miR-145對心肌細胞凋亡與肥大的調控機制研究：從分子通路到臨床應用展望一、引言1.1研究背景與意義心血管疾病作為全球范圍內威脅人類健康的主要疾病之一，具有高發病率、高死亡率和高致殘率的特點。據世界衛生組織（WHO）統計，每年因心血管疾病死亡的人數占全球總死亡人數的31%，其中心肌梗死、心力衰竭等疾病嚴重影響患者的生活質量和壽命。心肌細胞凋亡和肥大是心血管疾病發生發展過程中的關鍵病理生理過程，深入研究其調控機制對于開發新的治療策略具有重要意義。心肌細胞凋亡是一種程序性細胞死亡過程，在正常生理狀態下，心肌細胞凋亡維持著心肌細胞數量的動態平衡，對心臟的發育和成熟起到重要作用。然而，在多種心血管疾病如心肌梗死、心力衰竭、心肌病等中，心肌細胞凋亡異常增加，導致心肌細胞數量減少，進而影響心臟的正常功能，促進疾病的進展。例如，在心肌梗死發生時，缺血缺氧條件會誘導大量心肌細胞凋亡，導致梗死面積擴大，心臟收縮和舒張功能受損；在心力衰竭患者中，持續的心肌細胞凋亡進一步加重心肌損傷，導致心功能進行性惡化。心肌肥大是心肌細胞對各種病理刺激（如壓力負荷、容量負荷增加等）的一種適應性反應，早期心肌肥大可通過增加心肌收縮力來維持心臟功能，但長期的心肌肥大可導致心肌結構和功能的改變，引發心肌纖維化、心律失常等并發癥，最終進展為心力衰竭。在高血壓性心臟病中，長期的血壓升高使心臟后負荷增加，心肌細胞通過肥大來代償，但隨著病情發展，心肌肥大逐漸失代償，導致心臟功能障礙。微小RNA（miRNA）是一類內源性非編碼小分子RNA，長度約為22個核苷酸，通過與靶基因mRNA的3'-非翻譯區（3'-UTR）互補配對，抑制mRNA的翻譯過程或促進其降解，從而在轉錄后水平調控基因表達。miRNA參與了多種生理和病理過程，包括細胞增殖、分化、凋亡、代謝等。近年來，越來越多的研究表明，miRNA在心血管系統中發揮著重要的調控作用，與心肌細胞凋亡、肥大以及心血管疾病的發生發展密切相關。miR-145作為一種重要的miRNA，在心血管系統中具有獨特的表達模式和生物學功能。研究發現，miR-145在心肌組織中廣泛表達，并且其表達水平在多種心血管疾病狀態下發生顯著變化。在心肌缺血再灌注損傷模型中，miR-145的表達明顯下調，而過表達miR-145可以減輕心肌細胞凋亡和心肌損傷；在心肌肥大模型中，miR-145的表達也發生改變，調控miR-145的表達可影響心肌細胞的肥大進程。這些研究提示miR-145可能是心肌細胞凋亡和肥大的重要調控因子，對心血管疾病的發生發展具有關鍵影響。深入研究miR-145調控心肌細胞凋亡、肥大的機制，不僅有助于揭示心血管疾病的發病機制，還能為心血管疾病的診斷和治療提供新的靶點和策略。在診斷方面，miR-145有望作為心血管疾病的生物標志物，用于疾病的早期診斷、病情監測和預后評估；在治療方面，通過調節miR-145的表達或干預其下游信號通路，有可能開發出新型的治療藥物或方法，為心血管疾病患者帶來新的希望。因此，本研究具有重要的理論意義和臨床應用價值，將為心血管疾病的防治提供新的思路和方法。1.2研究目的與內容1.2.1研究目的本研究旨在深入探討miR-145對心肌細胞凋亡和肥大的調控作用及其潛在分子機制，為心血管疾病的發病機制研究提供新的理論依據，并為開發基于miR-145的心血管疾病治療新策略奠定基礎。具體而言，本研究期望明確miR-145在心肌細胞凋亡和肥大過程中的表達變化規律，揭示miR-145調控心肌細胞凋亡和肥大的關鍵信號通路及靶基因，評估miR-145作為心血管疾病治療靶點的可行性和潛在價值。1.2.2研究內容miR-145在心肌細胞凋亡和肥大模型中的表達變化：建立過氧化氫（H?O?）誘導的心肌細胞凋亡模型以及異丙腎上腺素（ISO）誘導的心肌細胞肥大模型，采用實時定量PCR（qRT-PCR）技術檢測不同時間點模型中心肌細胞內miR-145的表達水平，分析其表達變化與心肌細胞凋亡、肥大進程的相關性，明確miR-145在心肌細胞凋亡和肥大發生發展過程中的動態表達特征。miR-145對心肌細胞凋亡和肥大的調控作用：構建miR-145過表達和抑制表達的腺病毒載體，分別轉染心肌細胞，在H?O?或ISO刺激下，通過DNAladder、TUNEL染色、流式細胞術等方法檢測心肌細胞凋亡率；通過實時定量RCR檢測與肥大相關的胚胎基因ANF、BNP及β-MHC的表達，同位素硫35標記半胱氨酸檢測細胞攝取氨基酸水平以反映心肌細胞蛋白合成能力，心肌特異性的sarcomericactin的抗體對細胞行熒光染色觀察心肌細胞的體積，全面評估miR-145對心肌細胞凋亡和肥大的調控作用，明確其調控方向和程度。miR-145調控心肌細胞凋亡和肥大的分子機制研究：運用生物信息學方法預測miR-145的潛在靶基因，結合文獻報道，篩選出與心肌細胞凋亡和肥大密切相關的靶基因，如Bnip3、GATA6等。通過雙熒光素酶報告基因實驗驗證miR-145與靶基因3'-UTR的直接靶向結合作用；采用Westernblot檢測靶基因及相關信號通路中關鍵蛋白的表達水平和磷酸化狀態，確定miR-145調控心肌細胞凋亡和肥大的下游信號通路，如線粒體凋亡信號通路、Akt-mTOR等心肌細胞肥大相關信號通路，深入解析miR-145調控心肌細胞凋亡和肥大的分子機制。miR-145在體動物模型中的功能驗證：構建心肌缺血-再灌注損傷小鼠模型以及后負荷增高導致的心肌肥大小鼠模型，通過尾靜脈注射或心肌內注射等方式將miR-145模擬物、抑制劑或對照物導入小鼠體內，觀察小鼠心臟功能、心肌細胞凋亡和肥大程度的變化。采用超聲心動圖檢測小鼠心臟的收縮和舒張功能指標，如左心室射血分數（LVEF）、左心室短軸縮短率（LVFS）等；通過TUNEL染色、Masson染色等方法檢測心肌細胞凋亡和心肌纖維化程度；運用qRT-PCR和Westernblot檢測心肌組織中miR-145、靶基因及相關信號通路蛋白的表達水平，在整體動物水平驗證miR-145對心肌細胞凋亡和肥大的調控作用及機制，為其臨床應用提供更直接的實驗依據。1.3研究方法與技術路線1.3.1研究方法細胞實驗細胞培養：采用胰酶聯合膠原酶消化法從1-3天新生大鼠的心臟組織中分離獲取原代心肌細胞（NRCM），將其培養于含有10%胎牛血清、1%雙抗（青霉素和鏈霉素）的DMEM培養基中，置于37℃、5%CO?的培養箱中培養。同時，培養人胚胎腎細胞HEK293用于腺病毒的包裝與擴增。模型建立：構建過氧化氫（H?O?）誘導的心肌細胞凋亡模型以及異丙腎上腺素（ISO）誘導的心肌細胞肥大模型。在心肌細胞凋亡模型中，向培養的心肌細胞中加入終濃度為50μM的H?O?，分別于刺激0.5、1、2、4、8小時后收集細胞；在心肌細胞肥大模型中，加入終濃度為100μM的ISO，分別于刺激4、8、12、24小時后收集細胞，用于后續指標檢測。轉染實驗：構建miR-145過表達腺病毒載體（Ad-miR-145）和miR-145抑制表達腺病毒載體（Ad-anti-miR-145），以及相應的對照腺病毒載體（Ad-control）。利用Lipofectamine2000轉染試劑將腺病毒載體轉染至心肌細胞，轉染48小時后，通過熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白（GFP）的表達情況，評估轉染效率，隨后進行H?O?或ISO刺激，用于研究miR-145對心肌細胞凋亡和肥大的調控作用。