S100A8A9與S100A4：外陰硬化性苔蘚及外陰鱗癌發(fā)病進(jìn)程中的關(guān)鍵蛋白標(biāo)記物探究一、引言1.1研究背景外陰硬化性苔蘚（VulvarLichenSclerosus，VLS）是一種以外陰、肛周皮膚萎縮、變薄、色素減退為主要特征的慢性皮膚病。其病因尚不完全明確，可能與遺傳、自身免疫、性激素水平變化、局部慢性刺激或損傷等因素有關(guān)，也可能與一些其他疾病如糖尿病、甲狀腺疾病等有關(guān)。患者多表現(xiàn)為外陰瘙癢、疼痛、性交困難等癥狀，病變初期外陰皮膚可能僅表現(xiàn)為輕度發(fā)紅、腫脹，隨后逐漸出現(xiàn)皮膚變白、變薄、失去彈性，嚴(yán)重者可導(dǎo)致外陰解剖結(jié)構(gòu)變形，影響排尿和性生活。目前，雖然其治療手段多樣，包括藥物治療、物理治療和手術(shù)治療等，但該病病程長(zhǎng)，易反復(fù)發(fā)作，給患者的生活質(zhì)量帶來(lái)極大影響。外陰鱗癌（VulvarSquamousCellCarcinoma，VSCC）是臨床較為少見(jiàn)的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，多見(jiàn)于60歲以上婦女，其發(fā)生率近年有所增加。外陰鱗癌的發(fā)生與人類乳頭狀病毒（HPV）感染、外陰白斑、外陰硬化性苔蘚及外陰的一些性傳播疾病均有關(guān)系。外陰鱗癌患者最常見(jiàn)的癥狀是局部瘙癢，多數(shù)位于大陰唇，也可在小陰唇、會(huì)陰、陰阜，約10%發(fā)生在陰蒂。在臨床中，外陰鱗癌以手術(shù)切除治療為主，但術(shù)后復(fù)發(fā)率較高，中晚期患者的存活率相對(duì)下降，嚴(yán)重威脅女性的生命健康。S100蛋白家族是一類低分子量酸性鈣離子結(jié)合蛋白，具有EF手相結(jié)構(gòu)，可在特定時(shí)空參與鈣離子信號(hào)傳導(dǎo)，調(diào)節(jié)多種細(xì)胞生物學(xué)活動(dòng)，如細(xì)胞分化、細(xì)胞遷移、基因轉(zhuǎn)錄以及細(xì)胞周期運(yùn)行等。S100A8、S100A9與S100A4均屬于S100蛋白家族，其中S100A8和S100A9極易形成異二聚體復(fù)合物S100A8A9。研究表明，S100A8A9表達(dá)失調(diào)與幾種常見(jiàn)的人類惡性腫瘤相關(guān)，在炎癥反應(yīng)中也發(fā)揮著關(guān)鍵作用。而S100A4蛋白同樣在多種惡性腫瘤中有異常表達(dá)，能夠影響癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為。目前已有許多研究表明，S100A8A9和S100A4在外陰硬化性苔蘚和外陰鱗癌中表達(dá)異常升高，對(duì)于這兩種疾病的發(fā)病和發(fā)展有著重要的意義，但其具體作用機(jī)制尚未完全明確。深入探究S100A8A9和S100A4在外陰硬化性苔蘚及外陰鱗癌中的表達(dá)及意義，有望為這兩種疾病的早期診斷、治療及預(yù)后評(píng)估提供新的思路和靶點(diǎn)。1.2研究目的與意義本研究旨在通過(guò)檢測(cè)S100A8A9和S100A4在外陰硬化性苔蘚及外陰鱗癌組織中的表達(dá)情況，明確這兩種蛋白的表達(dá)水平與疾病發(fā)生、發(fā)展之間的關(guān)聯(lián)，進(jìn)而初步探討其在疾病進(jìn)程中的作用機(jī)制。通過(guò)對(duì)S100A8A9和S100A4的深入研究，期望為外陰硬化性苔蘚及外陰鱗癌的早期診斷提供新的生物標(biāo)志物，為臨床醫(yī)生在疾病早期階段準(zhǔn)確識(shí)別和診斷疾病提供有力依據(jù)，從而實(shí)現(xiàn)早發(fā)現(xiàn)、早治療。在治療方面，有望為開(kāi)發(fā)針對(duì)這兩種疾病的新治療策略提供理論基礎(chǔ)，例如通過(guò)調(diào)節(jié)S100A8A9和S100A4的表達(dá)或活性，為疾病的分子靶向治療開(kāi)辟新的途徑，提高治療效果，改善患者預(yù)后，減輕患者痛苦，具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值和理論研究意義。二、理論基礎(chǔ)2.1S100蛋白家族S100蛋白家族是一類低分子量的酸性鈣離子結(jié)合蛋白，其分子量范圍在9-13kDa之間，僅在脊椎動(dòng)物中表達(dá)。該家族成員具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特征，最為顯著的是擁有兩個(gè)EF手相結(jié)構(gòu)，這兩個(gè)結(jié)構(gòu)分別位于蛋白的羧基端和氨基末端，其中氨基末端的EF手結(jié)構(gòu)是S100蛋白家族所特有的。所謂EF手結(jié)構(gòu)，是一種螺旋-環(huán)-螺旋的特殊構(gòu)象，其中的E、F代表兩個(gè)螺旋，而環(huán)結(jié)構(gòu)則是與鈣離子結(jié)合的關(guān)鍵部位。