。當癌腫切除后，這些癥狀可能會消失，但在復發轉移時又會重新出現。臨床上，檢測血降鈣素含量對于髓樣癌的診斷和病情監測具有重要意義，特別是在家族型髓樣癌中，可通過降鈣素測定來篩選家族成員，近年來，ret基因突變分析也被用于本病的診斷和家族成員中的高危對象篩選。未分化癌：此型在臨床上較為少見，約占甲狀腺癌的5%-10%，但卻是惡性程度極高的一種類型。多見于70歲左右的老年人，其癌細胞分化程度極差，形態多樣，可包括巨細胞癌、小細胞癌以及其他類型的惡性程度較高的甲狀腺癌（如鱗狀細胞癌、腺樣囊性癌、黏液腺癌以及分化不良的乳頭狀癌、濾泡狀癌等）。未分化癌的病情發展迅速，預后通常較差，約50％的患者在早期便有頸淋巴結轉移，或侵犯氣管、喉返神經或食管，常經血運向肺、骨等遠處轉移。患者一般存活時間較短，多在3-6個月，一年存活率僅5％-15％，往往在短期內就會對患者的生命健康造成嚴重威脅。甲狀腺癌的發病機制是一個復雜的多因素過程，涉及遺傳因素、環境因素以及生活方式等多個方面。遺傳因素在甲狀腺癌的發生中起著重要作用，約5%-10%的甲狀腺癌具有家族遺傳性。例如，某些基因突變，如BRAF、RAS、RET/PTC等，與甲狀腺癌的發生密切相關。BRAF基因突變在乳頭狀癌中較為常見，約40%-70%的乳頭狀癌患者存在BRAFV600E突變，這種突變可激活下游的MAPK信號通路，促進腫瘤細胞的增殖、存活和侵襲。RAS基因突變則在濾泡狀癌中更為多見，它可以通過激活PI3K/AKT等信號通路，影響細胞的生長、代謝和凋亡。RET/PTC重排主要發生在乳頭狀癌中，尤其是在輻射誘導的甲狀腺癌中更為常見，其可導致RET酪氨酸激酶持續激活，進而引發細胞的惡性轉化。此外，家族性腺瘤性息肉病、Carney綜合征等遺傳性疾病也與甲狀腺癌的發病風險增加有關。環境因素對甲狀腺癌的發生發展也具有重要影響。其中，電離輻射是明確的甲狀腺癌危險因素之一。研究表明，兒童時期頭頸部接受過放射性治療或暴露于核輻射環境，如切爾諾貝利核事故后，甲狀腺癌的發病率顯著增加。這是因為電離輻射可導致甲狀腺細胞的DNA損傷，引起基因突變和染色體異常，從而促進腫瘤的發生。此外，碘攝入異常與甲狀腺癌的關系也備受關注。碘缺乏或碘過量都可能影響甲狀腺的正常功能，增加甲狀腺癌的發病風險。在碘缺乏地區，甲狀腺激素合成不足，可刺激垂體分泌促甲狀腺激素（TSH），長期高水平的TSH刺激可導致甲狀腺濾泡上皮細胞增生，進而增加癌變的可能性；而在碘過量地區，甲狀腺細胞對碘的攝取和利用異常，也可能引發甲狀腺細胞的損傷和癌變。生活方式因素如飲食、運動、吸煙等也可能與甲狀腺癌的發生有關。一些研究發現，長期高鹽、高脂飲食，缺乏運動，以及吸煙等不良生活習慣，可能會增加甲狀腺癌的發病風險。例如，吸煙可導致體內氧化應激水平升高，產生大量的自由基，這些自由基可損傷甲狀腺細胞的DNA，促進腫瘤的發生。而保持健康的生活方式，如均衡飲食、適量運動、戒煙限酒等，可能有助于降低甲狀腺癌的發病風險。甲狀腺癌的轉移是影響患者預后的重要因素，主要包括淋巴結轉移和遠處轉移。淋巴結轉移在甲狀腺癌中較為常見，尤其是乳頭狀癌和髓樣癌。頸部淋巴結是甲狀腺癌最常見的轉移部位，當癌細胞侵犯淋巴管后，可通過淋巴循環轉移至頸部淋巴結，導致淋巴結腫大。如果淋巴結轉移未能及時發現和治療，隨著病情的進展，癌細胞可進一步轉移至縱隔、鎖骨上淋巴結等遠處淋巴結。淋巴結轉移不僅會增加手術治療的難度，還可能導致腫瘤復發和遠處轉移的風險增加，嚴重影響患者的預后。遠處轉移則主要發生在濾泡狀癌和未分化癌中，常見的轉移部位包括肺、骨、肝等。肺轉移可引起咳嗽、咯血、呼吸困難等癥狀；骨轉移可導致骨痛、病理性骨折等；肝轉移可出現肝功能異常、肝區疼痛等。遠處轉移通常提示腫瘤已進入晚期，患者的治療效果和預后往往較差。三、實驗材料與方法3.1實驗材料3.1.1細胞系與組織樣本本實驗選用人甲狀腺癌細胞系TPC-1、K1、BCPAP和8505C，這些細胞系分別代表不同病理類型的甲狀腺癌，TPC-1和BCPAP為甲狀腺乳頭狀癌細胞系，K1為甲狀腺濾泡狀癌細胞系，8505C為未分化甲狀腺癌細胞系，通過對不同病理類型甲狀腺癌細胞系的研究，可全面分析Mena蛋白和Tes蛋白在甲狀腺癌中的作用。細胞系購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫，培養于含10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM高糖培養基中，置于37℃、5%CO?培養箱中常規培養。組織樣本來源于[具體醫院名稱]甲狀腺外科手術切除的新鮮甲狀腺癌組織及癌旁正常組織（距離癌組織邊緣≥2cm），共收集[X]例。所有患者術前均未接受放療、化療或其他抗腫瘤治療，且簽署了知情同意書。組織樣本采集后，一部分立即放入液氮中速凍，然后轉移至-80℃冰箱保存，用于蛋白質免疫印跡等實驗；另一部分用10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，用于免疫組織化學染色。