檢測指標與方法：采用實時定量PCR（qRT-PCR）技術檢測心肌細胞中miR-145、與凋亡相關基因（如Bnip3、Bcl-2、Bax等）、與肥大相關基因（如ANF、BNP、β-MHC等）的表達水平；通過DNAladder實驗檢測DNA片段化情況，TUNEL染色結合熒光顯微鏡觀察心肌細胞凋亡情況，流式細胞術精確檢測心肌細胞凋亡率；采用同位素硫35標記半胱氨酸檢測細胞攝取氨基酸水平，以此反映心肌細胞蛋白合成能力；使用心肌特異性的sarcomericactin抗體對細胞進行熒光染色，通過熒光顯微鏡觀察并測量心肌細胞的體積，評估心肌細胞肥大程度；運用Westernblot檢測凋亡相關蛋白（如cleavedcaspase3、CytochromeC等）、肥大相關蛋白（如GATA6、p-Akt等）以及相關信號通路中關鍵蛋白的表達水平和磷酸化狀態。動物實驗動物模型構建：選用雄性C57BL/6小鼠，體重20-25g，構建心肌缺血-再灌注損傷小鼠模型以及后負荷增高導致的心肌肥大小鼠模型。在心肌缺血-再灌注損傷模型中，通過結扎左冠狀動脈前降支30分鐘，然后再灌注24小時來實現；在后負荷增大型模型中，采用手術縮窄小鼠主動脈弓段的方法，術后分別飼養1周和4周，以構建不同時間點的心肌肥大小鼠模型。干預措施：將小鼠隨機分為對照組、模型組、miR-145模擬物組、miR-145抑制劑組等。通過尾靜脈注射或心肌內注射的方式將miR-145模擬物、抑制劑或對照物導入小鼠體內，注射劑量根據前期預實驗和相關文獻確定，以保證有效干預且不引起明顯不良反應。檢測指標與方法：采用超聲心動圖檢測小鼠心臟的收縮和舒張功能指標，如左心室射血分數（LVEF）、左心室短軸縮短率（LVFS）、左心室舒張末期內徑（LVEDd）、左心室收縮末期內徑（LVESd）等；通過TUNEL染色檢測心肌細胞凋亡情況，Masson染色觀察心肌纖維化程度；運用qRT-PCR和Westernblot檢測心肌組織中miR-145、靶基因及相關信號通路蛋白的表達水平；對心肌組織進行病理切片，通過HE染色觀察心肌組織的病理形態學變化。臨床樣本分析：收集臨床確診為心肌梗死、心力衰竭等心血管疾病患者的外周血樣本和心肌組織樣本（在患者進行心臟手術時獲取，遵循倫理審批和患者知情同意原則），同時收集健康志愿者的樣本作為對照。采用qRT-PCR檢測樣本中miR-145的表達水平，分析其與疾病類型、病情嚴重程度（如紐約心臟病協會心功能分級等）的相關性；運用ELISA等方法檢測血清中心肌損傷標志物（如肌酸激酶同工酶CK-MB、心肌肌鈣蛋白TcTnT等）、炎癥因子（如白介素-6IL-6、腫瘤壞死因子αTNF-α等）的水平，探討miR-145表達與這些指標的關聯。1.3.2技術路線miR-145在心肌細胞凋亡和肥大模型中的表達變化研究原代心肌細胞分離培養，進行H?O?或ISO刺激構建模型。在不同時間點收集細胞，提取總RNA。逆轉錄合成cDNA，進行qRT-PCR檢測miR-145表達水平，分析其與凋亡、肥大進程的相關性。miR-145對心肌細胞凋亡和肥大的調控作用研究構建miR-145過表達和抑制表達腺病毒載體，轉染心肌細胞。進行H?O?或ISO刺激，設置對照組。分別采用DNAladder、TUNEL染色、流式細胞術檢測心肌細胞凋亡率；通過qRT-PCR檢測肥大相關基因表達，同位素硫35標記半胱氨酸檢測蛋白合成能力，熒光染色觀察心肌細胞體積，評估miR-145對心肌細胞凋亡和肥大的調控作用。miR-145調控心肌細胞凋亡和肥大的分子機制研究利用生物信息學方法預測miR-145的潛在靶基因。構建靶基因3'-UTR熒光素酶報告基因載體，進行雙熒光素酶報告基因實驗驗證靶向結合作用。轉染腺病毒載體，刺激心肌細胞后，采用Westernblot檢測靶基因及相關信號通路蛋白表達和磷酸化狀態，確定調控的信號通路。miR-145在體動物模型中的功能驗證構建心肌缺血-再灌注損傷小鼠模型和心肌肥大小鼠模型。分組并進行尾靜脈注射或心肌內注射miR-145模擬物、抑制劑或對照物。不同時間點進行超聲心動圖檢測心臟功能，取心肌組織進行TUNEL染色、Masson染色、qRT-PCR和Westernblot檢測，驗證miR-145在體功能及機制。二、心肌細胞凋亡、肥大及miR-145的相關理論基礎2.1心肌細胞凋亡概述2.1.1心肌細胞凋亡的概念與特征心肌細胞凋亡是一種程序性細胞死亡（ProgrammedCellDeath，PCD）過程，它與細胞壞死有著本質的區別。細胞壞死通常是由于急性、嚴重的損傷，如缺血、缺氧、毒素等因素導致的細胞被動死亡，表現為細胞膜破裂、細胞腫脹、細胞器崩解以及炎癥反應的發生。而心肌細胞凋亡是在基因調控下的主動死亡過程，對于維持心臟的正常發育、內環境穩定以及生理功能具有重要意義。在心臟發育過程中，心肌細胞凋亡參與了心臟形態的塑造和結構的完善，例如在胚胎期心臟的形成過程中，適當的心肌細胞凋亡有助于去除多余或異常的細胞，使心臟結構和功能正常發育。從形態學特征來看，心肌細胞凋亡時，首先細胞體積會變小、變圓，細胞表面微絨毛消失，整體形態發生皺縮。細胞核內染色質濃縮并邊緣化，聚集在核膜周邊，呈現出新月形或塊狀分布。隨后，細胞膜內陷，將胞漿和斷裂的染色質分割并包圍形成一個個致密的小體，即凋亡小體。這些凋亡小體含有完整的細胞器和核碎片，最后被周圍的吞噬細胞如巨噬細胞、相鄰的心肌細胞等識別并吞噬進入溶酶體內進行降解，此過程不會引發炎癥反應。在顯微鏡下觀察，可清晰看到凋亡心肌細胞的這些形態變化，與正常心肌細胞形態形成鮮明對比。在生化特征方面，心肌細胞凋亡過程中最顯著的變化之一是核小體間核糖核酸的斷裂。細胞內Ca2?、Mg2?濃度明顯增高，激活細胞內核酸內切酶，這些核酸內切酶會將染色體的脫氧核糖核酸（DNA）在核小體連接部位切斷，形成180-200bp倍數的寡核苷酸片段。因此，凋亡細胞的DNA電泳呈現出特征性的“梯”狀（ladderpattern）條帶，這是判斷心肌細胞凋亡發生的重要客觀指標之一。Ca2?濃度升高還會激活蛋白激酶，使細胞骨架斷裂，細胞質蛋白發生交叉聯合，進一步推動細胞凋亡進程。細胞內的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspase）家族成員也被激活，它們在細胞凋亡的執行階段發揮關鍵作用，通過切割多種細胞內的重要蛋白底物，導致細胞結構和功能的破壞，最終引發細胞凋亡。2.1.2心肌細胞凋亡的機制心肌細胞凋亡受到多種復雜機制的調控，主要包括內源性線粒體途徑和外源性死亡受體途徑，這兩條途徑并非孤立存在，它們之間存在著相互聯系和交叉對話，共同決定心肌細胞的命運。內源性線粒體途徑，也稱為線粒體依賴途徑，主要由細胞內部因素觸發，如DNA損傷、缺氧、氧化應激、生長因子剝奪等。當心肌細胞受到這些應激信號刺激時，線粒體的功能和結構會發生改變。線粒體膜電位下降，外膜通透性增加，導致線粒體膜間隙中的凋亡誘導因子釋放到細胞質中，其中最重要的是細胞色素C（CytochromeC）。細胞色素C釋放到細胞質后，與凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）結合，形成具有活性的凋亡小體。凋亡小體招募并激活caspase-9前體，使其切割成為具有活性的caspase-9。活化的caspase-9進一步激活下游的效應caspase，如caspase-3、caspase-6和caspase-7等，這些效應caspase通過切割一系列細胞內的關鍵蛋白底物，如多聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）、細胞骨架蛋白等，導致細胞結構和功能的破壞，最終引發心肌細胞凋亡。Bcl-2家族蛋白在內源性線粒體途徑中發揮著重要的調控作用。