H9N2亞型禽流感病毒HA基因真核與原核表達及單因子血清制備的研究一、引言1.1研究背景禽流感（AvianInfluenza，AI），是由正粘病毒科、流感病毒屬、A型流感病毒引起的禽類疾病，國際獸醫局（OIE）將其列為A類動物疫病，我國也將其定為一類動物傳染病。禽流感病毒不僅能在禽類中廣泛傳播，還存在向人類傳播的可能性，嚴重威脅著禽類養殖業的發展和人類的健康。自1994年我國首次報道H9N2亞型禽流感流行以來，該病毒已成為我國當前禽流感病毒的主要類型，對養禽業的危害日益嚴重，其與公共衛生方面的聯系也引發了廣泛關注。H9N2亞型禽流感病毒在全球多個地區的家禽和野生鳥類中廣泛流行。在我國，它已成為雞群和鴨群中的優勢流行病毒。從1994年我國分離到第一株H9N2亞型禽流感病毒后，其在我國禽類中持續傳播。感染H9N2亞型禽流感病毒的蛋雞，常出現輸卵管功能異常，產褪色蛋、畸形蛋、砂皮蛋、軟殼蛋等，雞群產蛋率可下降30%-80%，病程可持續月余，給養禽業帶來了巨大的經濟損失。例如，1998年秋H9N2亞型禽流感在我國短時間內席卷多數省份，雖當時因其毒力較弱未引起足夠重視，但后續研究發現，其部分流行株的致病力明顯變異，對肉仔雞的死亡率可達30％以上，對產蛋高峰期的蛋雞，產蛋下降幅度大且恢復困難。H9N2亞型禽流感病毒對人類健康也存在一定威脅。1998年，我國科學家從廣東、深圳等地的急性呼吸道感染患者體內首次分離到H9N2亞型禽流感病毒株，證實了該病毒能夠感染人類。此后，我國多個地區如廣東、四川、湖南、江西、云南、安徽、北京等地均出現過人感染H9N2禽流感病毒的散發病例，除個別病例發生在孟加拉國和埃及外，目前報道的H9N2禽流感病毒人類感染病例主要集中在我國。雖然H9N2禽流感病毒屬于低致病性禽流感病毒，人類感染病例的臨床表現大多較輕，類似于季節性流感，主要癥狀為發熱、咳嗽，預后良好，很少導致病人死亡，且未發現人與人間傳播的病例，但不同的禽流感病毒在禽類動物中常常會發生基因重組，我國流行的H7N9禽流感病毒就是H7N3和H9N2禽流感病毒發生基因重組后產生的，這表明H9N2禽流感病毒的流行不容忽視，仍需加強監測。血凝素（Hemagglutinin，HA）基因在禽流感病毒的生命活動中起著關鍵作用。HA基因編碼的HA蛋白是禽流感病毒的主要表面糖蛋白，在病毒吸附、穿膜過程以及病毒的致病力方面均發揮著重要作用。HA蛋白可以誘導宿主對流感病毒產生免疫反應，是宿主免疫系統識別病毒的重要抗原。對H9N2亞型禽流感病毒HA基因的研究，有助于深入理解該病毒的致病機制、傳播規律以及免疫逃逸機制，為禽流感的防控提供重要的理論基礎。通過對HA基因的克隆和序列分析，可以確定基因的DNA或RNA序列，預測蛋白質序列，通過比較不同菌株的序列差異，能夠研究病毒的演化和傳播路徑，了解病毒的變異規律。在疫苗設計方面，HA是大多數禽流感病毒的主要抗原，由于HA的高度變異性和突變，對HA基因進行詳細的序列分析和結構分析，有助于選擇最合適的抗原特異性進行疫苗的設計與制備，從而提高疫苗的防控效果，達到高效抗病毒的目的。綜上所述，H9N2亞型禽流感病毒對禽類養殖業和人類健康構成了威脅，對其HA基因的研究具有重要的理論和實踐意義。本研究旨在通過對H9N2亞型禽流感病毒HA基因的真核和原核表達及其單因子血清的制備，為進一步研究該病毒的致病機制、開發有效的診斷方法和防控措施奠定基礎。1.2H9N2亞型禽流感病毒HA基因概述H9N2亞型禽流感病毒的HA基因是一段長度約為1700個核苷酸的片段，其結構較為復雜，包含前導肽以及HA1、HA2兩個重要區域。前導肽在病毒蛋白的合成和轉運過程中發揮著引導作用，確保HA蛋白能夠準確地定位到病毒的包膜上。HA1區域是HA基因的主要免疫原，其上分布著許多關鍵的變異位點，這些位點的變化對病毒的抗原性和毒力有著顯著影響。例如，HA1的118位、135位、155位、162位、173位和183位等位點的變異，可能導致病毒抗原性的改變，使得宿主免疫系統難以識別病毒，從而影響疫苗的免疫效果；同時，這些位點的變化也可能與病毒的毒力相關，改變病毒在宿主體內的致病能力。HA2區域則在病毒與宿主細胞的融合過程中起著關鍵作用，它能夠介導病毒包膜與宿主細胞膜的融合，使病毒核酸得以進入宿主細胞，進而啟動病毒的復制過程。HA基因編碼的HA蛋白作為禽流感病毒的主要表面糖蛋白，在病毒的生命活動中扮演著不可或缺的角色。在病毒感染宿主的過程中，HA蛋白首先與宿主細胞表面的特異性受體結合，這種結合具有高度的特異性，決定了病毒的宿主范圍和組織嗜性。對于H9N2亞型禽流感病毒來說，其HA蛋白主要識別宿主細胞表面含唾液酸α-2,3-半乳糖（SAα2,3Gal）和唾液酸α-2,6-半乳糖（SAα2,6Gal）的受體，其中對SAα2,3Gal受體的親和力相對較高，這使得該病毒更容易感染禽類細胞，但也有研究表明，部分H9N2毒株對SAα2,6Gal受體的結合能力有所增強，增加了其感染人類等哺乳動物的風險。一旦HA蛋白與受體結合，病毒就會通過內吞作用進入宿主細胞，隨后HA蛋白在酸性環境下發生構象變化，暴露出融合肽，融合肽插入宿主細胞膜，促使病毒包膜與宿主細胞膜融合，從而將病毒基因組釋放到宿主細胞內，完成病毒的感染過程。在免疫應答方面，HA蛋白是宿主免疫系統識別禽流感病毒的關鍵抗原。當機體感染H9N2亞型禽流感病毒后，免疫系統會迅速識別HA蛋白，并啟動免疫應答反應。機體首先會產生針對HA蛋白的特異性抗體，這些抗體能夠與病毒表面的HA蛋白結合，從而阻止病毒與宿主細胞的結合，中和病毒的感染性，這種作用被稱為中和抗體的中和作用。