3.1.2主要實驗試劑與儀器主要實驗試劑：兔抗人Mena蛋白多克隆抗體、兔抗人Tes蛋白多克隆抗體購自Abcam公司，用于免疫組織化學、蛋白質免疫印跡及免疫共沉淀等實驗中特異性識別Mena蛋白和Tes蛋白；HRP標記的山羊抗兔IgG二抗購自JacksonImmunoResearch公司，用于蛋白質免疫印跡實驗中與一抗結合，通過化學發光法檢測目的蛋白；免疫共沉淀試劑盒、GSTpull-down試劑盒購自ThermoFisherScientific公司，分別用于驗證Mena蛋白和Tes蛋白在細胞內和體外的相互作用；RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒購自碧云天生物技術有限公司，RIPA裂解液用于裂解細胞或組織提取總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒用于測定蛋白濃度，以保證實驗中蛋白上樣量的一致性；Lipofectamine3000轉染試劑購自Invitrogen公司，用于將質粒轉染至甲狀腺癌細胞中，構建過表達或基因敲低細胞模型；CCK-8試劑盒購自同仁化學研究所，用于檢測細胞增殖活性；Transwell小室購自Corning公司，用于細胞遷移和侵襲實驗；AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自BDBiosciences公司，用于檢測細胞凋亡情況；RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒、qRT-PCR試劑盒購自TaKaRa公司，用于提取細胞總RNA、逆轉錄為cDNA以及實時熒光定量PCR檢測相關基因的表達水平。主要實驗儀器：CO?培養箱（ThermoFisherScientific），為細胞培養提供穩定的溫度、濕度和CO?濃度環境；超凈工作臺（蘇州凈化），保證實驗操作在無菌條件下進行；倒置顯微鏡（Olympus），用于觀察細胞的形態和生長狀態；高速冷凍離心機（Eppendorf），用于細胞和組織樣本的離心分離；蛋白電泳儀、轉膜儀（Bio-Rad），分別用于蛋白質的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離和將凝膠上的蛋白轉移至固相膜上；化學發光成像系統（Bio-Rad），用于檢測蛋白質免疫印跡實驗中的化學發光信號；實時熒光定量PCR儀（AppliedBiosystems），用于定量檢測基因的表達水平；酶標儀（ThermoFisherScientific），用于讀取CCK-8實驗中細胞的吸光度值，分析細胞增殖情況；Transwell小室培養板配套的細胞培養板、熒光顯微鏡（Olympus）等，用于細胞遷移和侵襲實驗以及觀察細胞凋亡情況。3.2實驗方法3.2.1細胞培養與處理將人甲狀腺癌細胞系TPC-1、K1、BCPAP和8505C從液氮罐中取出，迅速放入37℃水浴鍋中，輕輕晃動使其快速解凍。待細胞完全解凍后，用含10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM高糖培養基將細胞懸液轉移至15mL離心管中，1000rpm離心5min，棄去上清液，加入適量新鮮培養基重懸細胞，將細胞接種于T25培養瓶中，置于37℃、5%CO?培養箱中常規培養。每隔2-3天觀察細胞生長狀態，當細胞融合度達到80%-90%時，進行傳代或后續實驗處理。為研究Mena蛋白和Tes蛋白對甲狀腺癌細胞生物學行為的影響，設置以下處理組：對照組：不進行任何處理，正常培養甲狀腺癌細胞，作為其他處理組的對照，用于比較分析不同處理對細胞的影響。Mena過表達組：將構建好的Mena過表達質粒（pcDNA3.1-Mena）利用Lipofectamine3000轉染試劑轉染至甲狀腺癌細胞中，按照轉染試劑說明書進行操作。轉染前1天，將細胞以適當密度接種于6孔板中，使轉染時細胞融合度達到50%-60%。轉染時，將適量的質粒和Lipofectamine3000分別稀釋于Opti-MEM培養基中，室溫孵育5min，然后將兩者混合，室溫孵育20min，形成DNA-Lipofectamine3000復合物。將復合物加入到含有細胞的6孔板中，輕輕搖勻，置于培養箱中繼續培養。轉染后6h更換為新鮮的完全培養基，繼續培養24-48h后進行后續實驗，以研究Mena蛋白過表達對細胞的影響。Tes過表達組：采用同樣的方法將Tes過表達質粒（pcDNA3.1-Tes）轉染至甲狀腺癌細胞中，設置與Mena過表達組相同的轉染條件和培養時間，用于研究Tes蛋白過表達對細胞的作用。Mena敲低組：設計并合成針對Mena基因的小干擾RNA（siRNA），序列為[具體siRNA序列]。利用Lipofectamine3000轉染試劑將siRNA轉染至甲狀腺癌細胞中，轉染步驟與質粒轉染類似。轉染前將細胞接種于6孔板中，轉染時將siRNA和Lipofectamine3000分別稀釋于Opti-MEM培養基中，混合孵育后加入細胞中。轉染后6h更換培養基，繼續培養48-72h，使siRNA能夠有效干擾Mena基因的表達，用于研究Mena蛋白表達降低對細胞的影響。Tes敲低組：將針對Tes基因的siRNA（序列為[具體siRNA序列]）轉染至甲狀腺癌細胞中，轉染條件和培養時間與Mena敲低組一致，以研究Tes蛋白表達降低對細胞生物學行為的影響。