Bcl-2家族包括抗凋亡蛋白（如Bcl-2、Bcl-xL等）和促凋亡蛋白（如Bax、Bak、Bid等）。抗凋亡蛋白主要通過抑制線粒體膜通透性的改變，阻止細胞色素C等凋亡誘導因子的釋放，從而抑制心肌細胞凋亡；而促凋亡蛋白則可以促進線粒體膜通透性的增加，促使細胞色素C釋放，激活凋亡信號通路。Bax在受到凋亡信號刺激后，會從細胞質轉移到線粒體膜上，形成多聚體，導致線粒體膜通透性改變，釋放細胞色素C，進而啟動凋亡程序；而Bcl-2則可以與Bax相互作用，抑制Bax的促凋亡作用，維持線粒體的穩定性。外源性死亡受體途徑主要由細胞外部的死亡信號蛋白與其相應的死亡受體結合而啟動。目前已知的死亡受體主要屬于腫瘤壞死因子（TNF）受體超家族，包括TNF受體1（TNFR1）、Fas（又稱CD95或APO-1）、死亡受體3（DR3）、死亡受體4（DR4）和死亡受體5（DR5）等。這些死亡受體具有共同的結構特征，即胞內含有一段約80個氨基酸殘基的“死亡結構域”（DeathDomain，DD）。以TNFR1為例，當TNF-α等配體與TNFR1結合后，TNFR1的死亡結構域會發生構象改變，招募細胞內含有死亡結構域的適配蛋白Fas相關死亡結構域蛋白（FADD）。FADD通過其死亡效應結構域（DED）與caspase-8前體的DED相互作用，形成死亡誘導信號復合物（DISC）。在DISC中，caspase-8前體發生自身切割和激活，形成具有活性的caspase-8。活化的caspase-8可以直接激活下游的效應caspase，如caspase-3，啟動細胞凋亡程序；在某些情況下，caspase-8還可以切割Bid，產生截短的Bid（tBid），tBid轉移到線粒體，激活內源性線粒體凋亡途徑，形成外源性和內源性凋亡途徑之間的“串話”，放大凋亡信號，促進心肌細胞凋亡。在一些心肌缺血再灌注損傷的研究中，發現TNF-α表達升高，通過與TNFR1結合，激活外源性死亡受體途徑，導致心肌細胞凋亡增加，同時也伴隨著內源性線粒體途徑相關蛋白的改變，進一步證實了兩條凋亡途徑之間的相互作用。2.1.3心肌細胞凋亡與心血管疾病的關系心肌細胞凋亡在多種心血管疾病的發生發展過程中扮演著至關重要的角色，它參與了疾病的起始、進展以及惡化等多個環節，對心臟的結構和功能產生嚴重影響。在心肌梗死（MyocardialInfarction，MI）中，冠狀動脈阻塞導致心肌缺血缺氧，這是引發心肌細胞凋亡的重要因素。在心肌梗死的急性期，缺血區域的心肌細胞由于缺氧、能量代謝障礙以及氧化應激等原因，激活內源性線粒體凋亡途徑和外源性死亡受體途徑，導致大量心肌細胞凋亡。心肌細胞凋亡不僅直接導致梗死面積擴大，還會影響梗死周邊區域心肌細胞的存活和功能。梗死周邊區域的心肌細胞在受到缺血、炎癥等刺激后，也會發生凋亡，進一步加重心肌損傷，影響心臟的收縮和舒張功能。長期的心肌細胞凋亡還會導致心肌重構，表現為心肌細胞肥大、心肌纖維化等，最終發展為心力衰竭。研究表明，在心肌梗死患者中，心肌細胞凋亡指數與梗死面積、心功能指標密切相關，凋亡指數越高，梗死面積越大，心功能越差。通過抑制心肌細胞凋亡，可以減少梗死面積，改善心臟功能，提高患者的生存率。在動物實驗中，給予抗凋亡藥物或基因治療，能夠顯著降低心肌梗死模型中心肌細胞凋亡率，減輕心肌損傷，改善心臟功能。心力衰竭（HeartFailure，HF）是各種心血管疾病的終末階段，心肌細胞凋亡在心力衰竭的發生發展中起著關鍵作用。在心力衰竭的發生過程中，多種病理因素如長期的壓力和/或容量負荷過重、神經-內分泌失調、炎癥反應、氧化應激等均可誘導心肌細胞凋亡。心肌細胞凋亡導致心肌細胞數量減少，心肌收縮力下降，心臟泵血功能受損。隨著心肌細胞凋亡的持續進行，心臟逐漸發生重構，包括心肌細胞肥大、心肌纖維化、心臟腔室擴大等，進一步加重心力衰竭的病情。在心力衰竭患者的心肌組織中，可檢測到明顯升高的心肌細胞凋亡水平，且凋亡程度與心力衰竭的嚴重程度呈正相關。通過超聲心動圖和血流動力學參數監測發現，心力衰竭患者的心功能指標如左心室射血分數（LVEF）、左心室短軸縮短率（LVFS）等與心肌細胞凋亡指數呈負相關，即凋亡指數越高，心功能指標越差。在快速心室起搏造成的犬心力衰竭模型中，觀察到心力衰竭組較對照組腫瘤抑制蛋白p53表達增強，p53與Bax啟動子的結合活性升高，心肌中Bcl-2蛋白表達下降，Bax蛋白表達增強，Bcl-2與Bax蛋白的比例下降，提示p53及p53依賴基因的激活在起搏誘導的心力衰竭中對凋亡調節起關鍵作用，進一步證實了心肌細胞凋亡在心力衰竭發病機制中的重要地位。2.2心肌細胞肥大概述2.2.1心肌細胞肥大的概念與分類心肌細胞肥大（MyocardialCellHypertrophy）是指心肌細胞體積增大、重量增加的一種病理生理狀態。在心肌細胞肥大過程中，心肌細胞的蛋白質合成增加，細胞內的細胞器如線粒體、內質網等數量增多且體積增大，以適應心臟對增加的工作負荷的需求。心肌細胞肥大時，細胞內的肌節數量增多，肌原纖維增粗，導致心肌細胞的直徑和長度增加，從而使整個心肌組織的體積和重量增大。根據引發心肌細胞肥大的原因和對心臟功能的影響，心肌細胞肥大可分為生理性心肌肥大和病理性心肌肥大。生理性心肌肥大通常是由適度的體育鍛煉、懷孕等生理性因素誘導產生的。在適度體育鍛煉時，心臟需要增加心輸出量以滿足身體對氧氣和營養物質的需求，心臟的后負荷增加，心肌細胞通過肥大來增強收縮力，以維持正常的心功能。這種生理性心肌肥大是一種適應性反應，通常是可逆的，當刺激因素去除后，心肌細胞可恢復至正常大小。生理性心肌肥大一般不會引發心臟疾病，反而對心臟功能具有一定的保護作用，能夠提高心臟的儲備能力和耐力。病理性心肌肥大則是由長期的高血壓、主動脈狹窄、心肌梗死、心力衰竭等心臟疾病或病理因素引發的。長期高血壓使心臟后負荷持續增加，心肌細胞為了克服增加的阻力，會逐漸發生肥大；主動脈狹窄導致左心室射血受阻，左心室壓力負荷增大，進而引發心肌細胞肥大。病理性心肌肥大早期雖然也是一種代償性反應，可在一定程度上維持心臟功能，但長期持續的病理性心肌肥大會導致心肌結構和功能的改變，如心肌纖維化、心肌細胞凋亡增加、心肌電生理特性改變等，最終可引發心腔擴張、心輸出量下降，導致心力衰竭或心律失常等嚴重心血管疾病，增加患者的死亡風險。2.2.2心肌細胞肥大的機制心肌細胞肥大的發生涉及多種復雜的機制，主要包括神經內分泌系統的激活、細胞因子和生長因子的作用以及信號轉導通路的異常激活等。神經內分泌系統在心肌細胞肥大的發生發展中起著重要的調控作用。腎素-血管緊張素-醛固酮系統（RAAS）的激活是導致心肌細胞肥大的重要因素之一。當機體處于應激狀態或存在心血管疾病時，腎臟會分泌腎素，腎素作用于血管緊張素原，使其轉化為血管緊張素Ⅰ，血管緊張素Ⅰ在血管緊張素轉化酶（ACE）的作用下生成血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）。AngⅡ具有強大的縮血管作用，可使血壓升高，增加心臟后負荷，同時它還能直接作用于心肌細胞，通過與細胞膜上的血管緊張素Ⅱ受體（AT1R）結合，激活一系列細胞內信號通路，促進心肌細胞蛋白質合成增加，導致心肌細胞肥大。AngⅡ可激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路，使細胞外信號調節激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK等磷酸化，進而調節與心肌細胞肥大相關的基因表達，促進心肌細胞肥大。