沉淀反應（precipitationreaction)

免疫學及免疫學檢驗可溶性抗原+相應抗體

肉眼可見的沉淀

免疫學及免疫學檢驗1897年Kraus就發現細菌培養液（毒素）與相應抗血清混合出現沉淀1905年Bechhold把抗體放在明膠中，將抗原加于其中，發現沉淀反應可在凝膠中進行1946年Oudin報告了試管免疫擴散技術1965年Mancini提出單向免疫擴散技術，使定性免疫試驗向定量化發展免疫濁度法的出現，使沉淀反應達到快速、微量、自動化的新階段。

免疫學及免疫學檢驗

根據沉淀反應的介質和檢測方法的不同,沉淀反應可分為:

液相內的沉淀反應凝膠內的沉淀反應

免疫學及免疫學檢驗第一節液體內沉淀試驗根據沉淀現象的不同，液體內沉淀又可分為三類：絮狀沉淀環狀沉淀免疫濁度沉淀

免疫學及免疫學檢驗一、絮狀沉淀試驗絮狀沉淀試驗是一項經典實驗技術。曾用于測定梅毒抗體的Kahn試驗是絮狀沉淀的代表試驗，現今已被更簡便而敏感的USR或RPR方法替代。

免疫學及免疫學檢驗(一)原理抗原溶液與相應抗體溶液混合，在電解質存在的條件下，抗原與抗體結合出現可見的絮狀沉淀。絮狀沉淀易受抗原與抗體比例的影響，由此可作為最適比測定的基本方法。

免疫學及免疫學檢驗(二)操作步驟1.抗原稀釋法(1)將可溶性抗原作一系列倍比稀釋。(2)各管加入一定濃度的適量抗血清。(3)振搖使抗原、抗體充分混勻，置37℃孵育。(4)產生沉淀量隨抗原量而不同，以出現沉淀物最多的管為最適比例管。

免疫學及免疫學檢驗2.抗體稀釋法

本法采用抗原量恒定與不同倍比稀釋度的抗體反應，出現沉淀物最多的管為抗體最適比例管。3.方陣滴定法

抗原和抗體同時稀釋，亦稱棋盤(checkerboard)滴定法，是前二法的結合，可一次完成抗原和抗體的滴定并找出抗原、抗體的最適比。

免疫學及免疫學檢驗(三)方法評價

絮狀沉淀試驗方法簡單，設備要求低，敏感度較低，受抗原抗體比例影響非常明顯，目前多用以測定抗原抗體反應的最適比。

免疫學及免疫學檢驗二、環狀沉淀試驗環狀沉淀(ringprecipitation)試驗是由Ascoli于1902年建立的一種經典的血清學定性試驗。用非常簡便的技術了解待測血清內是否存在某種抗原或抗體。

免疫學及免疫學檢驗(一)原理把抗原溶液小心地加于已含抗體溶液的細試管液面上。當對應的抗原與抗體相遇，在界面處形成清晰的乳白色沉淀環。

免疫學及免疫學檢驗(二)操作步驟1.用毛細滴管吸取抗血清加于沉淀管(內徑約1.5~2mm)底部，避免產生氣泡。2.將抗原溶液沿管壁緩緩疊加于抗血清液面上，形成清晰的交界面。

3.置沉淀管于室溫下使其反應，1~5min內在兩界面間呈現乳白色沉淀環為陽性。30min仍無沉淀環出現則為陰性。

免疫學及免疫學檢驗(三)方法評價

該試驗是經典的血清學反應之一，簡便、快速、實用。故用于鑒定血跡和診斷炭疽(Ascoli試驗)。只能定性，不能定量、敏感性較低(3~20mg/L)，對含有多個抗原抗體對的反應系統缺乏分辨力。方法難以推廣。

免疫學及免疫學檢驗

三、免疫濁度試驗經典的免疫沉淀試驗是抗原和相應抗體在反應終點時判定結果，方法有耗時、敏感度低(10~100mg/L)和不能自動化等缺點。70年代以來，根據抗原和抗體所在液相內快速結合并產生濁度的原理，建立了免疫比濁法。臨床常用3種微量免疫技術，即透射比濁法(transmissionturbidimetry)、散射比濁法(nephelometry)和免疫膠乳比濁法(immunolatexturbidimetry)，借助多種自動化分析儀器來完成。