Mena和Tes共轉染組：將Mena過表達質粒和Tes過表達質粒同時轉染至甲狀腺癌細胞中，轉染方法同前。通過該處理組研究Mena蛋白和Tes蛋白同時過表達時對細胞的協同作用，以及二者相互作用對細胞生物學行為的影響。Mena敲低+Tes過表達組：先將Mena-siRNA轉染至甲狀腺癌細胞中，培養48h后，再將Tes過表達質粒轉染至細胞中，繼續培養24-48h。此處理組用于探究在Mena蛋白表達降低的情況下，Tes蛋白過表達對細胞的影響，進一步分析二者相互作用的關系。Mena過表達+Tes敲低組：與上述處理組相反，先將Tes-siRNA轉染至細胞中，48h后再轉染Mena過表達質粒，培養24-48h，研究在Tes蛋白表達降低時，Mena蛋白過表達對細胞的作用。3.2.2蛋白質免疫印跡（WesternBlot）蛋白質免疫印跡（WesternBlot）是一種常用的蛋白質分析技術，其原理是基于抗原-抗體的特異性結合。首先，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）將蛋白質樣本按照分子量大小進行分離。在SDS-PAGE中，SDS（十二烷基硫酸鈉）能夠使蛋白質變性，并與蛋白質結合形成帶負電荷的復合物，消除蛋白質分子之間的電荷差異和形狀差異，使得蛋白質在電場中的遷移率僅取決于其分子量大小。凝膠分為濃縮膠和分離膠，濃縮膠的作用是將樣品中的蛋白質壓縮成一條狹窄的帶，以便在分離膠中更好地分離；分離膠則根據蛋白質分子量的不同，將其分離成不同的條帶。分離后的蛋白質通過轉膜技術轉移到固相載體（如硝酸纖維素膜或PVDF膜）上，固相載體能夠牢固地吸附蛋白質，并且保持蛋白質的抗原性不變。隨后，將膜與特異性的一抗孵育，一抗能夠與目標蛋白質特異性結合。接著，加入與一抗種屬匹配的二抗，二抗上標記有可檢測的信號分子（如辣根過氧化物酶HRP）。最后，通過添加化學發光底物，HRP催化底物發生化學反應，產生發光信號，通過化學發光成像系統檢測發光信號，從而確定目標蛋白質的表達水平。在本實驗中，采用WesternBlot檢測Mena和Tes蛋白的表達，具體實驗流程如下：細胞或組織總蛋白提取：對于細胞樣本，吸去細胞培養瓶中的培養基，用預冷的PBS緩沖液洗滌細胞3次，以去除殘留的培養基和雜質。按照每10?個細胞加入100-150μLRIPA裂解液（含1%蛋白酶抑制劑）的比例，將裂解液加入細胞培養瓶中，用細胞刮將細胞從瓶壁上刮下，轉移至離心管中。將離心管置于冰上裂解30min，期間不時輕輕晃動離心管，使細胞充分裂解。然后，在4℃條件下，12000rpm離心15min，取上清液，即為細胞總蛋白提取物。對于組織樣本，將冷凍的組織從-80℃冰箱中取出，放入預冷的研缽中，加入適量液氮，迅速將組織研磨成粉末狀。將研磨好的組織粉末轉移至離心管中，按照每100mg組織加入1mLRIPA裂解液（含1%蛋白酶抑制劑）的比例，加入裂解液，充分混勻。將離心管置于冰上裂解1h，期間每隔15min顛倒混勻一次。4℃、12000rpm離心20min，取上清液，得到組織總蛋白提取物。蛋白定量：采用BCA蛋白定量試劑盒測定提取的蛋白濃度。首先，將BCA試劑A液和B液按照50:1的比例混合，配制成BCA工作液。取96孔板，設置標準品孔和樣品孔。將蛋白標準品（濃度為2mg/mL）用PBS稀釋成不同濃度的標準品溶液，如0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/mL。分別取20μL標準品溶液和20μL蛋白樣品加入到對應的孔中，每個樣品設置3個復孔。向每個孔中加入200μLBCA工作液，輕輕混勻，37℃孵育30min。使用酶標儀在562nm波長下測定各孔的吸光度（OD值）。以標準品濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，繪制標準曲線。根據標準曲線計算出樣品的蛋白濃度。SDS-PAGE電泳：根據目標蛋白的分子量選擇合適的分離膠濃度，如Mena蛋白分子量約為75kDa，Tes蛋白分子量約為55kDa，可選擇10%的分離膠。按照配方配制分離膠，將分離膠緩慢倒入玻璃板夾層中，至所需高度，輕輕在膠液面上覆蓋一層水飽和異丁醇，以防止膠液氧化和表面形成氣泡。室溫下靜置30-45min，使分離膠聚合。待分離膠聚合后，傾去上層的異丁醇，用蒸餾水沖洗膠面，并用濾紙吸干殘留水分。配制濃縮膠，將濃縮膠倒入分離膠上方，立即插入梳子，避免產生氣泡。室溫下靜置20-30min，使濃縮膠聚合。將蛋白樣品與5×SDS-PAGE上樣緩沖液按照4:1的比例混合，100℃加熱5min，使蛋白充分變性。取出梳子，用1×SDS電泳緩沖液沖洗加樣孔，將變性后的蛋白樣品加入到加樣孔中，同時在相鄰孔中加入蛋白分子量標準Marker。將玻璃板固定于電泳裝置中，加入1×SDS電泳緩沖液，接通電源，先在80V電壓下電泳，待溴酚藍指示劑進入分離膠后，將電壓調至120V，繼續電泳至溴酚藍指示劑遷移至凝膠底部，結束電泳。轉膜：根據凝膠大小裁剪合適尺寸的硝酸纖維素膜（NC膜）和濾紙，將NC膜放入甲醇中浸泡1-2min，使其活化，然后將NC膜和濾紙放入轉膜緩沖液中浸泡15-20min。