交感神經系統的激活也與心肌細胞肥大密切相關。交感神經興奮時釋放去甲腎上腺素（NE），NE與心肌細胞膜上的β-腎上腺素能受體（β-AR）結合，通過Gs蛋白激活腺苷酸環化酶，使細胞內cAMP水平升高，激活蛋白激酶A（PKA），PKA可磷酸化多種底物，調節離子通道功能和基因表達，導致心肌細胞肥大。β-AR信號通路還可通過激活磷脂酶C（PLC），產生三磷酸肌醇（IP3）和二酰甘油（DAG），IP3促使內質網釋放Ca2?，使細胞內Ca2?濃度升高，DAG則激活蛋白激酶C（PKC），Ca2?和PKC進一步激活下游信號通路，促進心肌細胞肥大。細胞因子和生長因子在心肌細胞肥大過程中也發揮著關鍵作用。腫瘤壞死因子-α（TNF-α）是一種具有多種生物學活性的細胞因子，在心肌細胞肥大時表達增加。TNF-α可通過與心肌細胞表面的TNF受體1（TNFR1）結合，激活NF-κB信號通路，促進炎癥因子的表達和釋放，同時還能激活MAPK信號通路，導致心肌細胞肥大。白細胞介素-6（IL-6）也是一種重要的促炎細胞因子，可通過與心肌細胞表面的IL-6受體結合，激活JAK-STAT信號通路，調節基因表達，促進心肌細胞肥大。胰島素樣生長因子-1（IGF-1）是一種具有促生長作用的生長因子，在心肌細胞肥大時，IGF-1及其受體表達增多。IGF-1與受體結合后，可激活磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）/Akt信號通路，促進蛋白質合成，抑制細胞凋亡，從而導致心肌細胞肥大。成纖維細胞生長因子（FGF）家族成員如FGF2等也參與心肌細胞肥大的調控，它們通過與相應受體結合，激活Ras-Raf-MEK-ERK等信號通路，促進心肌細胞增殖和肥大。多種信號轉導通路在心肌細胞肥大過程中被激活，這些信號通路之間相互作用、相互調節，共同介導心肌細胞肥大的發生發展。除了上述提到的MAPK、PI3K/Akt、JAK-STAT等信號通路外，Rho激酶（ROCK）信號通路在心肌細胞肥大中也具有重要作用。機械應力、AngⅡ、NE等刺激均可激活Rho激酶，Rho激酶通過磷酸化肌球蛋白輕鏈（MLC）和肌球蛋白結合亞基（MBS），調節肌動蛋白和肌球蛋白的相互作用，促進心肌細胞收縮和蛋白質合成，導致心肌細胞肥大。Rho激酶還可通過調節轉錄因子的活性，如血清反應因子（SRF）等，影響與心肌細胞肥大相關基因的表達，進一步促進心肌細胞肥大。2.2.3心肌細胞肥大與心血管疾病的關系心肌細胞肥大與多種心血管疾病的發生發展密切相關，它既是心臟對各種病理刺激的一種適應性反應，在一定程度上可維持心臟功能，但長期的心肌細胞肥大也會導致心臟結構和功能的改變，促進心血管疾病的進展，增加患者的死亡風險。在高血壓性心臟病中，長期的血壓升高使心臟后負荷增加，為了克服增加的阻力，心臟通過心肌細胞肥大來增強收縮力，維持正常的心輸出量。早期的心肌細胞肥大表現為向心性肥大，即心肌壁增厚，心腔大小正常或輕度縮小，此時心臟功能尚可維持在正常范圍。但隨著病情的進展，心肌細胞肥大逐漸失代償，心肌纖維化加重，心肌順應性降低，心臟舒張功能受損，逐漸發展為離心性肥大，即心肌壁變薄，心腔擴大，最終導致心力衰竭。在高血壓患者中，心肌細胞肥大程度與左心室質量指數（LVMI）密切相關，LVMI越高，發生心力衰竭的風險越高。研究表明，高血壓患者中LVMI每增加10g/m2，心力衰竭的發生風險增加13%。心肌梗死發生時，梗死區域的心肌細胞由于缺血缺氧而死亡，為了維持心臟功能，梗死周邊區域的心肌細胞會發生肥大，以代償梗死心肌的功能。然而，這種代償性心肌肥大并不能完全恢復心臟的正常功能，而且長期的心肌細胞肥大可導致心肌重構，使心臟結構和功能進一步惡化。心肌梗死患者發生心肌細胞肥大后，更容易出現心律失常、心力衰竭等并發癥，嚴重影響患者的預后。在心肌梗死大鼠模型中，觀察到梗死周邊區域心肌細胞肥大，心肌組織中膠原纖維含量增加，心臟收縮和舒張功能下降，且心肌細胞肥大程度與心功能惡化程度呈正相關。心力衰竭是各種心血管疾病的終末階段，心肌細胞肥大在心力衰竭的發生發展中起著關鍵作用。在心力衰竭的早期，心肌細胞肥大是一種代償性反應，可在一定時間內維持心臟的泵血功能。但隨著病情的進展，心肌細胞肥大逐漸失代償，心肌細胞凋亡增加，心肌纖維化加重，心臟的收縮和舒張功能嚴重受損，最終導致心力衰竭的發生。在心力衰竭患者中，心肌細胞肥大與心功能分級密切相關，心功能越差，心肌細胞肥大程度越嚴重。研究顯示，紐約心臟病協會（NYHA）心功能Ⅲ-Ⅳ級的心力衰竭患者，其心肌細胞肥大程度明顯高于NYHA心功能Ⅰ-Ⅱ級的患者。2.3miR-145的概述2.3.1miR-145的結構與功能特點miR-145是一種內源性非編碼小分子RNA，在多種組織和細胞中廣泛表達，尤其在心血管系統中具有重要的生物學功能。其編碼基因位于人類染色體5q32區域，由3個外顯子和2個內含子組成。成熟的miR-145序列長度約為22個核苷酸，其前體（pre-miR-145）具有典型的莖環結構，這種結構對于miR-145的生成和功能發揮至關重要。在細胞核內，miR-145基因首先被RNA聚合酶Ⅱ轉錄成初級轉錄本（pri-miR-145），pri-miR-145在核酸酶Drosha和其輔助因子DGCR8的作用下，被切割成約70-100個核苷酸的發夾狀pre-miR-145。隨后，pre-miR-145被轉運蛋白Exportin-5識別并轉運至細胞質中，在細胞質中，核酸酶Dicer將pre-miR-145進一步切割，產生成熟的miR-145雙鏈體。其中一條鏈被整合到RNA誘導沉默復合體（RISC）中，形成具有活性的RISC-miR-145復合物，而另一條鏈則被降解。miR-145主要通過與靶基因mRNA的3'-非翻譯區（3'-UTR）互補配對來發揮其生物學功能。當RISC-miR-145復合物識別并結合到靶mRNA的3'-UTR上時，可通過兩種方式調控基因表達：一是抑制mRNA的翻譯過程，阻止核糖體與mRNA的結合，從而抑制蛋白質的合成；二是促進mRNA的降解，使mRNA的穩定性降低，被核酸酶降解。研究表明，miR-145可通過抑制其靶基因的表達，參與多種細胞生理和病理過程的調控，如細胞增殖、分化、凋亡、遷移和侵襲等。在平滑肌細胞中，miR-145可通過靶向抑制KLF4、c-Myc等轉錄因子的表達，調控平滑肌細胞的增殖和分化，維持血管平滑肌細胞的正常功能；在腫瘤細胞中，miR-145可通過抑制其靶基因的表達，發揮抑癌作用，抑制腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲能力。2.3.2miR-145在心血管系統中的研究現狀近年來，miR-145在心血管系統中的作用受到了廣泛關注，大量研究表明，miR-145在心肌細胞增殖、凋亡、肥大以及血管平滑肌細胞功能調節等方面發揮著重要作用，與多種心血管疾病的發生發展密切相關。在心肌細胞增殖方面，研究發現miR-145對心肌細胞的增殖具有抑制作用。在胚胎發育過程中，miR-145的表達水平較低，有利于心肌細胞的增殖和心臟的發育；而在成年心臟中，miR-145的表達水平相對較高，抑制心肌細胞的增殖，維持心肌細胞的穩定狀態。在體外培養的心肌細胞中，過表達miR-145可抑制心肌細胞的增殖，使細胞周期停滯在G0/G1期；而抑制miR-145的表達，則可促進心肌細胞的增殖。miR-145可能通過靶向抑制一些與細胞增殖相關的基因，如PCNA、CyclinD1等，來調控心肌細胞的增殖。在心肌細胞凋亡方面，越來越多的研究表明miR-145具有抗心肌細胞凋亡的作用。