此外，HA蛋白還能夠激活細胞免疫應答，刺激T淋巴細胞的活化和增殖，T淋巴細胞可以直接殺傷被病毒感染的細胞，或者分泌細胞因子調節免疫反應，增強機體對病毒的清除能力。HA蛋白的抗原性變異會影響機體的免疫應答效果，當HA蛋白發生變異時，原有的中和抗體可能無法有效地識別和結合病毒，導致免疫逃逸的發生，使得病毒能夠在宿主體內持續感染和傳播。1.3研究目的與意義本研究旨在通過對H9N2亞型禽流感病毒HA基因進行真核和原核表達，并制備其單因子血清，為深入探究該病毒的致病機制、研發高效的診斷方法和防控策略提供重要的物質基礎和技術支持。在病毒防控方面，H9N2亞型禽流感病毒在全球禽類中廣泛流行，對養禽業造成了巨大的經濟損失，同時還存在感染人類的風險，對公共衛生安全構成潛在威脅。通過本研究，能夠更深入地了解HA基因的結構與功能，以及其在病毒感染和免疫逃逸過程中的作用機制，從而為制定更有效的防控措施提供科學依據。例如，明確HA基因上關鍵變異位點與病毒毒力和傳播能力的關系后，可以針對性地加強對攜帶這些變異位點毒株的監測，及時采取隔離、撲殺等防控手段，防止病毒的大規模傳播。在疫苗研發方面，HA蛋白是禽流感病毒的主要抗原，是疫苗研發的關鍵靶點。然而，由于H9N2亞型禽流感病毒的不斷變異，現有的疫苗防控效果受到了挑戰。通過本研究獲得的HA基因表達產物和單因子血清，可以用于篩選和評估新型疫苗候選株，研究疫苗的免疫原性和保護效果，優化疫苗的設計和制備工藝，提高疫苗對不同變異毒株的免疫保護能力，為開發出更高效、更具針對性的禽流感疫苗奠定基礎。在診斷技術方面，準確、快速的診斷方法對于禽流感的早期防控至關重要。本研究制備的單因子血清具有高度的特異性，可用于建立基于血清學的診斷方法，如酶聯免疫吸附試驗（ELISA）、血凝抑制試驗（HI）等，提高對H9N2亞型禽流感病毒感染的檢測靈敏度和準確性，實現對病毒感染的早期診斷和疫情監測，為及時采取防控措施爭取寶貴時間。綜上所述，本研究對于有效防控H9N2亞型禽流感病毒的傳播、保障養禽業的健康發展以及維護人類的公共衛生安全具有重要的現實意義。二、材料與方法2.1實驗材料2.1.1病毒株、菌株與載體H9N2亞型禽流感病毒株A/chicken/Guangdong/1/2019（以下簡稱GD1株），由本實驗室從廣東地區發病雞群中分離并保存。該毒株經過嚴格的鑒定，通過病毒分離培養、血凝與血凝抑制試驗以及RT-PCR技術，證實其為H9N2亞型禽流感病毒，且具有典型的生物學特性。大腸桿菌菌株DH5α和BL21(DE3)，購自天根生化科技（北京）有限公司。DH5α菌株常用于質粒的克隆和擴增，其具有較高的轉化效率和穩定的遺傳特性，能夠滿足本研究中基因克隆和載體構建的需求；BL21(DE3)菌株則是原核表達的常用菌株，其攜帶T7RNA聚合酶基因，能夠高效表達外源基因，為HA基因的原核表達提供了良好的宿主環境。真核表達載體pVAX1和原核表達載體pET-32a(+)，均購自Invitrogen公司。pVAX1載體含有CMV啟動子，能夠在真核細胞中高效啟動外源基因的轉錄和表達，且具有氨芐青霉素抗性基因，便于在大腸桿菌中進行篩選和擴增；pET-32a(+)載體帶有Trx標簽和His標簽，能夠促進外源蛋白的可溶性表達，并方便后續通過親和層析進行蛋白純化，同時其也具有氨芐青霉素抗性基因，確保載體在大腸桿菌中的穩定存在。2.1.2實驗動物與細胞6-8周齡SPF級BALB/c小鼠，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，用于制備H9N2亞型禽流感病毒HA蛋白的單因子血清。BALB/c小鼠具有免疫應答能力強、遺傳背景清晰等優點，能夠產生高效價的特異性抗體，為單因子血清的制備提供了可靠的實驗動物模型。雞胚成纖維細胞（CEF），由本實驗室自行制備。取9-11日齡SPF雞胚，無菌操作取出雞胚，去除頭、四肢和內臟后，用胰蛋白酶消化法制備成單細胞懸液，接種于細胞培養瓶中，在含10%胎牛血清的DMEM培養基中，于37℃、5%CO?培養箱中培養，待細胞長滿單層后備用。CEF細胞對禽流感病毒具有良好的敏感性，能夠支持H9N2亞型禽流感病毒的增殖和感染，為HA基因的真核表達和病毒感染研究提供了合適的細胞模型。2.1.3主要試劑與儀器PrimeScript?RTreagentKitwithgDNAEraser反轉錄試劑盒、PremixTaq?DNA聚合酶、限制性內切酶EcoRI和XhoI、T4DNA連接酶，均購自TaKaRa公司。這些試劑在分子生物學實驗中具有重要作用，反轉錄試劑盒能夠高效地將病毒RNA反轉錄為cDNA，為后續的PCR擴增提供模板；DNA聚合酶具有高保真、高效率的特點，能夠準確地擴增目的基因片段；限制性內切酶能夠特異性地切割DNA雙鏈，為載體構建和基因克隆提供合適的酶切位點；T4DNA連接酶則能夠將目的基因片段與載體連接起來，形成重組表達載體。DMEM培養基、胎牛血清，購自Gibco公司。DMEM培養基是細胞培養中常用的基礎培養基，含有細胞生長所需的各種營養成分；胎牛血清則為細胞提供了生長因子、激素、氨基酸等多種營養物質，能夠促進細胞的生長和增殖，確保CEF細胞在培養過程中的良好狀態。ProteinA/GAgarose親和層析介質，購自ThermoFisherScientific公司。該親和層析介質能夠特異性地結合抗體，通過親和層析的方法，可以高效地純化單因子血清中的抗體，提高血清的純度和質量。其他常規試劑，如瓊脂糖、Tris、EDTA、NaCl、甘油等，均為國產分析純試劑，用于配制各種緩沖液和溶液，滿足實驗中的不同需求。