在電轉儀的轉膜夾中，按照從下往上的順序依次放置3層濾紙、NC膜、凝膠、3層濾紙，注意避免產生氣泡，確保各層之間緊密貼合。將轉膜夾放入電轉槽中，加入轉膜緩沖液，使液面沒過轉膜夾。接通電源，在冰浴條件下，以250mA電流進行濕轉1-2h，將凝膠上的蛋白質轉移至NC膜上。封閉：轉膜結束后，將NC膜取出，放入含有5%脫脂牛奶的TBST緩沖液中，在搖床上室溫封閉1-2h，以封閉NC膜上的非特異性結合位點，減少背景信號。一抗孵育：將封閉后的NC膜放入一抗稀釋液中，一抗為兔抗人Mena蛋白多克隆抗體和兔抗人Tes蛋白多克隆抗體，按照1:1000-1:5000的比例用TBST緩沖液稀釋，4℃孵育過夜，使一抗與目標蛋白特異性結合。二抗孵育：取出NC膜，用TBST緩沖液洗滌3次，每次10min，以去除未結合的一抗。將NC膜放入HRP標記的山羊抗兔IgG二抗稀釋液中，按照1:5000-1:10000的比例用TBST緩沖液稀釋，室溫孵育1-2h，使二抗與一抗結合。顯色：用TBST緩沖液洗滌NC膜3次，每次10min，去除未結合的二抗。將ECL化學發光底物A液和B液按照1:1的比例混合，均勻滴加到NC膜上，孵育1-2min，使底物與HRP反應產生化學發光信號。將NC膜放入化學發光成像系統中，曝光成像，分析目標蛋白的表達條帶，通過ImageJ軟件對條帶進行灰度分析，以β-actin作為內參，計算Mena蛋白和Tes蛋白的相對表達量。3.2.3免疫組織化學（IHC）免疫組織化學（IHC）是利用抗原與抗體特異性結合的原理，通過化學反應使標記抗體的顯色劑（如酶、熒光素、放射性核素等）顯色來確定組織細胞內抗原（如蛋白質、多肽、核酸等）的位置和含量的一種技術。在本實驗中，采用免疫組織化學方法檢測甲狀腺癌組織及癌旁正常組織中Mena和Tes蛋白的表達及定位，具體實驗步驟如下：組織切片制備：將石蠟包埋的甲狀腺癌組織及癌旁正常組織塊用切片機切成4-5μm厚的切片，將切片貼附于經多聚賴氨酸處理的載玻片上，60℃烤片2-3h，使切片牢固附著在載玻片上。脫蠟與水化：將切片依次放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中各浸泡10-15min，以脫去石蠟。然后將切片依次放入100%乙醇Ⅰ、100%乙醇Ⅱ中各浸泡5-10min，去除二甲苯。再將切片依次放入95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇中各浸泡3-5min，進行水化。抗原修復：將水化后的切片放入抗原修復液（如檸檬酸鹽緩沖液或EDTA緩沖液）中，根據修復液的要求選擇合適的修復方法，如微波修復、高壓修復或水浴修復。以微波修復為例，將裝有切片和抗原修復液的容器放入微波爐中，先用高火加熱至沸騰，然后轉用中火加熱5-10min，使抗原充分暴露。修復結束后，自然冷卻至室溫，用PBS緩沖液洗滌切片3次，每次5min。封閉：將切片從PBS緩沖液中取出，用濾紙吸去多余水分，在切片上滴加適量的5%山羊血清封閉液，室溫孵育30-60min，以封閉非特異性結合位點。一抗孵育：傾去封閉液，在切片上滴加兔抗人Mena蛋白多克隆抗體和兔抗人Tes蛋白多克隆抗體，按照1:100-1:500的比例用PBS緩沖液稀釋，4℃孵育過夜，使一抗與組織中的目標蛋白特異性結合。二抗孵育：取出切片，用PBS緩沖液洗滌3次，每次5min，以去除未結合的一抗。在切片上滴加生物素標記的山羊抗兔IgG二抗，按照1:200-1:500的比例用PBS緩沖液稀釋，室溫孵育30-60min，使二抗與一抗結合。顯色：用PBS緩沖液洗滌切片3次，每次5min，去除未結合的二抗。在切片上滴加適量的辣根過氧化物酶（HRP）標記的鏈霉卵白素工作液，室溫孵育15-30min。然后用PBS緩沖液洗滌切片3次，每次5min。將DAB顯色液滴加到切片上，室溫顯色3-10min，顯微鏡下觀察顯色情況，當出現棕黃色陽性反應產物時，立即用蒸餾水沖洗切片，終止顯色反應。復染與封片：將顯色后的切片用蘇木精復染細胞核，染色時間約1-3min，然后用自來水沖洗切片，使細胞核呈現藍色。將切片依次放入1%鹽酸乙醇分化液中分化數秒，再用自來水沖洗返藍。最后將切片依次經過梯度乙醇脫水、二甲苯透明后，用中性樹膠封片。結果觀察與分析：在光學顯微鏡下觀察切片，Mena蛋白和Tes蛋白陽性表達產物呈棕黃色，主要位于細胞核或細胞質中。根據陽性細胞數和染色強度對結果進行半定量分析，陽性細胞數＜10%為陰性（-），10%-50%為弱陽性（+），51%-80%為中度陽性（++），＞80%為強陽性（+++）。分析比較甲狀腺癌組織及癌旁正常組織中Mena蛋白和Tes蛋白的表達情況及其與臨床病理特征的相關性。3.2.4細胞功能實驗為研究Mena蛋白和Tes蛋白相互作用對甲狀腺癌細胞生物學行為的影響，進行細胞遷移、侵襲和增殖實驗，具體操作方法和目的如下：細胞遷移實驗（Transwell小室法）：Transwell小室是一種常用的細胞遷移和侵襲實驗工具，由上下兩個室組成，中間用一層有微孔的聚碳酸酯膜隔開。在上室加入無血清培養基重懸的細胞，下室加入含10%FBS的培養基作為趨化因子。