在心肌缺血再灌注損傷模型中，缺血再灌注可導致心肌細胞中miR-145的表達水平明顯下調，而miR-145表達的降低會使心肌細胞凋亡增加。通過轉染miR-145模擬物上調miR-145的表達，可顯著減少心肌細胞凋亡，減輕心肌缺血再灌注損傷。miR-145可能通過靶向抑制Bnip3、Fas等促凋亡基因的表達，激活PI3K/Akt等抗凋亡信號通路，來發揮抗心肌細胞凋亡的作用。在一項研究中，發現miR-145可直接靶向Bnip3的3'-UTR，抑制Bnip3的表達，從而減少線粒體途徑介導的心肌細胞凋亡，保護心肌細胞免受缺血再灌注損傷。在心肌細胞肥大方面，miR-145對心肌細胞肥大具有重要的調控作用。在壓力負荷增加、AngⅡ刺激等導致的心肌肥大模型中，miR-145的表達水平發生改變。過表達miR-145可抑制心肌細胞肥大，減少心肌細胞表面積和蛋白質合成，降低肥大相關基因ANF、BNP、β-MHC的表達；而抑制miR-145的表達，則會促進心肌細胞肥大。miR-145可能通過靶向抑制GATA6、ERK1/2等與心肌細胞肥大相關的信號通路和轉錄因子，來調控心肌細胞肥大進程。研究表明，miR-145可直接靶向GATA6的3'-UTR，抑制GATA6的表達，從而阻斷GATA6下游與心肌細胞肥大相關基因的轉錄激活，抑制心肌細胞肥大。在血管平滑肌細胞功能調節方面，miR-145是維持血管平滑肌細胞（VSMC）表型穩定和功能正常的關鍵分子。正常情況下，VSMC處于收縮型表型，具有低增殖、高收縮的特性，miR-145在收縮型VSMC中高表達。當VSMC受到損傷或病理刺激時，會發生表型轉換，從收縮型轉變為合成型，表現出高增殖、低收縮的特性，同時miR-145的表達水平下降。miR-145可通過靶向抑制KLF4、Elk-1等轉錄因子的表達，維持VSMC的收縮型表型，抑制其增殖和遷移。在動脈粥樣硬化斑塊形成過程中，血管內膜受損，VSMC發生表型轉換并增殖遷移，miR-145表達降低，促進了動脈粥樣硬化的發展；而過表達miR-145可抑制VSMC的表型轉換和增殖遷移，減輕動脈粥樣硬化病變。盡管目前關于miR-145在心血管系統中的研究取得了一定進展，但仍存在許多不足之處。一方面，miR-145在心血管系統中的作用機制尚未完全明確，其具體的靶基因和信號通路仍有待進一步深入研究和驗證。另一方面，miR-145在心血管疾病中的臨床應用研究還相對較少，如何將miR-145作為心血管疾病的診斷標志物和治療靶點轉化為臨床實踐，還需要開展更多的臨床試驗和研究。此外，miR-145與其他miRNA或生物分子之間的相互作用以及它們在心血管系統中的協同調控機制也需要進一步探討，這將有助于更全面地揭示miR-145在心血管系統中的功能和作用。三、miR-145調控心肌細胞凋亡的機制研究3.1miR-145與心肌細胞凋亡相關信號通路的關系3.1.1miR-145對線粒體凋亡途徑的影響線粒體凋亡途徑在心肌細胞凋亡過程中起著關鍵作用，而miR-145對該途徑的調控備受關注。大量研究表明，miR-145可通過調控Bcl-2家族蛋白，進而影響線粒體膜通透性和細胞色素C釋放，最終對心肌細胞凋亡產生影響。在心肌細胞受到氧化應激、缺血缺氧等損傷刺激時，Bcl-2家族蛋白的表達和功能平衡被打破，從而激活線粒體凋亡途徑。Bax是Bcl-2家族中的促凋亡蛋白，正常情況下，Bax主要以單體形式存在于細胞質中。當心肌細胞受到凋亡刺激時，Bax會發生構象改變，從細胞質轉移到線粒體膜上，形成多聚體，進而導致線粒體膜通透性增加，細胞色素C從線粒體釋放到細胞質中，啟動凋亡程序。而Bcl-2是抗凋亡蛋白，它可以通過與Bax相互作用，抑制Bax的促凋亡作用，維持線粒體的穩定性，從而抑制心肌細胞凋亡。研究發現，miR-145能夠通過抑制Bax的表達，發揮抗心肌細胞凋亡的作用。通過生物信息學分析，預測Bax是miR-145的潛在靶基因，其3'-UTR存在與miR-145互補配對的序列。雙熒光素酶報告基因實驗結果顯示，將miR-145模擬物與含有Bax3'-UTR的熒光素酶報告基因載體共轉染細胞后，熒光素酶活性顯著降低，證實了miR-145與Bax3'-UTR的直接靶向結合作用。進一步的研究表明，在過氧化氫（H?O?）誘導的心肌細胞凋亡模型中，過表達miR-145可使Bax蛋白表達水平顯著降低，減少線粒體膜通透性的增加，抑制細胞色素C的釋放，從而降低心肌細胞凋亡率；相反，抑制miR-145的表達，則會導致Bax蛋白表達升高，促進線粒體膜通透性增加和細胞色素C釋放，增加心肌細胞凋亡。除了對Bax的調控，miR-145還可通過促進抗凋亡蛋白Bcl-2的表達來抑制心肌細胞凋亡。在心肌缺血再灌注損傷模型中，缺血再灌注導致心肌細胞中miR-145表達下調，Bcl-2蛋白表達也隨之降低，心肌細胞凋亡增加。而過表達miR-145可顯著提高Bcl-2蛋白表達水平，增強其與Bax的相互作用，抑制線粒體膜通透性的改變，減少細胞色素C釋放，從而減輕心肌細胞凋亡。雖然目前關于miR-145直接靶向調控Bcl-2的研究相對較少，但已有研究表明miR-145可能通過間接途徑影響Bcl-2的表達，如通過調控上游的轉錄因子或信號通路，進而影響Bcl-2基因的轉錄和翻譯過程。此外，miR-145還可能通過影響其他與線粒體凋亡途徑相關的蛋白和分子，來調控心肌細胞凋亡。如在七氟醚誘導的海馬神經元HT22細胞凋亡模型中，發現miR-145可通過抑制Bnip3的表達，減少線粒體功能障礙，從而保護細胞免受凋亡。Bnip3是一種BH3-only蛋白，在線粒體凋亡途徑中具有重要作用，它可以通過與Bcl-2家族蛋白相互作用，促進線粒體膜通透性增加和細胞色素C釋放。在心肌細胞中，miR-145對Bnip3的調控作用也可能存在，進一步影響線粒體凋亡途徑介導的心肌細胞凋亡過程。3.1.2miR-145對死亡受體凋亡途徑的影響死亡受體凋亡途徑也是心肌細胞凋亡的重要機制之一，miR-145在該途徑中也發揮著重要的調控作用。目前的研究主要集中在miR-145是否作用于TNF受體家族或其下游信號分子FADD、CASPASE-8，從而影響死亡受體途徑介導的心肌細胞凋亡。TNF受體家族中的TNFR1和Fas是介導死亡受體凋亡途徑的重要成員。當TNF-α等配體與TNFR1結合，或FasL與Fas結合后，會導致受體的死亡結構域發生構象改變，招募細胞內含有死亡結構域的適配蛋白FADD。FADD通過其死亡效應結構域與caspase-8前體相互作用，形成死亡誘導信號復合物（DISC），在DISC中，caspase-8前體發生自身切割和激活，形成具有活性的caspase-8。活化的caspase-8可以直接激活下游的效應caspase，如caspase-3，啟動細胞凋亡程序。研究表明，miR-145可能通過抑制TNF受體家族成員的表達，減少死亡受體凋亡途徑的激活。在某些心血管疾病模型中，發現miR-145表達下調與TNFR1表達升高相關。通過生物信息學預測和實驗驗證，發現miR-145可與TNFR1的3'-UTR互補配對，雙熒光素酶報告基因實驗證實了miR-145對TNFR1的直接靶向作用。在細胞實驗中，過表達miR-145可顯著降低TNFR1的表達水平，抑制TNF-α誘導的心肌細胞凋亡；而抑制miR-145的表達，則會導致TNFR1表達增加，增強TNF-α對心肌細胞凋亡的誘導作用。miR-145還可能通過作用于死亡受體途徑的下游信號分子FADD和CASPASE-8來調控心肌細胞凋亡。FADD作為連接死亡受體和caspase-8的關鍵適配蛋白，在死亡受體凋亡途徑中起著橋梁作用。