PCR儀（型號：ABIVeriti96-WellThermalCycler），購自ThermoFisherScientific公司，具有精確的溫度控制和快速的升降溫速度，能夠滿足PCR反應中對溫度和時間的嚴格要求，確保目的基因的高效擴增。凝膠成像系統（型號：Bio-RadGelDocXR+），購自Bio-Rad公司，能夠對瓊脂糖凝膠電泳后的DNA片段進行快速、準確的成像和分析，通過觀察目的條帶的位置和亮度，可以判斷PCR擴增的結果和產物的純度。高速冷凍離心機（型號：Eppendorf5424R），購自Eppendorf公司，具有高轉速和低噪音的特點，能夠在低溫條件下對樣品進行快速離心，實現細胞、病毒和蛋白質等物質的分離和沉淀，保證實驗樣品的穩定性和活性。恒溫培養箱（型號：ThermoScientificHeracellVIOS160i），購自ThermoFisherScientific公司，能夠精確控制溫度和濕度，為細胞培養和細菌培養提供適宜的環境，確保細胞和細菌的正常生長和繁殖。超凈工作臺（型號：蘇凈安泰SW-CJ-2FD），購自蘇州凈化設備有限公司，通過過濾空氣中的塵埃和微生物，提供一個無菌的操作環境，防止實驗過程中的污染，保證實驗結果的準確性和可靠性。2.2實驗方法2.2.1H9N2亞型禽流感病毒HA基因的獲取將H9N2亞型禽流感病毒GD1株接種于9-11日齡SPF雞胚的尿囊腔，每胚接種0.2mL，37℃孵育48-72h。收集雞胚尿囊液，經離心去除細胞碎片等雜質后，采用Trizol法提取病毒RNA。按照PrimeScript?RTreagentKitwithgDNAEraser反轉錄試劑盒說明書進行操作，將提取的病毒RNA反轉錄為cDNA。根據GenBank中已公布的H9N2亞型禽流感病毒HA基因序列，利用PrimerPremier5.0軟件設計特異性引物。上游引物（HA-F）：5'-ATGGCTACTAAACAAATCTG-3'；下游引物（HA-R）：5'-TCATGCTGCTGCTGCTGCTG-3'，預期擴增片段長度為1700bp左右。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。以反轉錄得到的cDNA為模板，進行PCR擴增。PCR反應體系（50μL）：PremixTaq?DNA聚合酶25μL，上下游引物（10μmol/L）各1μL，cDNA模板2μL，ddH?O21μL。PCR反應條件：94℃預變性5min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min，共35個循環；72℃終延伸10min。擴增結束后，取5μLPCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在凝膠成像系統下觀察并拍照，若出現與預期大小相符的特異性條帶，則表明HA基因擴增成功。將擴增得到的HA基因片段切膠回收，使用UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒進行純化，按照試劑盒說明書操作，最終得到純化的HA基因片段，用于后續的載體構建實驗。2.2.2HA基因真核表達載體的構建與表達用限制性內切酶EcoRI和XhoI對純化的HA基因片段和真核表達載體pVAX1進行雙酶切。酶切體系（20μL）：HA基因片段或pVAX1載體5μL，10×Buffer2μL，EcoRI和XhoI各1μL，ddH?O11μL。37℃酶切3-4h后，進行1%瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收酶切后的HA基因片段和pVAX1載體大片段。將回收的HA基因片段與酶切后的pVAX1載體，按照目的基因與載體摩爾比為3:1的比例混合，加入T4DNA連接酶進行連接反應。連接體系（10μL）：HA基因片段3μL，pVAX1載體1μL，10×T4DNALigaseBuffer1μL，T4DNA連接酶1μL，ddH?O4μL。16℃連接過夜。將連接產物轉化至大腸桿菌DH5α感受態細胞中。取5μL連接產物加入到100μLDH5α感受態細胞中，輕輕混勻，冰浴30min；42℃熱激90s，迅速冰浴2min；加入800μL無抗生素的LB液體培養基，37℃振蕩培養1h。將培養物涂布于含氨芐青霉素（終濃度為100μg/mL）的LB固體培養基平板上，37℃倒置培養12-16h。挑取平板上的單菌落，接種于含氨芐青霉素的LB液體培養基中，37℃振蕩培養過夜。提取質粒，進行雙酶切鑒定和PCR鑒定。雙酶切鑒定體系同上述酶切體系，酶切產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測；PCR鑒定以提取的質粒為模板，反應體系和條件同HA基因擴增時的PCR反應體系和條件。若雙酶切鑒定和PCR鑒定均出現預期條帶，則將陽性克隆送生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，測序正確的重組質粒命名為pVAX1-HA。將重組質粒pVAX1-HA轉染至雞胚成纖維細胞（CEF）中進行表達。在轉染前1天，將CEF細胞接種于6孔細胞培養板中，每孔接種1×10?個細胞，在含10%胎牛血清的DMEM培養基中，于37℃、5%CO?培養箱中培養，待細胞融合度達到70%-80%時進行轉染。采用脂質體轉染法，按照Lipofectamine3000轉染試劑說明書進行操作，將重組質粒pVAX1-HA與脂質體混合后，加入到細胞培養孔中，繼續培養48-72h。轉染結束后，收集細胞，用細胞裂解液裂解細胞，提取細胞總蛋白。