在兩個(gè)EF手結(jié)構(gòu)中間存在著鉸鏈區(qū)，并且羧基端還有擴(kuò)展區(qū)，這些區(qū)域在不同的S100蛋白家族成員中呈現(xiàn)出多變性，正是這種多變性賦予了各個(gè)成員獨(dú)特的生物活性。目前，科研人員已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了至少20個(gè)S100蛋白家族成員，常見(jiàn)的包括S100A1-A15、S100B等，它們?cè)谌梭w組織中呈現(xiàn)出組織特異性表達(dá)的特點(diǎn)。在細(xì)胞內(nèi)，S100蛋白主要以同型二聚體的形式存在，同時(shí)也存在異型二聚體、三聚體以及四聚體等多種形式。當(dāng)S100蛋白與鈣離子結(jié)合后，其蛋白構(gòu)象會(huì)發(fā)生改變，原本隱藏的與靶蛋白結(jié)合的位點(diǎn)得以暴露，進(jìn)而與靶蛋白結(jié)合并發(fā)揮一系列重要的生物學(xué)效應(yīng)，這些效應(yīng)廣泛涉及細(xì)胞內(nèi)外的多種生理過(guò)程。在細(xì)胞內(nèi)，S100蛋白參與調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)磷酸化過(guò)程，例如S100A4在其中發(fā)揮關(guān)鍵作用；同時(shí)還能夠調(diào)節(jié)多種酶的活性，像S100A1、S100A11以及S100B等成員都參與了這一過(guò)程；此外，S100蛋白對(duì)于維持細(xì)胞內(nèi)的Ca2?穩(wěn)態(tài)也至關(guān)重要，S100M、S100A4和S100B等成員在這方面有著重要貢獻(xiàn)；在細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)方面，S100蛋白同樣發(fā)揮著不可或缺的作用，它可以影響細(xì)胞的形態(tài)和運(yùn)動(dòng)等。在細(xì)胞外，S100蛋白可以作為一種信號(hào)分子，參與細(xì)胞間的通訊和信號(hào)傳導(dǎo)，調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的活性，參與炎癥反應(yīng)等過(guò)程。例如，當(dāng)機(jī)體受到病原體感染或組織損傷時(shí)，細(xì)胞外的S100蛋白能夠被免疫細(xì)胞識(shí)別，進(jìn)而激活免疫細(xì)胞，引發(fā)一系列的免疫反應(yīng)，以抵御病原體的入侵和修復(fù)受損組織。S100A8和S100A9在S100蛋白家族中有著獨(dú)特的作用。S100A8，也被稱為鈣粒蛋白A，和S100A9（鈣粒蛋白B）在中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞中高表達(dá)。這兩種蛋白極易形成異二聚體復(fù)合物S100A8A9，該復(fù)合物在炎癥反應(yīng)中扮演著核心角色。在炎癥發(fā)生時(shí)，免疫細(xì)胞被激活，S100A8A9的表達(dá)水平會(huì)顯著上調(diào)。它可以通過(guò)與細(xì)胞膜上的特定受體如晚期糖基化終產(chǎn)物受體（RAGE）結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路，促使免疫細(xì)胞釋放多種炎癥因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）等，進(jìn)一步放大炎癥反應(yīng)。同時(shí)，S100A8A9還能夠趨化免疫細(xì)胞向炎癥部位遷移，增強(qiáng)機(jī)體的免疫防御能力。然而，在某些慢性炎癥狀態(tài)下，S100A8A9的持續(xù)高表達(dá)可能導(dǎo)致炎癥反應(yīng)失控，對(duì)機(jī)體組織造成損傷。S100A4在S100蛋白家族中同樣具有獨(dú)特功能。S100A4，又稱為成纖維細(xì)胞特異性蛋白1（FSP1），在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。研究表明，S100A4在多種惡性腫瘤細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)。它能夠與細(xì)胞內(nèi)的多種蛋白相互作用，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的多種生物學(xué)行為。例如，S100A4可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，使腫瘤細(xì)胞更快地進(jìn)入細(xì)胞分裂周期，從而加速腫瘤的生長(zhǎng)。在腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移方面，S100A4能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的重構(gòu)，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力，使其更容易突破基底膜，侵入周圍組織，并通過(guò)血液循環(huán)或淋巴循環(huán)轉(zhuǎn)移到遠(yuǎn)處器官。此外，S100A4還可以影響腫瘤微環(huán)境，促進(jìn)血管生成，為腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移提供充足的營(yíng)養(yǎng)和氧氣供應(yīng)。2.2外陰硬化性苔蘚外陰硬化性苔蘚是一種以外陰及肛周皮膚萎縮變薄、色素減退變白為主要特征的慢性炎癥性皮膚病。目前，其病因尚未完全明確，眾多研究表明，該病可能是多種因素共同作用的結(jié)果。從自身免疫角度來(lái)看，有研究發(fā)現(xiàn)約21%的外陰硬化性苔蘚患者合并自身免疫性相關(guān)性疾病，如斑禿、白癜風(fēng)、甲狀腺疾病等，這表明自身免疫異常在疾病的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用。遺傳因素也不容忽視，相關(guān)研究指出，部分患者存在家族聚集現(xiàn)象，提示遺傳易感性可能使個(gè)體更容易患上外陰硬化性苔蘚。性激素缺乏同樣可能是病因之一，臨床觀察發(fā)現(xiàn)，一些患者在絕經(jīng)后病情加重，補(bǔ)充性激素后癥狀有所緩解，這暗示性激素水平的變化與疾病密切相關(guān)。此外，感染因素，如某些病毒、細(xì)菌感染，也可能與外陰硬化性苔蘚的發(fā)病存在關(guān)聯(lián)，但具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步深入研究。患者主要癥狀為病損區(qū)瘙癢、性交痛及外陰燒灼感，瘙癢程度一般較慢性單純性苔蘚患者輕，但晚期可出現(xiàn)性交困難。對(duì)于幼女患者，瘙癢癥狀通常不明顯，多在排尿或排便后感外陰或肛周不適。病損區(qū)常位于大陰唇、小陰唇、陰蒂包皮、陰唇后聯(lián)合及肛周，多呈對(duì)稱性分布，一般不累及陰道黏膜。在疾病初期，外陰皮膚可能僅表現(xiàn)為輕度發(fā)紅、腫脹，隨著病情進(jìn)展，皮膚逐漸變白、變薄，彈性降低，嚴(yán)重時(shí)可出現(xiàn)外陰萎縮，小陰唇變小甚至消失，大陰唇變薄，陰蒂萎縮，陰道口狹窄等解剖結(jié)構(gòu)改變，對(duì)患者的排尿和性生活造成嚴(yán)重影響。外陰硬化性苔蘚的病理特征較為典型，主要表現(xiàn)為表皮萎縮，表皮釘突消失，基底細(xì)胞液化變性；表皮過(guò)度角化，出現(xiàn)角栓；黑素細(xì)胞減少，導(dǎo)致外陰皮膚色素減退呈白色；真皮淺層膠原纖維玻璃樣變，真皮層有淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞浸潤(rùn)。在炎癥過(guò)程中，免疫細(xì)胞如淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞等被激活，釋放多種炎癥介質(zhì)，如白細(xì)胞介素、腫瘤壞死因子等。這些炎癥介質(zhì)會(huì)進(jìn)一步損傷皮膚組織，導(dǎo)致皮膚的正常結(jié)構(gòu)和功能遭到破壞。例如，炎癥介質(zhì)可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞的活化，使其合成過(guò)多的膠原纖維，導(dǎo)致真皮淺層膠原纖維玻璃樣變，皮膚彈性下降；同時(shí)，炎癥介質(zhì)還可以影響黑素細(xì)胞的功能，使其合成黑素減少，從而出現(xiàn)皮膚色素減退變白的癥狀。炎癥在疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，持續(xù)的炎癥反應(yīng)不僅會(huì)導(dǎo)致皮膚組織的慢性損傷，還可能促使疾病進(jìn)一步發(fā)展，增加患者發(fā)生惡變的風(fēng)險(xiǎn)。2.3外陰鱗癌外陰鱗癌是外陰惡性腫瘤中最常見(jiàn)的病理類型，約占外陰惡性腫瘤的80％-90％，好發(fā)于老年婦女，近年來(lái)年輕女性的發(fā)病率也呈現(xiàn)出增高趨勢(shì)。其發(fā)病原因較為復(fù)雜，目前尚未完全明確，但大量研究表明，與人乳頭瘤病毒（HPV）感染密切相關(guān)，尤其是高危型HPV16、18型感染，可導(dǎo)致外陰上皮細(xì)胞的異常增殖和分化，進(jìn)而引發(fā)癌變。此外，外陰白斑、外陰硬化性苔蘚等慢性外陰疾病，由于長(zhǎng)期的炎癥刺激，也會(huì)增加外陰鱗癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。