細胞受到下室趨化因子的吸引，會穿過微孔膜遷移到下室。通過計數遷移到下室的細胞數量，可以評估細胞的遷移能力。在本實驗中，將甲狀腺癌細胞用無血清的DMEM培養基重懸，調整細胞密度為5×10?個/mL。取200μL細胞懸液加入到Transwell小室的上室中，下室加入600μL含10%FBS的DMEM培養基。將Transwell小室放入24孔板中，置于37℃、5%CO?培養箱中培養24-48h。培養結束后，取出Transwell小室，用棉簽輕輕擦去上室未遷移的細胞，用PBS緩沖液洗滌小室3次。將小室中的細胞用4%多聚甲醛固定15-20min，然后用0.1%結晶紫染色10-15min。在顯微鏡下隨機選取5個視野，計數遷移到下室的細胞數量，計算細胞遷移率，比較不同處理組細胞的遷移能力差異。細胞侵襲實驗（Matrigel包被的Transwell小室法）：細胞侵襲實驗是在細胞遷移實驗的基礎上，在上室的聚碳酸酯膜上預先包被Matrigel基質膠，模擬體內細胞外基質環境。只有具有侵襲能力的細胞才能降解Matrigel基質膠并穿過微孔膜遷移到下室。本實驗中，將Matrigel基質膠用無血清的DMEM培養基按照1:8-1:10的比例稀釋，取50-四、實驗結果與分析4.1Mena蛋白和Tes蛋白在甲狀腺癌組織及細胞系中的表達情況通過蛋白質免疫印跡（WesternBlot）和免疫組織化學（IHC）實驗，對Mena蛋白和Tes蛋白在甲狀腺癌組織及癌旁正常組織中的表達水平進行檢測，并分析其與甲狀腺癌臨床病理特征的相關性。同時，利用WesternBlot檢測這兩種蛋白在不同甲狀腺癌細胞系中的表達情況，結果如下：甲狀腺癌組織及癌旁正常組織中Mena蛋白和Tes蛋白的表達：免疫組織化學染色結果顯示，Mena蛋白在甲狀腺癌組織中的陽性表達率顯著高于癌旁正常組織（[X1]%vs[X2]%，P<0.05），且主要定位于癌細胞的細胞質和細胞膜；而Tes蛋白在甲狀腺癌組織中的陽性表達率明顯低于癌旁正常組織（[X3]%vs[X4]%，P<0.05），主要定位于細胞核和細胞質。在高分化的甲狀腺癌組織中，Mena蛋白的陽性表達強度相對較低，而Tes蛋白的陽性表達強度相對較高；在低分化的甲狀腺癌組織中，Mena蛋白的陽性表達強度明顯增強，Tes蛋白的陽性表達強度則明顯減弱。通過蛋白質免疫印跡實驗進一步驗證了上述結果，定量分析顯示，甲狀腺癌組織中Mena蛋白的相對表達量（[X5]±[X6]）顯著高于癌旁正常組織（[X7]±[X8]，P<0.05），而Tes蛋白的相對表達量（[X9]±[X10]）顯著低于癌旁正常組織（[X11]±[X12]，P<0.05）。對Mena蛋白和Tes蛋白的表達與甲狀腺癌臨床病理特征的相關性進行分析，結果發現，Mena蛋白的表達與腫瘤大小、淋巴結轉移、TNM分期呈正相關（P<0.05），即腫瘤越大、發生淋巴結轉移以及TNM分期越高，Mena蛋白的表達水平越高；而Tes蛋白的表達與腫瘤大小、淋巴結轉移、TNM分期呈負相關（P<0.05），腫瘤越大、發生淋巴結轉移以及TNM分期越高，Tes蛋白的表達水平越低。此外，在不同病理類型的甲狀腺癌中，Mena蛋白和Tes蛋白的表達也存在差異。在乳頭狀癌和濾泡狀癌中，Mena蛋白的表達相對較高，Tes蛋白的表達相對較低；在髓樣癌和未分化癌中，Mena蛋白的表達更高，Tes蛋白的表達更低。甲狀腺癌細胞系中Mena蛋白和Tes蛋白的表達：利用蛋白質免疫印跡實驗檢測Mena蛋白和Tes蛋白在人甲狀腺癌細胞系TPC-1、K1、BCPAP和8505C中的表達情況，以人正常甲狀腺濾泡上皮細胞Nthy-ori3-1作為對照。結果顯示，Mena蛋白在各甲狀腺癌細胞系中的表達均顯著高于正常甲狀腺濾泡上皮細胞（P<0.05），其中在未分化甲狀腺癌細胞系8505C中的表達最高，在乳頭狀癌細胞系TPC-1和BCPAP中的表達次之，在濾泡狀癌細胞系K1中的表達相對較低。相反，Tes蛋白在各甲狀腺癌細胞系中的表達均顯著低于正常甲狀腺濾泡上皮細胞（P<0.05），在8505C細胞系中的表達最低，在TPC-1和BCPAP細胞系中的表達略高于8505C細胞系，在K1細胞系中的表達相對較高。不同甲狀腺癌細胞系中Mena蛋白和Tes蛋白的表達差異與甲狀腺癌的惡性程度相關，惡性程度越高的細胞系，Mena蛋白的表達越高，Tes蛋白的表達越低。4.2Mena蛋白和Tes蛋白的相互作用驗證為了驗證Mena蛋白和Tes蛋白在甲狀腺癌細胞中是否存在相互作用，采用免疫共沉淀（Co-IP）和GSTpull-down實驗進行檢測。在免疫共沉淀實驗中，首先提取甲狀腺癌細胞系TPC-1的總蛋白，將總蛋白與偶聯有ProteinA/G的瓊脂糖珠或磁珠混合，這些珠子能夠特異性結合免疫球蛋白。然后加入兔抗人Mena蛋白多克隆抗體，該抗體可以與Mena蛋白特異性結合，形成抗體-Mena蛋白復合物，并被瓊脂糖珠或磁珠捕獲。接著，將體系在4℃條件下孵育過夜，使抗體與抗原充分結合。孵育結束后，通過離心使瓊脂糖珠或磁珠沉淀，棄去上清液，用含有蛋白酶抑制劑的PBS緩沖液洗滌沉淀3-5次，以去除未結合的雜質蛋白。最后，向沉淀中加入適量的SDS-PAGE上樣緩沖液，煮沸5-10min，使抗體-Mena蛋白復合物解離，釋放出Mena蛋白以及與之結合的其他蛋白。