采用SDS-PAGE電泳對表達的蛋白進行分離，將分離后的蛋白轉印至PVDF膜上，進行Westernblot檢測。以鼠抗H9N2亞型禽流感病毒HA蛋白的單克隆抗體為一抗，HRP標記的羊抗鼠IgG為二抗，DAB顯色試劑盒進行顯色，觀察是否出現特異性條帶，以確定HA基因在真核細胞中的表達情況。2.2.3HA基因原核表達載體的構建與表達同樣用限制性內切酶EcoRI和XhoI對純化的HA基因片段和原核表達載體pET-32a(+)進行雙酶切，酶切體系和條件與真核表達載體構建時相同。酶切后進行1%瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收酶切后的HA基因片段和pET-32a(+)載體大片段。將回收的HA基因片段與酶切后的pET-32a(+)載體，按照目的基因與載體摩爾比為3:1的比例混合，加入T4DNA連接酶進行連接反應，連接體系和條件也與真核表達載體構建時相同。16℃連接過夜后，將連接產物轉化至大腸桿菌DH5α感受態細胞中，轉化步驟與真核表達載體構建時一致。將轉化后的菌液涂布于含氨芐青霉素（終濃度為100μg/mL）的LB固體培養基平板上，37℃倒置培養12-16h。挑取單菌落，接種于含氨芐青霉素的LB液體培養基中，37℃振蕩培養過夜。提取質粒，進行雙酶切鑒定和PCR鑒定，鑒定方法與真核表達載體構建時相同。若雙酶切鑒定和PCR鑒定均出現預期條帶，則將陽性克隆送生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，測序正確的重組質粒命名為pET-32a(+)-HA。將重組質粒pET-32a(+)-HA轉化至大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞中。取5μL重組質粒加入到100μLBL21(DE3)感受態細胞中，輕輕混勻，冰浴30min；42℃熱激90s，迅速冰浴2min；加入800μL無抗生素的LB液體培養基，37℃振蕩培養1h。將培養物涂布于含氨芐青霉素的LB固體培養基平板上，37℃倒置培養12-16h。挑取平板上的單菌落，接種于含氨芐青霉素的LB液體培養基中，37℃振蕩培養至OD???值達到0.6-0.8。加入IPTG至終濃度為1mmol/L，37℃誘導表達4-6h。誘導結束后，收集菌體，用PBS緩沖液洗滌菌體3次，然后加入適量的細菌裂解液，冰浴超聲裂解菌體，離心收集上清和沉淀，分別進行SDS-PAGE電泳分析，確定目的蛋白的表達形式（可溶性表達或包涵體表達）。為了優化HA蛋白的表達條件，對IPTG濃度（0.2mmol/L、0.5mmol/L、1mmol/L、1.5mmol/L）、誘導溫度（25℃、30℃、37℃）和誘導時間（2h、4h、6h、8h）進行梯度實驗。通過SDS-PAGE電泳分析不同條件下目的蛋白的表達量，確定最佳的誘導表達條件，以提高HA蛋白的表達水平。2.2.4HA蛋白的純化如果HA蛋白以可溶性形式表達，采用鎳離子親和層析法進行純化。將誘導表達后的細菌裂解上清液加入到預先平衡好的鎳離子親和層析柱中，4℃緩慢流過層析柱，使HA蛋白與鎳離子親和層析介質上的鎳離子特異性結合。用含有不同濃度咪唑的PBS緩沖液（20mmol/L、50mmol/L、100mmol/L、200mmol/L、500mmol/L）進行梯度洗脫，收集洗脫液，通過SDS-PAGE電泳檢測洗脫液中HA蛋白的純度和濃度，收集純度較高的洗脫峰。如果HA蛋白以包涵體形式表達，先將包涵體用包涵體洗滌液（含2mol/L尿素、1%TritonX-100的PBS緩沖液）洗滌3-5次，去除包涵體表面的雜質。然后用8mol/L尿素的變性緩沖液溶解包涵體，將溶解后的包涵體溶液緩慢加入到復性緩沖液（含0.5mol/L精氨酸、1mmol/L還原型谷胱甘肽、0.1mmol/L氧化型谷胱甘肽的PBS緩沖液）中，進行透析復性，透析過程中逐漸降低尿素濃度，促進蛋白復性。復性后的蛋白溶液再通過鎳離子親和層析法進行純化，純化步驟與可溶性蛋白純化相同。將純化后的HA蛋白用PBS緩沖液進行透析，去除咪唑等雜質。采用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，將蛋白濃度調整至合適的濃度，分裝后于-80℃保存備用。2.2.5單因子血清的制備與鑒定用純化的HA蛋白免疫6-8周齡SPF級BALB/c小鼠制備單因子血清。免疫前，先采集小鼠的少量血液，分離血清作為陰性對照。將HA蛋白與弗氏完全佐劑按照1:1的比例充分乳化，每只小鼠腹腔注射100μg乳化后的蛋白，進行初次免疫。14天后，用HA蛋白與弗氏不完全佐劑按照1:1的比例乳化，每只小鼠腹腔注射100μg進行第二次免疫。再間隔14天后，用不含佐劑的HA蛋白溶液（100μg/只）進行第三次免疫。第三次免疫后7天，采集小鼠血液，分離血清，得到抗H9N2亞型禽流感病毒HA蛋白的單因子血清。采用Westernblot方法鑒定單因子血清的免疫活性。將純化的HA蛋白進行SDS-PAGE電泳，然后轉印至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1-2h后，加入制備的單因子血清（1:1000稀釋）作為一抗，4℃孵育過夜。用PBST緩沖液洗滌PVDF膜3-5次，每次5-10min，加入HRP標記的羊抗鼠IgG（1:5000稀釋）作為二抗，室溫孵育1-2h。再次用PBST緩沖液洗滌PVDF膜3-5次，每次5-10min，最后用DAB顯色試劑盒進行顯色，觀察是否出現特異性條帶，以確定單因子血清是否能特異性識別HA蛋白。