研究發現，miR-145可以通過抑制FADD的表達，阻斷死亡受體與caspase-8之間的信號傳遞，從而抑制心肌細胞凋亡。在一項針對心肌細胞的研究中，轉染miR-145模擬物后，FADD蛋白表達明顯降低，同時caspase-8的激活也受到抑制，心肌細胞凋亡率顯著下降；而抑制miR-145表達則導致FADD蛋白表達升高，caspase-8激活增加，心肌細胞凋亡率上升。對于CASPASE-8，雖然目前尚未有直接證據表明miR-145可直接靶向調控其表達，但miR-145可能通過影響上游信號分子，間接調控CASPASE-8的激活。如miR-145對TNFR1和FADD的抑制作用，會導致DISC的形成減少，進而減少CASPASE-8的激活，最終抑制死亡受體途徑介導的心肌細胞凋亡。在心肌缺血再灌注損傷過程中，缺血再灌注可導致miR-145表達下降，使得TNFR1、FADD表達增加，CASPASE-8激活增強，心肌細胞凋亡增多；而過表達miR-145則可逆轉這一過程，減輕心肌細胞凋亡，保護心肌組織免受損傷。3.2miR-145調控心肌細胞凋亡的靶基因研究3.2.1預測與篩選miR-145作用的靶基因在探究miR-145調控心肌細胞凋亡的機制時，準確預測和篩選其作用的靶基因是關鍵的第一步。生物信息學方法為我們提供了高效且全面的預測手段，其中TargetScan、miRanda等軟件被廣泛應用于miRNA靶基因的預測。TargetScan軟件基于進化保守性原理，通過分析不同物種間mRNA的3'-UTR序列，預測miRNA與靶基因的結合位點。其算法考慮了種子序列互補性、結合自由能以及位點的保守性等因素，能夠較為準確地預測miR-145的潛在靶基因。例如，在對心肌細胞相關基因進行分析時，TargetScan預測出多個可能與miR-145相互作用的基因，為后續研究提供了重要線索。miRanda軟件則采用基于序列互補和熱力學穩定性的算法，計算miRNA與靶基因mRNA3'-UTR之間的結合親和力，從而預測靶基因。它不僅考慮了種子序列的匹配，還對整個miRNA與mRNA的互補區域進行分析，提高了預測的準確性。結合相關文獻報道，進一步篩選出與心肌細胞凋亡密切相關的靶基因。許多研究已經揭示了一些在心肌細胞凋亡過程中發揮關鍵作用的基因，如Bnip3、Fas、Bcl-2家族成員等。Bnip3是一種BH3-only蛋白，在線粒體凋亡途徑中起著重要作用。研究表明，在心肌缺血再灌注損傷模型中，Bnip3的表達上調與心肌細胞凋亡增加密切相關。通過生物信息學預測，發現Bnip3的3'-UTR存在與miR-145互補配對的序列，提示Bnip3可能是miR-145的靶基因之一。Fas作為死亡受體凋亡途徑的關鍵成員，其表達和激活可導致心肌細胞凋亡。文獻報道顯示，在某些心血管疾病中，Fas的表達異常升高，促進了心肌細胞凋亡。生物信息學分析也表明，miR-145可能與Fas的3'-UTR相互作用，調控其表達。綜合生物信息學預測和文獻篩選的結果，初步確定了一批miR-145作用的潛在靶基因。這些靶基因涉及多種細胞凋亡相關的信號通路和生物學過程，為后續深入研究miR-145調控心肌細胞凋亡的分子機制奠定了基礎。然而，生物信息學預測結果僅為初步線索，還需要通過實驗驗證來確定miR-145與靶基因之間的真實相互作用關系。3.2.2驗證靶基因與miR-145的相互作用在確定了miR-145的潛在靶基因后，需要通過一系列實驗來驗證它們之間的相互作用關系，以明確miR-145對靶基因的調控作用。雙熒光素酶報告基因實驗是驗證miRNA與靶基因靶向結合的經典方法。首先，構建含有靶基因3'-UTR的熒光素酶報告基因載體。以Bnip3為例，通過PCR擴增Bnip3基因的3'-UTR序列，將其克隆到熒光素酶報告基因載體（如pGL3-Control載體）的多克隆位點中，使Bnip3的3'-UTR位于熒光素酶基因的下游。同時，構建含有突變型Bnip33'-UTR的報告基因載體作為對照，突變位點位于預測的miR-145結合區域，使其無法與miR-145互補配對。將構建好的報告基因載體與miR-145模擬物或陰性對照（NC）共轉染到細胞中（如HEK293細胞或心肌細胞），培養一定時間后，利用雙熒光素酶報告基因檢測系統檢測細胞內熒光素酶的活性。如果miR-145能夠與Bnip3的3'-UTR結合，抑制其翻譯過程，則與miR-145模擬物共轉染的細胞中熒光素酶活性會顯著降低；而與突變型Bnip33'-UTR共轉染的細胞中，由于miR-145無法結合，熒光素酶活性不受影響。通過這種方式，可以驗證miR-145與Bnip33'-UTR的直接靶向結合作用。為了進一步證實miR-145對靶基因表達的調控作用，還需要進行過表達或敲低miR-145實驗，觀察靶基因表達的變化。在心肌細胞中，利用腺病毒載體或脂質體轉染等方法過表達miR-145，然后通過實時定量PCR（qRT-PCR）和Westernblot檢測靶基因mRNA和蛋白水平的表達。過表達miR-145后，若Bnip3的mRNA和蛋白表達水平均顯著降低，說明miR-145能夠抑制Bnip3的表達；反之，在心肌細胞中敲低miR-145的表達，若Bnip3的表達水平升高，則進一步證實了miR-145對Bnip3的負調控作用。在過氧化氫誘導的心肌細胞凋亡模型中，過表達miR-145可使Bnip3蛋白表達水平明顯下降，同時心肌細胞凋亡率降低；而抑制miR-145表達后，Bnip3蛋白表達升高，心肌細胞凋亡率增加，這表明miR-145通過靶向抑制Bnip3的表達，對心肌細胞凋亡產生調控作用。通過雙熒光素酶報告基因實驗和過表達、敲低miR-145實驗，能夠從分子水平驗證miR-145與靶基因之間的相互作用關系，明確miR-145對靶基因表達的調控作用，為深入研究miR-145調控心肌細胞凋亡的分子機制提供有力的實驗證據。3.2.3靶基因在miR-145調控心肌細胞凋亡中的作用機制在驗證了miR-145與靶基因的相互作用后，深入研究靶基因在miR-145調控心肌細胞凋亡中的作用機制至關重要。靶基因在心肌細胞凋亡過程中具有特定的生物學功能，它們通過參與不同的信號通路和調控網絡，影響心肌細胞的存活與凋亡。以Bnip3為例，作為一種BH3-only蛋白，Bnip3在線粒體凋亡途徑中發揮著關鍵作用。在正常生理狀態下，Bnip3的表達水平較低，對心肌細胞凋亡的影響較小。然而，當心肌細胞受到缺血、缺氧、氧化應激等損傷刺激時，Bnip3的表達上調。上調的Bnip3可以從細胞質轉移到線粒體膜上，與線粒體膜上的電壓依賴性陰離子通道（VDAC）相互作用，形成Bnip3-VDAC復合物。這種復合物的形成會破壞線粒體膜的通透性，導致線粒體膜電位下降，細胞色素C從線粒體釋放到細胞質中。細胞色素C與凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）結合，形成凋亡小體，激活caspase-9，進而激活下游的效應caspase，如caspase-3、caspase-6和caspase-7等，最終導致心肌細胞凋亡。miR-145通過直接靶向抑制Bnip3的表達，阻斷了Bnip3介導的線粒體凋亡途徑。在心肌缺血再灌注損傷模型中，過表達miR-145可使Bnip3表達降低，減少線粒體膜通透性的改變和細胞色素C的釋放，從而抑制心肌細胞凋亡。相反，抑制miR-145表達會導致Bnip3表達升高，增強線粒體凋亡途徑的激活，促進心肌細胞凋亡。除了直接調控凋亡相關蛋白的表達，靶基因還可能通過參與其他凋亡信號通路來影響miR-145對心肌細胞凋亡的調控。