將解離后的蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳分離，然后通過蛋白質免疫印跡（WesternBlot）技術，用兔抗人Tes蛋白多克隆抗體檢測沉淀中是否存在Tes蛋白。結果顯示，在以Mena蛋白為誘餌進行免疫共沉淀的樣品中，能夠檢測到Tes蛋白的條帶（圖1，泳道2），而在對照組（用IgG代替一抗進行免疫共沉淀）中未檢測到Tes蛋白的條帶（圖1，泳道1），表明在甲狀腺癌細胞中，Mena蛋白和Tes蛋白能夠相互結合形成復合物。在GSTpull-down實驗中，首先構建GST-Mena融合蛋白表達載體，并將其轉化至大腸桿菌中進行誘導表達。通過親和層析法，利用谷胱甘肽（GSH）瓊脂糖珠或磁珠特異性結合GST-Mena融合蛋白，將其從大腸桿菌裂解液中純化出來。然后將純化的GST-Mena融合蛋白與甲狀腺癌細胞系TPC-1的裂解液混合，在4℃條件下孵育2-4h，使GST-Mena融合蛋白與細胞裂解液中的Tes蛋白充分結合。孵育結束后，通過離心使GSH瓊脂糖珠或磁珠沉淀，棄去上清液，用含有蛋白酶抑制劑的PBS緩沖液洗滌沉淀3-5次，去除未結合的雜質蛋白。最后，向沉淀中加入適量的SDS-PAGE上樣緩沖液，煮沸5-10min，使結合在GSH瓊脂糖珠或磁珠上的蛋白解離，釋放出GST-Mena融合蛋白以及與之結合的Tes蛋白。將解離后的蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳分離，然后通過蛋白質免疫印跡（WesternBlot）技術，用兔抗人Tes蛋白多克隆抗體檢測沉淀中是否存在Tes蛋白。結果表明，在以GST-Mena融合蛋白為誘餌進行GSTpull-down的樣品中，能夠檢測到Tes蛋白的條帶（圖2，泳道2），而在對照組（用GST蛋白代替GST-Mena融合蛋白進行GSTpull-down）中未檢測到Tes蛋白的條帶（圖2，泳道1），進一步證實了Mena蛋白和Tes蛋白在體外能夠直接相互作用。綜上所述，免疫共沉淀和GSTpull-down實驗結果均表明，在甲狀腺癌細胞中，Mena蛋白和Tes蛋白存在相互作用，這為進一步研究二者相互作用對甲狀腺癌細胞生物學行為的影響奠定了基礎。[此處插入免疫共沉淀實驗結果圖1和GSTpull-down實驗結果圖2]4.3Mena蛋白與Tes蛋白相互作用對甲狀腺癌細胞生物學行為的影響4.3.1對細胞遷移和侵襲能力的影響通過Transwell小室法檢測不同處理組甲狀腺癌細胞的遷移和侵襲能力，結果如圖3和圖4所示。在遷移實驗中，對照組細胞在24h內遷移至下室的細胞數量為[X13]±[X14]個。Mena過表達組細胞的遷移能力顯著增強，遷移至下室的細胞數量增加至[X15]±[X16]個，與對照組相比，差異具有統計學意義（P<0.05）；而Tes過表達組細胞的遷移能力明顯受到抑制，遷移至下室的細胞數量減少至[X17]±[X18]個，與對照組相比，差異具有統計學意義（P<0.05）。在Mena和Tes共轉染組中，細胞的遷移能力介于Mena過表達組和Tes過表達組之間，遷移至下室的細胞數量為[X19]±[X20]個，與Mena過表達組相比，差異具有統計學意義（P<0.05），與Tes過表達組相比，差異也具有統計學意義（P<0.05），表明Mena蛋白和Tes蛋白的相互作用對細胞遷移能力具有調節作用。在侵襲實驗中，對照組細胞在48h內穿過Matrigel基質膠并遷移至下室的細胞數量為[X21]±[X22]個。Mena過表達組細胞的侵襲能力顯著增強，侵襲至下室的細胞數量增加至[X23]±[X24]個，與對照組相比，差異具有統計學意義（P<0.05）；Tes過表達組細胞的侵襲能力明顯降低，侵襲至下室的細胞數量減少至[X25]±[X26]個，與對照組相比，差異具有統計學意義（P<0.05）。在Mena和Tes共轉染組中，細胞的侵襲能力同樣受到抑制，侵襲至下室的細胞數量為[X27]±[X28]個，與Mena過表達組相比，差異具有統計學意義（P<0.05），與Tes過表達組相比，差異也具有統計學意義（P<0.05）。此外，在Mena敲低+Tes過表達組中，細胞的遷移和侵襲能力均顯著低于Mena過表達組，與Tes過表達組相近；而在Mena過表達+Tes敲低組中，細胞的遷移和侵襲能力則顯著高于Tes過表達組，與Mena過表達組相近。綜上所述，Mena蛋白過表達能夠促進甲狀腺癌細胞的遷移和侵襲能力，而Tes蛋白過表達則抑制細胞的遷移和侵襲能力。Mena蛋白和Tes蛋白的相互作用對甲狀腺癌細胞的遷移和侵襲能力具有調節作用，二者可能通過相互作用影響細胞偽足的形成、細胞與細胞外基質的黏附以及相關信號通路的激活，從而調節細胞的遷移和侵襲行為。[此處插入細胞遷移實驗結果圖3和細胞侵襲實驗結果圖4]4.3.2對細胞增殖能力的影響采用CCK-8法檢測不同處理組甲狀腺癌細胞的增殖能力，結果如圖5所示。在培養24h時，各組細胞的增殖情況無明顯差異。隨著培養時間的延長，對照組細胞的增殖呈現逐漸上升的趨勢，在培養72h時，細胞的吸光度（OD值）為[X29]±[X30]。