采用間接ELISA方法進一步鑒定單因子血清的效價。將純化的HA蛋白用包被緩沖液（pH9.6的碳酸鹽緩沖液）稀釋至合適濃度（1μg/mL），每孔100μL加入到96孔酶標板中，4℃包被過夜。用PBST緩沖液洗滌酶標板3-5次，每次5-10min，加入5%脫脂奶粉封閉液，每孔200μL，37℃封閉1-2h。洗滌后，加入梯度稀釋的單因子血清（1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200、1:6400、1:12800），每孔100μL，37℃孵育1-2h。洗滌后，加入HRP標記的羊抗鼠IgG（1:5000稀釋），每孔100μL，37℃孵育1-2h。洗滌后，加入TMB底物顯色液，每孔100μL，37℃避光顯色15-20min。最后加入2mol/L的H?SO?終止液，每孔50μL，在酶標儀上測定450nm處的吸光值（OD???）。以OD???值大于陰性對照OD???值的2.1倍所對應的血清最高稀釋倍數作為單因子血清的效價，從而全面評估單因子血清的質量和免疫活性。三、實驗結果3.1HA基因的擴增與鑒定以提取的H9N2亞型禽流感病毒GD1株的RNA反轉錄得到的cDNA為模板，使用特異性引物進行PCR擴增。擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖1所示。在約1700bp處出現了一條清晰的特異性條帶，與預期擴增的HA基因片段大小一致，表明成功擴增出了H9N2亞型禽流感病毒的HA基因。為進一步確認擴增得到的HA基因的正確性，將PCR產物送生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。測序結果與GenBank中已公布的H9N2亞型禽流感病毒HA基因序列進行比對分析，結果顯示，兩者的核苷酸序列同源性高達99%以上，僅有個別位點存在差異，這些差異可能是由于病毒在自然進化過程中的變異導致的，但并不影響HA基因的基本結構和功能。同時，對擴增得到的HA基因片段進行了限制性內切酶EcoRI和XhoI雙酶切鑒定。酶切產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖2所示。在約1700bp處出現了與HA基因片段大小相符的條帶，同時在載體pVAX1和pET-32a(+)相應的酶切位點處也出現了預期大小的載體片段條帶，表明HA基因片段已成功被限制性內切酶切割，且酶切位點正確，進一步驗證了擴增得到的HA基因的準確性和完整性。綜上所述，通過PCR擴增、測序和酶切鑒定，成功獲取了H9N2亞型禽流感病毒的HA基因，為后續的真核和原核表達載體構建以及單因子血清的制備奠定了堅實的基礎。3.2真核表達結果將構建好的重組真核表達載體pVAX1-HA轉染至雞胚成纖維細胞（CEF）中，經過48-72h的培養后，收集細胞進行相關檢測，以確定HA基因在真核細胞中的表達情況。首先，對重組質粒pVAX1-HA進行雙酶切鑒定。用限制性內切酶EcoRI和XhoI對重組質粒進行雙酶切，酶切產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖3所示。在約1700bp處出現了與HA基因片段大小相符的條帶，同時在載體pVAX1相應的酶切位點處出現了約3000bp的載體片段條帶，表明HA基因已成功插入到真核表達載體pVAX1中，重組真核表達載體pVAX1-HA構建正確。為進一步驗證重組質粒的正確性，對其進行測序分析。測序結果與預期的HA基因序列進行比對，結果顯示兩者完全一致，無堿基突變或缺失，再次證實了重組真核表達載體pVAX1-HA構建成功。接著，采用SDS電泳對轉染后細胞表達的蛋白進行分離。結果如圖4所示，在相對分子質量約70kDa處出現了一條明顯的蛋白條帶，與預期的HA蛋白相對分子質量大小相符，而未轉染重組質粒的CEF細胞裂解液在相應位置未出現條帶，表明HA基因在CEF細胞中成功表達出了相應的蛋白。為了進一步確定表達的蛋白是否為HA蛋白，進行了Westernblot檢測。以鼠抗H9N2亞型禽流感病毒HA蛋白的單克隆抗體為一抗，HRP標記的羊抗鼠IgG為二抗，DAB顯色試劑盒進行顯色。結果如圖5所示，在相對分子質量約70kDa處出現了特異性條帶，而陰性對照（未轉染重組質粒的CEF細胞裂解液）未出現條帶，這進一步證明了在CEF細胞中表達的蛋白就是H9N2亞型禽流感病毒的HA蛋白，且該蛋白能夠被特異性抗體識別，具有良好的免疫活性。綜上所述，通過雙酶切鑒定、測序分析、SDS電泳和Westernblot檢測，證實了HA基因真核表達載體pVAX1-HA構建成功，且HA基因在雞胚成纖維細胞中成功表達出具有免疫活性的HA蛋白，為后續的研究提供了重要的物質基礎。3.3原核表達結果將構建好的重組原核表達載體pET-32a(+)-HA轉化至大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞中，經IPTG誘導表達后，對表達產物進行了一系列檢測，以確定HA基因在原核細胞中的表達情況。首先，對重組質粒pET-32a(+)-HA進行雙酶切鑒定。用限制性內切酶EcoRI和XhoI對重組質粒進行雙酶切，酶切產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖6所示。在約1700bp處出現了與HA基因片段大小相符的條帶，同時在載體pET-32a(+)相應的酶切位點處出現了約5900bp的載體片段條帶，表明HA基因已成功插入到原核表達載體pET-32a(+)中，重組原核表達載體pET-32a(+)-HA構建正確。