免疫學及免疫學檢驗(一)透射比濁法1.原理抗原抗體在一定緩沖液中形成免疫復合物(IC)，當光線透過反應溶液時，由于溶液內復合物粒子對光線的反射和吸收，引起透射光減少，免疫復合物量越多，透射光越少，即光線吸收越多，可用吸光度表示。吸光度和復合物的量成正比，當抗體量固定時，與待檢抗原量成正比。用抗原標準品建立標準曲線，可測出待檢抗原含量。

免疫學及免疫學檢驗2.操作步驟(1)用稀釋緩沖液將待檢樣品和標準品按規定稀釋，取一定量加至測定管中。(2)加最適工作濃度(用方陣法預先滴定)的抗體，孵育一定時間，測定吸光度(A)值。(3)以不同濃度抗原含量為橫軸，吸光度為縱軸，繪標準曲線。從標準曲線可得待檢抗原量。

免疫學及免疫學檢驗3.方法評價

敏感度高于單相瓊脂擴散試驗5~10倍，批內、批間重復性較好，變異系數<10%，操作簡便快速，1h可報告結果。

免疫學及免疫學檢驗(二)散射比濁法散射光系指一定波長的光沿水平軸照射，碰到小顆粒的免疫復合物，光線被折射，發生偏轉，這種偏轉的角度可因光線波長和顆粒大小不同而有所區別。散射濁度法是在入射光的一定角度檢測粒子發出的散射光，散射光的強度與復合物的含量呈正比，即待測抗原越多，形成復合物越多，散射光強度越強。又可分為速率散射比濁法(ratenephelome-try)和終點散射比濁法(endpointnephelometry)。

免疫學及免疫學檢驗1.速率散射比濁法(1)原理：是一種抗原抗體結合動態測定法。所謂速率是抗原抗體結合反應過程中，在單位時間內兩者結合的速度。速率法是測定最大反應速率，即在抗原抗體反應達最高峰時，通常為數十秒鐘，測定其復合物形成的量。峰值的高低在抗體過量情況下與抗原的量成正比。峰值出現的時間與抗體的濃度及其親和力直接相關。不同抗原含量其速率峰值不同，通過微電腦處理，求出抗原含量。

免疫學及免疫學檢驗(2)操作步驟：1)用稀釋液將待檢抗原稀釋成一定濃度。2)將稀釋待檢抗原和不同濃度抗原標準品加至試管內，再加入一定量抗體，立即比濁，記錄速率單位(RU)。3)以抗原標準品含量為橫坐標，RU值為縱坐標，于普通坐標紙上繪制標準曲線。根據待測抗原RU值，查出相應抗原含量。

免疫學及免疫學檢驗(3)方法評價：

檢測不必等到抗原抗體反應達到平衡，大大節約反應時間，每小時可檢測數十份標本；敏感度高，最小檢出量達μg/L水平。

免疫學及免疫學檢驗2.終點散射比濁法(1)原理：讓抗原抗體作用一定時間，使其反應達到平衡后，測定其復合物的量。復合物的濁度不再受時間的影響，但反應復合物聚合產生絮狀沉淀之前(大約反應數十分鐘)進行濁度測定。

免疫學及免疫學檢驗(2)操作步驟1)用稀釋液稀釋待檢抗原和抗原標準品。2)取一定量稀釋待檢抗原液和不同濃度抗原標準品溶液加至試管中，加抗體充分混勻，孵育一定時間，比濁。3)以抗原標準品量為橫坐標，濁度值為縱坐標，繪制標準曲線。根據待檢抗原的濁度值，查出抗原含量。

免疫學及免疫學檢驗(3)方法評價：

敏感度達mg/L水平，可自動化，但反應時間較長

免疫學及免疫學檢驗(三)免疫膠乳比濁法1.原理選擇一種大小適中，均勻一致的膠乳顆粒，吸附抗體后，當遇到相應抗原時，則發生凝集，單個膠乳顆粒在入射光波長之內，光線可透過，當兩個膠乳凝集時，則使透過光減少。這種減少的程度與膠乳凝集成正比，與抗原量成正比。