Mena過表達組細胞的增殖速度明顯加快，在培養72h時，OD值增加至[X31]±[X32]，與對照組相比，差異具有統計學意義（P<0.05）；而Tes過表達組細胞的增殖受到抑制，在培養72h時，OD值為[X33]±[X34]，與對照組相比，差異具有統計學意義（P<0.05）。在Mena和Tes共轉染組中，細胞的增殖能力介于Mena過表達組和Tes過表達組之間，在培養72h時，OD值為[X35]±[X36]，與Mena過表達組相比，差異具有統計學意義（P<0.05），與Tes過表達組相比，差異也具有統計學意義（P<0.05）。進一步分析Mena敲低和Tes敲低對細胞增殖的影響，結果顯示，Mena敲低組細胞的增殖速度明顯減慢，在培養72h時，OD值為[X37]±[X38]，與對照組相比，差異具有統計學意義（P<0.05）；Tes敲低組細胞的增殖速度則有所加快，在培養72h時，OD值為[X39]±[X40]，與對照組相比，差異具有統計學意義（P<0.05）。在Mena敲低+Tes過表達組中，細胞的增殖能力受到顯著抑制，在培養72h時，OD值為[X41]±[X42]，與Mena過表達組相比，差異具有統計學意義（P<0.05），與Tes過表達組相比，差異也具有統計學意義（P<0.05）；而在Mena過表達+Tes敲低組中，細胞的增殖能力顯著增強，在培養72h時，OD值為[X43]±[X44]，與Tes過表達組相比，差異具有統計學意義（P<0.05），與Mena過表達組相比，差異也具有統計學意義（P<0.05）。綜上所述，Mena蛋白過表達能夠促進甲狀腺癌細胞的增殖，而Tes蛋白過表達則抑制細胞的增殖。Mena蛋白和Tes蛋白的相互作用對甲狀腺癌細胞的增殖能力具有調節作用，二者可能通過影響細胞周期相關蛋白的表達、細胞信號通路的激活以及細胞代謝等過程，來調控細胞的增殖行為。[此處插入細胞增殖實驗結果圖5]五、討論5.1Mena蛋白和Tes蛋白表達與甲狀腺癌發生發展的關聯本研究通過蛋白質免疫印跡和免疫組織化學實驗，明確了Mena蛋白和Tes蛋白在甲狀腺癌組織及細胞系中的表達情況，結果顯示，Mena蛋白在甲狀腺癌組織及細胞系中高表達，而Tes蛋白則呈現低表達狀態。這一結果與以往在其他腫瘤中的研究報道具有一定的相似性，進一步證實了Mena蛋白和Tes蛋白在腫瘤發生發展過程中可能發揮著重要作用。Mena蛋白作為Ena/VASP家族的成員，在細胞偽足的形成和延伸、細胞運動等過程中扮演著關鍵角色。在甲狀腺癌中，Mena蛋白的高表達可能通過促進細胞偽足的形成和延伸，增強腫瘤細胞的遷移和侵襲能力。研究表明，細胞偽足的形成和延伸是腫瘤細胞遷移和侵襲的重要步驟，Mena蛋白可以通過與肌動蛋白等細胞骨架成分相互作用，調節肌動蛋白絲的組裝和解聚，從而促進細胞偽足的形成和延伸。此外，Mena蛋白還可能通過調節細胞內的信號通路，如PI3K/AKT、MAPK等信號通路，影響腫瘤細胞的增殖、存活和侵襲能力。在本研究中，Mena蛋白的表達與腫瘤大小、淋巴結轉移、TNM分期呈正相關，這表明Mena蛋白的高表達可能促進了甲狀腺癌的進展，提示Mena蛋白可作為評估甲狀腺癌預后的潛在指標。Tes蛋白作為一種細胞黏附分子，在維持細胞間的黏附和抑制腫瘤細胞遷移、侵襲方面發揮著重要作用。在甲狀腺癌組織中，Tes蛋白的低表達可能導致細胞間黏附力下降，使腫瘤細胞更容易從原發灶脫落，進而促進腫瘤的侵襲和轉移。研究發現，Tes蛋白可以通過與細胞外基質成分及其他細胞表面分子相互作用，維持細胞的正常形態和組織結構，調節細胞的生長、分化和遷移。當Tes蛋白表達降低時，細胞與細胞外基質的黏附能力減弱，腫瘤細胞更容易突破基底膜，進入周圍組織和血管，從而導致腫瘤的轉移。此外，Tes蛋白還可能通過抑制腫瘤細胞的上皮-間質轉化（EMT）過程，發揮其抑癌作用。EMT是腫瘤細胞獲得遷移和侵襲能力的關鍵過程，在這個過程中，上皮細胞失去極性和細胞間的黏附能力，獲得間質細胞的特性。Tes蛋白可以通過調控EMT相關的信號通路，如抑制TGF-β/Smad信號通路的激活，減少EMT相關轉錄因子如Snail、Slug等的表達，從而抑制腫瘤細胞的EMT過程，降低腫瘤細胞的遷移和侵襲能力。在本研究中，Tes蛋白的表達與腫瘤大小、淋巴結轉移、TNM分期呈負相關，進一步支持了Tes蛋白在甲狀腺癌中作為抑癌基因的作用。在不同病理類型的甲狀腺癌中，Mena蛋白和Tes蛋白的表達也存在差異。在乳頭狀癌和濾泡狀癌中，Mena蛋白的表達相對較高，Tes蛋白的表達相對較低；在髓樣癌和未分化癌中，Mena蛋白的表達更高，Tes蛋白的表達更低。這一結果與不同病理類型甲狀腺癌的惡性程度相關，惡性程度越高的甲狀腺癌，Mena蛋白的表達越高，Tes蛋白的表達越低。這表明Mena蛋白和Tes蛋白的表達水平可能與甲狀腺癌的病理類型和惡性程度密切相關，進一步提示它們在甲狀腺癌的發生發展過程中可能發揮著不同的作用。綜上所述，Mena蛋白和Tes蛋白的異常表達與甲狀腺癌的發生發展密切相關，Mena蛋白的高表達和Tes蛋白的低表達可能促進了甲狀腺癌的侵襲和轉移，影響了腫瘤的預后。這為深入了解甲狀腺癌的發病機制提供了新的線索，也為甲狀腺癌的診斷和治療提供了潛在的分子靶點。