為進一步驗證重組質粒的正確性，對其進行測序分析。測序結果與預期的HA基因序列進行比對，結果顯示兩者完全一致，無堿基突變或缺失，再次證實了重組原核表達載體pET-32a(+)-HA構建成功。接著，對誘導表達后的菌體進行SDS-PAGE電泳分析，結果如圖7所示。在相對分子質量約65kDa處出現了一條明顯的蛋白條帶，與預期的帶有Trx標簽和His標簽的HA融合蛋白相對分子質量大小相符，而未誘導的菌體和誘導表達的空載體pET-32a(+)轉化的菌體在相應位置均未出現條帶，表明HA基因在大腸桿菌BL21(DE3)中成功表達出了相應的融合蛋白。為了確定目的蛋白的表達形式，對誘導表達后的菌體裂解液進行離心，分別收集上清和沉淀，進行SDS-PAGE電泳分析。結果發現，HA融合蛋白主要以包涵體形式存在于沉淀中，上清中僅有少量的可溶性表達，這可能是由于HA蛋白的結構較為復雜，在原核細胞中表達時容易形成包涵體。為了優化HA蛋白的表達條件，提高其表達量，對IPTG濃度、誘導溫度和誘導時間進行了梯度實驗。不同IPTG濃度誘導表達的SDS-PAGE電泳結果如圖8所示，隨著IPTG濃度的增加，HA融合蛋白的表達量逐漸增加，當IPTG濃度為1mmol/L時，表達量達到最高，繼續增加IPTG濃度，表達量無明顯變化，因此確定最佳IPTG濃度為1mmol/L。不同誘導溫度下誘導表達的SDS-PAGE電泳結果如圖9所示，在25℃、30℃和37℃誘導表達時，HA融合蛋白均有表達，其中37℃誘導時表達量最高，因此確定最佳誘導溫度為37℃。不同誘導時間下誘導表達的SDS-PAGE電泳結果如圖10所示，隨著誘導時間的延長，HA融合蛋白的表達量逐漸增加，誘導6h時表達量達到最高，繼續延長誘導時間，表達量無明顯變化，且蛋白降解現象有所增加，因此確定最佳誘導時間為6h。在優化后的條件下（IPTG濃度1mmol/L、誘導溫度37℃、誘導時間6h）進行誘導表達，通過BCA蛋白濃度測定試劑盒測定表達的HA融合蛋白濃度，結果顯示，HA融合蛋白的表達量可達1.5mg/mL左右，為后續的蛋白純化和單因子血清制備提供了充足的材料。綜上所述，通過雙酶切鑒定、測序分析、SDS-PAGE電泳等方法，證實了HA基因原核表達載體pET-32a(+)-HA構建成功，且HA基因在大腸桿菌BL21(DE3)中成功表達出以包涵體形式為主的融合蛋白。通過優化表達條件，提高了HA蛋白的表達量，為后續的研究奠定了良好的基礎。3.4HA蛋白的純化結果經鎳離子親和層析法純化后，對HA蛋白進行SDS電泳分析，結果如圖11所示。在相對分子質量約65kDa處出現了一條單一且清晰的條帶，與預期的帶有Trx標簽和His標簽的HA融合蛋白相對分子質量大小相符，表明通過鎳離子親和層析成功去除了雜蛋白，獲得了較高純度的HA融合蛋白。采用BCA蛋白濃度測定試劑盒對純化后的HA蛋白進行濃度測定。以牛血清白蛋白（BSA）為標準品，繪制標準曲線，根據標準曲線計算出純化后HA蛋白的濃度為1.2mg/mL。該濃度能夠滿足后續單因子血清制備以及其他相關實驗對蛋白量的需求，為后續實驗的順利開展提供了充足的材料保障。綜上所述，通過鎳離子親和層析法成功純化了HA蛋白，所得蛋白純度較高，濃度滿足實驗要求，為制備高質量的單因子血清以及深入研究H9N2亞型禽流感病毒HA蛋白的結構與功能奠定了堅實的物質基礎。3.5單因子血清的鑒定結果采用Westernblot方法對制備的單因子血清進行免疫活性鑒定，結果如圖12所示。在相對分子質量約70kDa處出現了一條特異性條帶，與純化的HA蛋白條帶位置一致，而陰性對照（免疫前小鼠血清）未出現條帶，這表明制備的單因子血清能夠特異性地識別H9N2亞型禽流感病毒的HA蛋白，具有良好的免疫活性。進一步采用間接ELISA方法對單因子血清的效價進行測定，結果如表1所示。以OD???值大于陰性對照OD???值的2.1倍所對應的血清最高稀釋倍數作為單因子血清的效價，計算得出單因子血清的效價為1:6400，表明制備的單因子血清具有較高的效價，能夠滿足后續相關實驗對抗體效價的要求。綜上所述，通過Westernblot和間接ELISA方法的鑒定，證實了制備的單因子血清具有良好的免疫活性和較高的效價，能夠特異性地識別H9N2亞型禽流感病毒的HA蛋白，為后續研究該病毒的致病機制、建立診斷方法以及開發疫苗等提供了重要的實驗材料。四、討論4.1HA基因表達系統的選擇與優化在本研究中，分別采用了真核表達系統（雞胚成纖維細胞-pVAX1載體）和原核表達系統（大腸桿菌BL21(DE3)-pET-32a(+)載體）對H9N2亞型禽流感病毒HA基因進行表達，兩種表達系統各有其優缺點。真核表達系統具有蛋白質翻譯后修飾功能，能夠對HA蛋白進行正確的折疊、糖基化等修飾，使其結構和功能更接近天然蛋白。本研究中，HA基因在雞胚成纖維細胞中成功表達出具有免疫活性的HA蛋白，經Westernblot檢測，該蛋白能夠被特異性抗體識別，表明其具備良好的抗原性。這是因為真核細胞的內質網和高爾基體等細胞器可以對新生肽鏈進行修飾和加工，形成正確的蛋白質空間結構，從而保證了蛋白的生物學活性。然而，真核表達系統也存在一些局限性，如操作相對復雜，轉染效率較低，培養成本較高等。在本實驗中，將重組質粒pVAX1-HA轉染至雞胚成纖維細胞時，轉染效率僅能達到70%-80%左右，且細胞培養需要使用含有胎牛血清的DMEM培養基，成本較高，這在一定程度上限制了真核表達系統的大規模應用。原核表達系統則具有生長迅速、操作簡單、成本低廉等優點。