免疫學及免疫學檢驗2.操作步驟1)用稀釋液將待測抗原和抗原標準品稀釋。2)將抗體致敏膠乳溶液和待測抗原、不同濃度的抗原標準品反應一段時間，測吸光度值。3)以抗原標準品量為橫坐標，吸光度值為縱坐標繪制標準曲線，查出待測抗原量。

免疫學及免疫學檢驗3.方法評價

敏感度高，試劑穩定，因反應液中無PEC沉淀劑的影響，個體IC對結果影響也小，所以結果穩定、可靠，特異性好；不需特殊儀器設備，一般分光光度計、自動化生化分析儀或散射比濁儀均可使用。

免疫學及免疫學檢驗第二節凝膠內沉淀試驗凝膠內沉淀試驗(gelphaseprecipitation)主要是指瓊脂糖擴散或稱凝膠擴散(geldiffusion)。常用的凝膠有瓊脂、瓊脂糖、葡聚糖或聚丙稀酰胺凝膠等。根據實驗目的與方法不同，可將固相內沉淀驗分為3類：①雙相瓊脂擴散試驗(doublegeldiffusiontest)，②單相瓊脂擴散試驗(singlegeldiffusiontest)，③凝膠免疫電泳(gelimmunoelec-trophoresis)。這是一項凝膠內電泳加擴散技術，專門一章介紹。

免疫學及免疫學檢驗一、單相瓊脂擴散試驗(一)原理將一定量的抗體混入瓊脂凝膠中，使待測的抗原物質在凝膠中自由擴散，與抗體結合形成沉淀環，沉淀環的大小與抗原濃度呈正相關。

免疫學及免疫學檢驗(二)操作步驟1.將抗體和0.9%瓊脂糖50~56℃混合，即刻傾注成平板。2.待凝固后在瓊脂板上打孔，孔中加入已稀釋的抗原溶液和不同濃度的抗原標準品溶液。3.置37℃，讓其向四周自由擴散，24~48h后可見其孔周圍出現沉淀環。

免疫學及免疫學檢驗單向免疫擴散試驗示意圖

免疫學及免疫學檢驗

沉淀環的直徑與待檢標本內含量不是直線關系，有兩種計算方法：(1)Mancini曲線：適用于大分子抗原，擴散時間>48h，使用普通坐標紙作圖，擴散環直徑平方和濃度呈線性關系。(2)Fehcy曲線：適用于分子抗原，擴散時間較短，使用半對數坐標紙作圖，抗原量的對數和擴散圈直徑之間呈線性關系。

免疫學及免疫學檢驗

雙免疫擴散試驗（doubleimmunodiffusion）

雙向免疫擴散試驗是在瓊脂板上按一定距離打數個小孔，在相鄰的兩孔內分別放入抗原和抗體材料。當抗原和抗體向四周凝膠中擴散，在兩孔間可出現2～3條沉淀線，本法常用于抗原或抗體的定性或定量檢測，或用于兩種抗原材料的抗原相關性分析。

免疫學及免疫學檢驗雙向免疫擴散試驗示意圖

免疫學及免疫學檢驗第三節免疫電泳技術免疫電泳技術是電泳分析與沉淀反應的結合產物。這種技術有兩大優點，一是加快了沉淀反應的速度，二是將某些蛋白組分利用其帶電荷的不同而將其分開，再分別與抗體反應，以此作更細微的分析。

免疫學及免疫學檢驗免疫電泳包括:

免疫電泳對流免疫電泳火箭電泳免疫印跡等

免疫學及免疫學檢驗一）、免疫電泳

免疫電泳為區帶電泳與免疫雙向擴散的結合。方法是先將樣品加入瓊脂中利用區帶電泳技術將抗原各成分依電泳速度不同而分散開。然后在適當的位置上沿電泳方向挖一直線形槽，于槽內加入含有針對各種抗原混合抗體液，讓各抗原成分與相應抗體進行雙向免疫擴散，可形成多條弧形沉淀線。