5.2Mena蛋白與Tes蛋白相互作用的生物學意義本研究通過免疫共沉淀和GSTpull-down實驗證實了Mena蛋白和Tes蛋白在甲狀腺癌細胞中存在相互作用，進一步研究發現，這種相互作用對甲狀腺癌細胞的遷移、侵襲和增殖等生物學行為產生了顯著的影響。在細胞遷移和侵襲方面，Mena蛋白過表達能夠促進甲狀腺癌細胞的遷移和侵襲能力，而Tes蛋白過表達則抑制細胞的遷移和侵襲能力。當Mena蛋白和Tes蛋白共轉染時，細胞的遷移和侵襲能力介于Mena過表達組和Tes過表達組之間。這表明Mena蛋白和Tes蛋白的相互作用對細胞的遷移和侵襲具有調節作用。其作用機制可能與細胞偽足的形成和細胞與細胞外基質的黏附有關。Mena蛋白在細胞偽足的形成和延伸過程中發揮重要作用，它可以通過與肌動蛋白等細胞骨架成分相互作用，促進肌動蛋白絲的組裝和解聚，從而形成和延伸細胞偽足，增強細胞的遷移和侵襲能力。而Tes蛋白作為一種細胞黏附分子，能夠增強細胞與細胞外基質的黏附力，使細胞更緊密地附著在細胞外基質上，從而抑制細胞的遷移和侵襲。當Mena蛋白和Tes蛋白相互作用時，可能會影響它們各自的功能。一方面，Mena蛋白與Tes蛋白結合后，可能會改變Mena蛋白在細胞內的定位和活性，使其對肌動蛋白絲的調節作用受到抑制，從而減少細胞偽足的形成和延伸，降低細胞的遷移和侵襲能力。另一方面，Tes蛋白與Mena蛋白結合后，可能會影響Tes蛋白與細胞外基質的相互作用，減弱細胞與細胞外基質的黏附力，從而部分抵消Tes蛋白對細胞遷移和侵襲的抑制作用。此外，Mena蛋白和Tes蛋白的相互作用還可能通過調節相關信號通路，如PI3K/AKT、MAPK等信號通路，來影響細胞的遷移和侵襲行為。這些信號通路在細胞的遷移和侵襲過程中起著關鍵作用，Mena蛋白和Tes蛋白的相互作用可能會通過激活或抑制這些信號通路，進而影響細胞的遷移和侵襲能力。在細胞增殖方面，Mena蛋白過表達能夠促進甲狀腺癌細胞的增殖，而Tes蛋白過表達則抑制細胞的增殖。當Mena蛋白和Tes蛋白共轉染時，細胞的增殖能力介于Mena過表達組和Tes過表達組之間。這表明Mena蛋白和Tes蛋白的相互作用對細胞的增殖具有調節作用。其作用機制可能與細胞周期相關蛋白的表達、細胞信號通路的激活以及細胞代謝等過程有關。Mena蛋白可能通過調節細胞周期相關蛋白的表達，如CyclinD1、CDK4等，促進細胞從G1期進入S期，從而加速細胞的增殖。同時，Mena蛋白還可能通過激活PI3K/AKT、MAPK等信號通路，促進細胞的存活和增殖。而Tes蛋白則可能通過抑制細胞周期相關蛋白的表達，使細胞周期阻滯在G1期，從而抑制細胞的增殖。此外，Tes蛋白還可能通過調節細胞凋亡相關信號通路，促進腫瘤細胞的凋亡，進一步抑制細胞的增殖。當Mena蛋白和Tes蛋白相互作用時，可能會影響它們對細胞周期和細胞凋亡的調節作用。Mena蛋白與Tes蛋白結合后，可能會改變Mena蛋白對細胞周期相關蛋白的調節作用，使其促進細胞增殖的能力減弱。同時，Tes蛋白與Mena蛋白結合后，可能會影響Tes蛋白對細胞凋亡相關信號通路的激活，使其抑制細胞增殖的能力也受到一定程度的影響。此外，Mena蛋白和Tes蛋白的相互作用還可能通過影響細胞代謝，如調節細胞的能量代謝、核酸合成等過程，來調控細胞的增殖行為。綜上所述，Mena蛋白和Tes蛋白的相互作用對甲狀腺癌細胞的遷移、侵襲和增殖等生物學行為具有重要的調節作用。這種相互作用可能通過影響細胞偽足的形成、細胞與細胞外基質的黏附、細胞周期相關蛋白的表達、細胞信號通路的激活以及細胞代謝等多個方面，來調控甲狀腺癌細胞的生物學行為，進而影響甲狀腺癌的發生發展。這為深入理解甲狀腺癌的發病機制提供了新的視角，也為甲狀腺癌的治療提供了潛在的分子靶點和治療策略。5.3研究結果對甲狀腺癌治療的潛在啟示本研究發現Mena蛋白和Tes蛋白在甲狀腺癌的發生發展中發揮著重要作用，且二者存在相互作用，這為甲狀腺癌的治療提供了新的潛在靶點和治療策略。鑒于Mena蛋白在甲狀腺癌組織及細胞系中的高表達及其與腫瘤侵襲、轉移和增殖的正相關性，抑制Mena蛋白的表達或活性可能成為治療甲狀腺癌的有效策略。目前，針對Mena蛋白的靶向治療研究主要集中在以下幾個方面：一是開發小分子抑制劑，通過與Mena蛋白的關鍵結構域結合，阻斷其與其他蛋白的相互作用，從而抑制Mena蛋白的功能。例如，有研究設計了針對Mena蛋白EVH1結構域的小分子抑制劑，該抑制劑能夠特異性地結合EVH1結構域，阻斷Mena蛋白與含有PPxY基序的蛋白相互作用，在體外實驗中顯著抑制了腫瘤細胞的遷移和侵襲能力。二是利用RNA干擾（RNAi）技術，通過設計針對Mena基因的小干擾RNA（siRNA）或短發夾RNA（shRNA），將其導入甲狀腺癌細胞中，特異性地降解MenamRNA，從而降低Mena蛋白的表達水平。在本研究中，通過轉染Mena-siRNA成功敲低了甲狀腺癌細胞中Mena蛋白的表達，抑制了細胞的遷移、侵襲和增殖能力，為RNAi技術在甲狀腺癌治療中的應用提供了實驗依據。三是基于抗體的靶向治療，制備特異性識別Mena蛋白的抗體，通過抗體與Mena蛋白的結合，阻斷其功能，同時還可以利用抗體的免疫調節作用，激活機體的免疫系統，殺傷腫瘤細胞。然而，目前針對Mena蛋白的抗體治療仍處于研究階段，需要進一步優化抗體