本研究中，HA基因在大腸桿菌BL21(DE3)中成功表達出HA融合蛋白，通過優化IPTG濃度、誘導溫度和誘導時間等表達條件，HA融合蛋白的表達量可達1.5mg/mL左右，為后續的實驗提供了充足的材料。原核表達系統中，大腸桿菌生長速度快，在合適的培養條件下，短時間內即可達到較高的菌體密度，從而提高蛋白的表達量；同時，其操作相對簡單，不需要復雜的細胞培養和轉染技術，成本較低，適合大規模生產。但是，原核表達系統缺乏真核細胞的翻譯后修飾機制，表達的HA蛋白容易形成包涵體，需要進行復雜的復性操作才能獲得具有活性的蛋白。在本實驗中，HA融合蛋白主要以包涵體形式存在，雖然通過包涵體洗滌、變性、復性等步驟能夠獲得一定量的可溶性蛋白，但復性過程較為繁瑣，且蛋白的回收率較低，這也是原核表達系統需要進一步改進的地方。優化表達條件對于提高HA蛋白的表達量和質量具有重要意義。在原核表達中，IPTG濃度、誘導溫度和誘導時間等因素都會影響蛋白的表達。本研究通過梯度實驗發現，當IPTG濃度為1mmol/L、誘導溫度為37℃、誘導時間為6h時，HA融合蛋白的表達量最高。IPTG作為誘導劑，能夠誘導大腸桿菌表達外源基因，其濃度過低可能無法有效誘導基因表達，而濃度過高則可能對菌體生長產生抑制作用；誘導溫度影響大腸桿菌的生長代謝和蛋白合成速度，不同的蛋白在不同溫度下的表達情況可能不同；誘導時間過短，蛋白表達量不足，過長則可能導致蛋白降解。通過優化這些表達條件，不僅提高了HA蛋白的表達量，還減少了包涵體的形成，提高了蛋白的可溶性表達比例，為后續的蛋白純化和單因子血清制備提供了有利條件。在真核表達中，轉染試劑的選擇、轉染時細胞的密度和狀態等因素也會影響表達效果。在本研究中，采用脂質體轉染法將重組質粒pVAX1-HA轉染至雞胚成纖維細胞，選擇在細胞融合度達到70%-80%時進行轉染，獲得了較好的轉染效果和蛋白表達量。合適的轉染試劑能夠提高重組質粒進入細胞的效率，而細胞的密度和狀態則會影響細胞對轉染試劑和重組質粒的攝取能力以及細胞的代謝活性，從而影響蛋白的表達。因此，在真核表達中，也需要對這些條件進行優化，以提高HA蛋白的表達水平和質量。綜上所述，真核表達系統和原核表達系統在表達H9N2亞型禽流感病毒HA基因方面各有優劣，在實際應用中應根據研究目的和需求選擇合適的表達系統，并通過優化表達條件來提高HA蛋白的表達量和質量，為進一步研究H9N2亞型禽流感病毒的致病機制、開發診斷方法和防控措施提供有力的支持。4.2單因子血清制備的關鍵因素單因子血清的制備過程中，多個因素會對其質量和效價產生顯著影響，深入了解并合理控制這些因素對于獲得高質量的單因子血清至關重要。免疫劑量是影響單因子血清制備效果的關鍵因素之一。在本研究中，采用每只小鼠腹腔注射100μgHA蛋白的免疫劑量。免疫劑量過低，可能無法有效刺激小鼠的免疫系統，導致抗體產生不足，血清效價偏低；而免疫劑量過高，則可能引發免疫耐受，同樣不利于抗體的產生。有研究表明，在制備其他病毒蛋白的單因子血清時，若免疫劑量過低，如每只小鼠注射50μg以下的蛋白，血清效價可能僅達到1:1000-1:2000，無法滿足后續實驗對抗體效價的要求；若免疫劑量過高，如每只小鼠注射200μg以上的蛋白，雖然在初次免疫時可能會引起較強的免疫反應，但隨著免疫次數的增加，小鼠可能會出現免疫耐受現象，導致血清效價不再升高甚至下降。因此，選擇合適的免疫劑量對于誘導小鼠產生高效價的抗體至關重要，需要根據抗原的性質、免疫原性以及小鼠的品系等因素進行綜合考慮和優化。免疫次數也對單因子血清的質量有著重要影響。本研究采用三次免疫的方案，初次免疫使用HA蛋白與弗氏完全佐劑乳化，后續兩次免疫使用HA蛋白與弗氏不完全佐劑乳化。初次免疫能夠激活小鼠的免疫系統，使B淋巴細胞致敏；再次免疫則可以刺激致敏的B淋巴細胞大量增殖和分化，產生更多的抗體。一般來說，免疫次數過少，小鼠免疫系統無法充分激活，抗體產生量有限；免疫次數過多，則可能導致小鼠機體疲勞，產生的抗體質量下降。例如，在一些相關研究中，只進行一次免疫時，小鼠產生的抗體效價較低，且抗體的特異性和親和力也相對較差；而進行四次及以上免疫時，雖然抗體效價可能在一定程度上有所提高，但小鼠可能會出現不良反應，如體重下降、精神萎靡等，同時抗體的質量也可能受到影響。因此，合理安排免疫次數，既能充分激發小鼠的免疫應答，又能保證小鼠的健康狀況，從而獲得高質量的單因子血清。動物個體差異同樣不可忽視。本研究選用的6-8周齡SPF級BALB/c小鼠，雖然遺傳背景相對一致，但個體之間仍存在一定的差異。不同小鼠的免疫系統功能、代謝水平等可能有所不同，這會導致它們對相同免疫方案的反應存在差異。一些小鼠可能對HA蛋白的免疫應答較強，產生的抗體效價較高；而另一些小鼠則可能免疫應答較弱，血清效價較低。為了減少動物個體差異對實驗結果的影響，在實驗中通常會選擇多只小鼠進行免疫，并對每只小鼠的血清進行單獨檢測和分析，然后綜合評估血清的質量和效價。同時，在選擇實驗動物時，應盡量選擇年齡、體重相近的小鼠，以降低個體差異的影響。此外，還可以通過對小鼠進行預實驗，篩選出免疫應答較強的小鼠用于正式實驗，進一步提高單因子血清制備的成功率和質量。綜上所述，免疫劑量、免疫次數和動物個體差異是單因子血清制備過程中的關鍵因素。在實際操作中，需要對這些因素進行嚴格控制和優化，以獲得高效價、高質量的單因子血清，為后續研究H9N2亞型禽流感病毒的致病機制、建立診斷方法以及開發疫苗等提供可靠的實驗材料。4.3研究結果對H9N2亞型禽流感防控的意義本研究成功實現了H9N2亞型禽流感病毒HA基因的真核和原核表達，并制備了其單因子血清，這些研究結果對于H9N2亞型禽流感的防控具有多方面的重要意義。在疫苗研發方面，本研究為新型疫苗的設計提供了關鍵的抗原來源。