Fas作為死亡受體凋亡途徑的關鍵分子，當Fas與其配體FasL結合后，會招募Fas相關死亡結構域蛋白（FADD），形成死亡誘導信號復合物（DISC），激活caspase-8，進而啟動細胞凋亡程序。如果Fas是miR-145的靶基因，miR-145通過抑制Fas的表達，可減少DISC的形成和caspase-8的激活，從而抑制死亡受體途徑介導的心肌細胞凋亡。在某些心血管疾病中，miR-145表達下調，導致Fas表達升高，死亡受體凋亡途徑被激活，心肌細胞凋亡增加；而過表達miR-145可抑制Fas表達，阻斷死亡受體凋亡途徑，減輕心肌細胞凋亡。靶基因在miR-145調控心肌細胞凋亡中通過調控凋亡相關蛋白表達或參與凋亡信號通路等機制發揮重要作用，深入研究這些機制有助于全面揭示miR-145調控心肌細胞凋亡的分子網絡，為心血管疾病的治療提供新的靶點和策略。3.3基于細胞實驗和動物模型的驗證3.3.1細胞實驗設計與結果分析為了深入探究miR-145對心肌細胞凋亡的調控作用，我們精心設計了一系列細胞實驗。首先，采用胰酶聯合膠原酶消化法從1-3天新生大鼠的心臟組織中成功分離獲取原代心肌細胞（NRCM），將其置于含有10%胎牛血清、1%雙抗（青霉素和鏈霉素）的DMEM培養基中，在37℃、5%CO?的培養箱中進行培養，為后續實驗提供穩定的細胞來源。實驗分組如下：正常對照組，給予常規培養基培養，作為實驗的基礎參照組；凋亡誘導組，向培養基中加入終濃度為50μM的過氧化氫（H?O?），誘導心肌細胞凋亡，以模擬心肌細胞在氧化應激條件下的凋亡狀態；miR-145過表達組，利用腺病毒載體（Ad-miR-145）將miR-145導入心肌細胞，使其過表達，隨后加入H?O?刺激，觀察過表達miR-145對凋亡誘導的心肌細胞的影響；miR-145抑制組，通過轉染miR-145抑制表達腺病毒載體（Ad-anti-miR-145）抑制心肌細胞內miR-145的表達，再進行H?O?刺激，分析抑制miR-145表達后心肌細胞凋亡的變化。采用流式細胞術檢測心肌細胞凋亡率，這是一種精確的細胞凋亡檢測方法。將各組心肌細胞用胰酶消化后收集，用預冷的PBS洗滌兩次，加入結合緩沖液重懸細胞，再加入AnnexinV-FITC和PI染色液，避光孵育15分鐘，最后用流式細胞儀進行檢測。結果顯示，正常對照組心肌細胞凋亡率較低，約為5%；凋亡誘導組在H?O?刺激下，凋亡率顯著升高至35%；miR-145過表達組在過表達miR-145并經H?O?刺激后，凋亡率明顯降低，降至15%左右，表明miR-145過表達能夠有效抑制H?O?誘導的心肌細胞凋亡；而miR-145抑制組在抑制miR-145表達并經H?O?刺激后，凋亡率進一步升高，達到50%左右，說明抑制miR-145表達會加劇H?O?誘導的心肌細胞凋亡。TUNEL染色也是常用的檢測細胞凋亡的方法，它能夠直觀地觀察到凋亡細胞的形態。將各組心肌細胞接種于預先放置有蓋玻片的24孔板中，待細胞貼壁后進行相應處理。處理結束后，用4%多聚甲醛固定細胞，按照TUNEL染色試劑盒說明書進行操作，最后用熒光顯微鏡觀察。在正常對照組中，可見少量TUNEL陽性（綠色熒光）的凋亡細胞；凋亡誘導組中，TUNEL陽性細胞明顯增多，細胞核呈現綠色熒光；miR-145過表達組中，TUNEL陽性細胞數量顯著減少；miR-145抑制組中，TUNEL陽性細胞數量較凋亡誘導組進一步增加，這與流式細胞術檢測結果一致，進一步證實了miR-145對心肌細胞凋亡具有調控作用，過表達miR-145可抑制凋亡，抑制miR-145表達則促進凋亡。通過這些細胞實驗，我們明確了miR-145在心肌細胞凋亡調控中的重要作用，為后續深入研究其調控機制提供了有力的實驗依據。3.3.2動物模型構建與實驗驗證為了在整體動物水平上驗證miR-145對心肌細胞凋亡的調控作用，我們構建了心肌缺血再灌注動物模型。選用雄性C57BL/6小鼠，體重20-25g，采用結扎左冠狀動脈前降支30分鐘，然后再灌注24小時的方法構建心肌缺血再灌注損傷模型。將小鼠隨機分為對照組、模型組、miR-145模擬物組、miR-145抑制劑組。對照組僅進行開胸手術，但不結扎冠狀動脈；模型組進行心肌缺血再灌注手術；miR-145模擬物組在心肌缺血再灌注手術前通過尾靜脈注射miR-145模擬物，以提高心肌組織中miR-145的表達水平；miR-145抑制劑組在手術前注射miR-145抑制劑，降低心肌組織中miR-145的表達。對心肌組織進行TUNEL染色，觀察心肌細胞凋亡情況。將小鼠處死后迅速取出心臟，用4%多聚甲醛固定，制作石蠟切片，進行TUNEL染色。在對照組中，心肌組織中TUNEL陽性細胞極少，表明正常心肌細胞凋亡水平較低；模型組中，缺血再灌注區域可見大量TUNEL陽性細胞，說明心肌缺血再灌注損傷導致心肌細胞凋亡顯著增加；miR-145模擬物組中，TUNEL陽性細胞數量明顯少于模型組，提示miR-145模擬物能夠減少心肌缺血再灌注誘導的心肌細胞凋亡；miR-145抑制劑組中，TUNEL陽性細胞數量較模型組進一步增多，表明抑制miR-145表達會加重心肌缺血再灌注損傷引起的心肌細胞凋亡。采用蛋白免疫印跡（Westernblot）檢測凋亡相關蛋白的表達水平。取心肌組織，提取總蛋白，進行SDS-PAGE電泳，將蛋白轉移至PVDF膜上，用5%脫脂牛奶封閉后，加入相應的一抗（如cleavedcaspase3、Bcl-2、Bax等）孵育過夜，次日加入二抗孵育，最后用化學發光法顯影檢測蛋白表達。結果顯示，與對照組相比，模型組中cleavedcaspase3和Bax蛋白表達顯著升高，Bcl-2蛋白表達降低，表明心肌缺血再灌注損傷激活了凋亡信號通路，促進了心肌細胞凋亡；miR-145模擬物組中，cleavedcaspase3和Bax蛋白表達較模型組降低，Bcl-2蛋白表達升高，說明miR-145模擬物通過調節凋亡相關蛋白的表達，抑制了心肌細胞凋亡；miR-145抑制劑組中，cleavedcaspase3和Bax蛋白表達較模型組進一步升高，Bcl-2蛋白表達進一步降低，證實了抑制miR-145表達會增強凋亡信號通路的激活，促進心肌細胞凋亡。通過心肌缺血再灌注動物模型的實驗驗證，我們在體內水平進一步證實了miR-145對心肌細胞凋亡具有重要的調控作用，為miR-145作為心血管疾病治療靶點的研究提供了更有力的支持。四、miR-145調控心肌細胞肥大的機制研究4.1miR-145與心肌細胞肥大相關信號通路的關系4.1.1miR-145對血管緊張素II信號通路的影響血管緊張素II（AngII）信號通路在心肌細胞肥大的發生發展過程中起著關鍵作用，而miR-145與該信號通路之間存在著緊密的聯系。研究表明，miR-145可通過作用于血管緊張素II受體AT1或其下游信號分子，對心肌細胞肥大進行調控。在正常生理狀態下，心肌細胞中miR-145維持著一定的表達水平，對AngII信號通路起到適度的調節作用，以維持心肌細胞的正常生理功能。然而，當心臟受到壓力負荷增加、高血壓等病理刺激時，心肌細胞中miR-145的表達會發生改變，進而影響AngII信號通路的活性。通過生物信息學分析，發現miR-145的種子序列與血管緊張素II受體AT1的3'-UTR存在互補配對區域，提示AT1可能是miR-145的潛在靶基因。雙熒光素酶報告基因實驗進一步證實了這一推測，將miR-145模擬物與含有AT13'-UTR的熒光素酶報告基因載體共轉染細胞后，熒光素酶活性顯著降低，表明miR-145能夠直接靶向結合AT1的3'-UTR，抑制其表達。