免疫學及免疫學檢驗

免疫學及免疫學檢驗

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常用此法進行血清的蛋白種類分析。對于免疫球蛋白缺損或增多的疾病的診斷或鑒別診斷有重要意義。

免疫學及免疫學檢驗二）、對流免疫電泳

對流免疫電泳實質上是定向加速度的免疫雙擴散技術，其基本原理是：將瓊脂板放入電泳槽內，使瓊脂板的兩孔沿著電場的方向，于負極側的孔內加入抗原，于正極側的孔內加入抗體，通電后，抗原帶負電荷向正極泳動，抗體分子雖也帶負電荷，但因分子量大，向正極的位移小，而受瓊脂中電滲作用向負極移動，抗原和抗體能較快地集中在兩孔之間的瓊脂中形成免疫復合物的沉淀線。只需1小時左右即可觀察結果。

免疫學及免疫學檢驗對流電泳示意圖

免疫學及免疫學檢驗三）、火箭免疫電泳火箭免疫電泳技術又稱作單向電泳擴散免疫沉淀試驗，它是由單向擴散發展起來的一項定量技術，實質上是加速度的單向擴散。

免疫學及免疫學檢驗

方法：在含抗體的瓊脂板一端打一排抗原孔；加入待測標本后，將抗原置陰極端，用橫距2～3mA/cm的電流強度進行電泳。抗原泳向陽極，在抗原抗體比例恰當處發生結合沉淀。隨著泳動抗原的減少，沉淀逐漸減少，形成峰狀的沉淀區，狀似火箭。抗體濃度保持不變，峰的高度與抗原量呈正比，用標本中的抗原含量。

免疫學及免疫學檢驗

火箭電泳圖①②③為標本；④⑤⑥為標準抗原

免疫學及免疫學檢驗四）免疫印跡法（immunoblotting）又稱為Western-blot

應用舉例：用免疫印跡法檢查患者血清中的HIV病毒抗體

免疫學及免疫學檢驗第一步：經電泳將HIV混合抗合抗原按分子量大小分離

免疫學及免疫學檢驗第二步：將已分離的抗原經電印跡轉移到硝酸纖維膜上

免疫學及免疫學檢驗第三步：將待檢病人血清加入覆蓋于硝酸纖維膜上

免疫學及免疫學檢驗第四步：加入標記的第二抗體使之覆蓋膜上

免疫學及免疫學檢驗第五步：加入顯色底物（或放射自顯影）顯現第二抗體

免疫學及免疫學檢驗下次課內容:

凝集反應時間:2002/3

教員:毛旭虎

免疫學及免疫學檢驗

免疫學及免疫學檢驗凝集反應（agglutination)毛旭虎醫學檢驗系臨床微生物學及免疫學教研室二OO二年三月

免疫學及免疫學檢驗

細菌、紅細胞或表面帶有抗原的乳膠顆粒等都是不溶性的顆粒抗原，當與相應抗體結合，抗原與抗體結合形成凝集團塊，即稱為凝集反應（agglutination）。

免疫學及免疫學檢驗1896年，Widal就利用傷寒病人的血清與傷寒桿菌發生特異性凝集的現象，有效地診斷傷寒病。

1900年，Landsteriner在特異性血凝現象的基礎上發現了人ABO血型，并于1930年獲得了諾貝爾獎。

免疫學及免疫學檢驗凝集反應可分為：

直接凝集反應間接凝集反應

免疫學及免疫學檢驗一）直接凝集反應

細菌、螺旋體和紅細胞等顆粒抗原，在適當電解質參與下可直接與相應抗體結合出現凝集，稱為直接凝集反應（directagglutination）。凝集反應中的抗原稱為凝集原（agglutinogen），抗全稱為凝集素（agglutinin）。常用的凝集試驗有玻片法和試管法兩種。

免疫學及免疫學檢驗玻片法：

ABO血型的鑒定試管法：肥達試驗（Widaltest）---傷寒

外斐試驗（Weil-Felixtest）---立克次體

免疫學及免疫學檢驗二）間接凝集反應

將可溶性抗原（或抗體）先吸附于適當大小的顆粒性載體的表面，然后與相應抗體（或抗原）作用，在適宜