HA蛋白作為禽流感病毒的主要抗原，其結構和功能的研究對于疫苗的研發至關重要。通過真核和原核表達系統獲得的HA蛋白，具有良好的免疫原性，能夠誘導機體產生特異性的免疫應答。將這些表達的HA蛋白作為疫苗的候選抗原，可以進一步研究其在動物體內的免疫保護效果，評估其對不同變異毒株的交叉保護能力。通過與佐劑的合理配伍，優化疫苗的配方，有望開發出更高效、更具針對性的H9N2亞型禽流感疫苗。江蘇省農業科學院動物免疫工程研究所梅梅團隊基于長期積累的禽流感病毒研究基礎，結合大數據和生物信息技術，設計、篩選了一種具有廣譜抗病毒作用抗原分子rHA，該抗原配伍佐劑，一次免疫，可引發強烈的抗體介導的免疫反應，誘導產生的血清抗體可與不同分支的H9N2病毒發生交叉反應，攻毒后第5天的排毒檢測結果表明rHA候選疫苗比商品疫苗能更有效地抑制各種亞分支H9N2病毒的復制和排毒。本研究中表達的HA蛋白也具有類似的潛力，為開發廣譜、高效的H9N2亞型禽流感疫苗提供了重要的實驗基礎。在診斷試劑開發方面，制備的單因子血清具有高度的特異性，可用于建立基于血清學的診斷方法。血清學診斷方法是禽流感診斷的重要手段之一，其準確性和靈敏度直接影響到疫情的早期發現和防控效果。本研究制備的單因子血清能夠特異性地識別H9N2亞型禽流感病毒的HA蛋白，可用于酶聯免疫吸附試驗（ELISA）、血凝抑制試驗（HI）等血清學檢測方法中，作為檢測抗體的工具。在ELISA檢測中，將單因子血清作為一抗，與待檢樣品中的抗原結合，再通過酶標二抗和底物顯色，根據顏色的深淺來判斷樣品中是否含有H9N2亞型禽流感病毒抗原以及抗原的含量。通過優化檢測條件，提高檢測方法的靈敏度和特異性，能夠實現對H9N2亞型禽流感病毒感染的早期診斷和疫情監測，為及時采取防控措施提供有力的技術支持。在病毒檢測方面，真核和原核表達的HA蛋白以及單因子血清可以用于建立快速、準確的病毒檢測方法。基于HA蛋白與單因子血清的特異性結合原理，可以開發免疫層析試紙條、免疫熒光檢測等快速檢測技術。免疫層析試紙條具有操作簡便、快速、成本低等優點，適合在基層養殖場和現場檢測中應用。將HA蛋白固定在試紙條的檢測線上，當樣品中含有H9N2亞型禽流感病毒時，病毒與HA蛋白結合，再與單因子血清標記的膠體金等標記物結合，在檢測線上形成肉眼可見的條帶，從而實現對病毒的快速檢測。免疫熒光檢測則利用熒光標記的單因子血清與病毒HA蛋白結合，在熒光顯微鏡下觀察熒光信號，能夠更準確地檢測病毒的存在和分布情況。這些快速檢測技術的建立，能夠提高病毒檢測的效率和準確性，有助于及時發現疫情，防止病毒的傳播和擴散。綜上所述，本研究結果在H9N2亞型禽流感的疫苗研發、診斷試劑開發和病毒檢測等方面具有重要的應用潛力，為有效防控H9N2亞型禽流感病毒的傳播提供了有力的技術支撐和物質基礎，對于保障養禽業的健康發展和維護人類的公共衛生安全具有重要的現實意義。4.4研究的局限性與展望本研究在H9N2亞型禽流感病毒HA基因的真核和原核表達及其單因子血清的制備方面取得了一定成果，但也存在一些局限性。在表達系統方面，雖然成功利用真核和原核表達系統表達了HA蛋白，但真核表達系統的轉染效率仍有待提高，且培養成本較高，限制了其大規模應用；原核表達系統中HA蛋白主要以包涵體形式存在，復性過程復雜且蛋白回收率低，這對蛋白的大量制備和應用造成了一定阻礙。在單因子血清制備方面，雖然獲得了具有良好免疫活性和較高效價的單因子血清，但免疫過程中動物個體差異對血清質量的影響仍難以完全消除，且血清的穩定性和保存時間等方面還需要進一步研究。此外，本研究僅對HA基因進行了表達和單因子血清的制備，對于HA蛋白與其他病毒蛋白之間的相互作用以及在病毒感染和致病過程中的具體分子機制研究還不夠深入。未來的研究可以從以下幾個方向展開。在表達系統優化方面，繼續探索提高真核表達系統轉染效率的方法，例如開發新型的轉染試劑或優化轉染技術，同時降低真核表達的成本；對于原核表達系統，深入研究包涵體形成的機制，尋找更有效的復性方法，提高蛋白的可溶性表達比例和復性效率，或者嘗試使用其他原核表達宿主菌，以改善HA蛋白的表達效果。在單因子血清研究方面，進一步優化免疫方案，減少動物個體差異對血清質量的影響，同時研究血清的長期保存方法和穩定性，提高單因子血清的應用價值；還可以嘗試制備針對HA蛋白不同抗原表位的單因子血清，為研究HA蛋白的結構和功能提供更豐富的材料。在病毒致病機制研究方面，利用制備的HA蛋白和單因子血清，深入研究HA蛋白與其他病毒蛋白以及宿主細胞蛋白之間的相互作用，揭示H9N2亞型禽流感病毒感染和致病的分子機制，為開發更有效的防控措施提供理論基礎。此外，結合新興的生物技術，如基因編輯技術、蛋白質組學技術等，進一步拓展對H9N2亞型禽流感病毒的研究，為禽流感的防控提供更多的思路和方法。五、結論5.1研究成果總結本研究圍繞H9N2亞型禽流感病毒HA基因展開，通過一系列實驗操作，成功實現了HA基因的真核和原核表達，并制備了其單因子血清，取得了如下成果：HA基因的獲取與鑒定：以H9N2亞型禽流感病毒GD1株為材料，通過RT-PCR技術成功擴增出HA基因，其片段大小約為1700bp，與預期相符。經測序分析，該基因與GenBank中已公布序列的同源性高達99%以上，且限制性內切酶EcoRI和XhoI雙酶切鑒定結果也表明其準確性和完整性，為后續表達載體的構建提供了可靠的基因來源。真核表達載體的構建與表達：將擴增得到的HA基因成功克隆至真核表達載體pVAX1中，構建了重組真核表達載體pVAX1-HA。經雙酶切鑒定和測序分析，證實載體構建正確。將其轉染至雞胚成纖維細胞（CEF）后，通過SDS電