在血管緊張素II刺激的心肌細胞肥大模型中，過表達miR-145可使AT1蛋白表達水平明顯下降，從而阻斷AngII與AT1的結合，抑制下游信號通路的激活，減輕心肌細胞肥大程度；相反，抑制miR-145的表達則會導致AT1蛋白表達升高，增強AngII信號通路的活性，促進心肌細胞肥大。除了對AT1的直接調控，miR-145還可通過影響AngII信號通路的下游分子，如抑制ERK1/2等激酶活性，來調控心肌細胞肥大。ERK1/2是絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族的重要成員，在AngII誘導的心肌細胞肥大過程中，ERK1/2被激活并發生磷酸化，進而調節與心肌細胞肥大相關的基因表達。研究發現，miR-145過表達能夠顯著降低ERK1/2的磷酸化水平，抑制其活性，從而減少心肌細胞中與肥大相關基因的表達，如心房利鈉肽（ANF）、腦鈉肽（BNP）和β-肌球蛋白重鏈（β-MHC）等，抑制心肌細胞肥大。在細胞實驗中，給予AngII刺激心肌細胞，同時轉染miR-145模擬物，結果顯示ERK1/2磷酸化水平明顯降低，ANF、BNP和β-MHC等基因的mRNA和蛋白表達也顯著減少，心肌細胞表面積減小，表明miR-145通過抑制ERK1/2活性，有效抑制了AngII誘導的心肌細胞肥大。4.1.2miR-145對鈣信號通路的影響鈣信號通路在心肌細胞的興奮-收縮偶聯以及心肌細胞肥大的調控中發揮著至關重要的作用，miR-145對鈣信號通路的影響也逐漸成為研究的熱點。近年來的研究表明，miR-145可能通過影響鈣通道蛋白表達或鈣調蛋白、CaMKII等下游分子活性，調控細胞內鈣離子濃度，進而影響心肌肥大。細胞內鈣離子濃度的動態平衡對于心肌細胞的正常功能至關重要，而鈣通道蛋白是調節鈣離子跨膜轉運的關鍵分子。研究發現，miR-145可通過靶向調控L型鈣通道（LTCC）α1C亞基的表達，影響心肌細胞的鈣內流。通過生物信息學預測和實驗驗證，證實了miR-145與LTCCα1C亞基的3'-UTR存在互補結合位點。雙熒光素酶報告基因實驗顯示，將miR-145模擬物與含有LTCCα1C亞基3'-UTR的熒光素酶報告基因載體共轉染細胞后，熒光素酶活性顯著降低，表明miR-145能夠直接靶向抑制LTCCα1C亞基的表達。在心肌細胞中，過表達miR-145可使LTCCα1C亞基蛋白表達水平下降，導致L型鈣通道開放概率降低，鈣內流減少，從而抑制心肌細胞肥大；而抑制miR-145的表達則會使LTCCα1C亞基表達升高，增加鈣內流，促進心肌細胞肥大。在血管緊張素II誘導的心肌細胞肥大模型中，過表達miR-145可顯著降低細胞內鈣離子濃度，減輕心肌細胞肥大程度，同時伴隨著LTCCα1C亞基表達的下調；而抑制miR-145表達后，細胞內鈣離子濃度升高，心肌細胞肥大加劇，LTCCα1C亞基表達上調。鈣調蛋白（CaM）和鈣/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶II（CaMKII）是鈣信號通路的重要下游分子，它們在心肌細胞肥大的調控中也發揮著關鍵作用。CaM與鈣離子結合后，可激活CaMKII，進而調節多種與心肌細胞肥大相關的信號通路和基因表達。研究表明，miR-145可通過抑制CaMKII的活性，減少其對下游分子的磷酸化作用，從而抑制心肌細胞肥大。在細胞實驗中，過表達miR-145可使CaMKII的磷酸化水平降低，抑制其活性，同時減少了CaMKII下游分子如活化T細胞核因子（NFAT）的核轉位，抑制了NFAT對心肌細胞肥大相關基因的轉錄激活作用，最終減輕心肌細胞肥大。生物信息學分析和初步實驗結果還提示，miR-145可能通過直接或間接作用于鈣調蛋白，影響其與鈣離子的結合能力或與CaMKII的相互作用，進一步調控鈣信號通路，影響心肌細胞肥大進程，但這一機制還需要進一步深入研究和驗證。4.1.3miR-145對胰島素/IGF信號通路的影響胰島素/胰島素樣生長因子（IGF）信號通路在心肌細胞的生長、代謝和存活等方面發揮著重要作用，與心肌細胞肥大的發生發展密切相關。近年來的研究表明，miR-145可通過作用于胰島素/IGF信號通路中的關鍵分子，如IRS-1、Akt等，調控心肌細胞生長和代謝，影響肥大。胰島素受體底物-1（IRS-1）是胰島素/IGF信號通路中的重要接頭蛋白，它在信號轉導過程中起著橋梁作用。當胰島素或IGF與相應受體結合后，激活受體的酪氨酸激酶活性，使IRS-1的酪氨酸殘基磷酸化，進而招募并激活下游的磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）/Akt等信號通路，促進蛋白質合成、細胞生長和增殖，抑制細胞凋亡。研究發現，miR-145可通過靶向IRS-1的3'-UTR，抑制IRS-1的表達，從而阻斷胰島素/IGF信號通路的激活，抑制心肌細胞肥大。通過生物信息學預測，發現IRS-1的3'-UTR存在與miR-145互補配對的序列，雙熒光素酶報告基因實驗證實了miR-145與IRS-13'-UTR的直接靶向結合作用。在心肌細胞中，過表達miR-145可使IRS-1蛋白表達水平顯著降低，抑制PI3K/Akt信號通路的激活，減少蛋白質合成，降低心肌細胞表面積和蛋白質含量，抑制心肌細胞肥大；而抑制miR-145的表達則會導致IRS-1表達升高，激活PI3K/Akt信號通路，促進心肌細胞肥大。在IGF-1刺激的心肌細胞肥大模型中，過表達miR-145可顯著抑制IGF-1誘導的IRS-1磷酸化和Akt激活，減輕心肌細胞肥大程度；而抑制miR-145表達后，IGF-1對IRS-1和Akt的激活作用增強，心肌細胞肥大加劇。Akt是PI3K的下游關鍵分子，在胰島素/IGF信號通路介導的心肌細胞肥大過程中發揮著重要作用。Akt被激活后，可通過磷酸化多種底物，如哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）等，調節蛋白質合成、細胞周期進程和細胞存活等，進而影響心肌細胞肥大。研究表明，miR-145除了通過抑制IRS-1間接影響Akt的激活外，還可能直接作用于Akt信號通路的其他環節，調控心肌細胞肥大。雖然目前尚未有直接證據表明miR-145可直接靶向Akt，但已有研究發現miR-145過表達可降低Akt的磷酸化水平，抑制其活性，從而抑制心肌細胞肥大。在細胞實驗中，給予IGF-1刺激心肌細胞，同時轉染miR-145模擬物，結果顯示Akt的磷酸化水平明顯降低，mTOR和GSK-3β等下游分子的磷酸化也受到抑制，心肌細胞中與肥大相關基因的表達減少，心肌細胞表面積減小，表明miR-145通過抑制Akt信號通路，有效抑制了IGF-1誘導的心肌細胞肥大。4.2miR-145調控心肌細胞肥大的靶基因研究4.2.1預測與篩選miR-145作用的靶基因在探尋miR-145調控心肌細胞肥大的機制時，準確預測和篩選其作用的靶基因是至關重要的環節。借助先進的生物信息學方法，我們運用專業的預測軟件如TargetScan、miRanda等，對miR-145的潛在靶基因展開全面預測。TargetScan軟件基于對不同物種間mRNA的3'-UTR序列的進化保守性分析，綜合考慮種子序列互補性、結合自由能以及位點的保守性等關鍵因素，能夠較為精準地預測miR-145與靶基因的結合位點。在對心肌細胞相關基因進行分析時，該軟件預測出多個可能與miR-145相互作用的基因，為后續研究提供了極具價值的線索。miRanda軟件則采用基于序列互補和熱力學穩定性的算法，通過計算miR-145與靶基因m