外陰尖銳濕疣、淋病、梅毒、淋巴肉芽腫等性傳播疾病，以及不良的性衛(wèi)生習(xí)慣，都可能破壞外陰局部的正常防御機(jī)制，使得病原體更容易侵入，從而誘發(fā)外陰鱗癌。外陰鱗癌的臨床表現(xiàn)多樣，患者常先出現(xiàn)外陰瘙癢的癥狀，這是由于腫瘤細(xì)胞刺激局部神經(jīng)末梢所導(dǎo)致。隨著病情進(jìn)展，局部會(huì)出現(xiàn)腫塊，腫塊可呈結(jié)節(jié)狀、乳頭狀、菜花狀等不同形態(tài)。在腫塊生長(zhǎng)過(guò)程中，如果合并感染，還會(huì)出現(xiàn)疼痛、滲液和出血等癥狀。當(dāng)腫瘤侵犯鄰近器官時(shí)，會(huì)引發(fā)一系列相應(yīng)的癥狀，如侵犯尿道可導(dǎo)致尿頻、尿急、血尿、排尿困難；侵犯直腸則可能出現(xiàn)便秘、便血、排便困難等。外陰鱗癌的臨床分期對(duì)于治療方案的選擇和預(yù)后評(píng)估具有重要意義。目前，國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（FIGO）2009年的分期系統(tǒng)被廣泛應(yīng)用，該系統(tǒng)主要依據(jù)原發(fā)腫瘤的大小、間質(zhì)浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況以及腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等因素進(jìn)行分期。具體如下：Ⅰ期：腫瘤局限于外陰和（或）會(huì)陰，最大徑線≤2cm，間質(zhì)浸潤(rùn)深度≤1.0mm，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。其中，Ⅰa期為間質(zhì)浸潤(rùn)深度≤1.0mm；Ⅰb期為間質(zhì)浸潤(rùn)深度＞1.0mm。Ⅱ期：腫瘤局限于外陰和（或）會(huì)陰，最大徑線＞2cm，或腫瘤侵犯尿道黏膜、陰道黏膜、肛門黏膜，但未超過(guò)這些器官的黏膜下組織，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。Ⅲ期：無(wú)論腫瘤大小，只要出現(xiàn)區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，包括腹股溝淺淋巴結(jié)、腹股溝深淋巴結(jié)或盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，都屬于Ⅲ期。具體又分為Ⅲa期（1-2枚腹股溝淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移灶最大徑≤5mm）、Ⅲb期（1-2枚腹股溝淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移灶最大徑＞5mm）和Ⅲc期（≥3枚腹股溝淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，或任何盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移）。Ⅳ期：腫瘤侵犯至尿道上段、膀胱黏膜、直腸黏膜、盆腔骨骼，或出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，如肺、肝、骨等部位的轉(zhuǎn)移。Ⅳa期為腫瘤侵犯至尿道上段、膀胱黏膜、直腸黏膜、盆腔骨骼；Ⅳb期為出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。外陰鱗癌的治療以手術(shù)治療為主，手術(shù)方式的選擇需要根據(jù)腫瘤的分期、患者的年齡、身體狀況等因素綜合考慮。對(duì)于早期患者（Ⅰ期和Ⅱ期），通常采用根治性外陰切除術(shù)及腹股溝淋巴結(jié)切除術(shù)，旨在徹底切除腫瘤組織，防止癌細(xì)胞擴(kuò)散。對(duì)于Ⅲ期和Ⅳ期患者，手術(shù)范圍可能會(huì)更大，除了切除外陰和淋巴結(jié)外，還可能需要切除部分尿道、陰道、直腸等鄰近器官，以達(dá)到根治的目的，但這種手術(shù)方式會(huì)對(duì)患者的生活質(zhì)量造成較大影響。在手術(shù)治療的基礎(chǔ)上，晚期患者或存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，還需要輔以放射治療和化學(xué)藥物治療。放射治療可以通過(guò)高能射線殺死癌細(xì)胞，減少腫瘤復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)；化學(xué)藥物治療則是利用化療藥物抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和分裂，常用的化療藥物有順鉑、博來(lái)霉素、紫杉醇等。放化療在一定程度上能夠提高患者的生存率，但也會(huì)帶來(lái)一些不良反應(yīng)，如放射性外陰炎、放射性外陰壞死、尿瘺、尿道阻塞以及化療藥物引起的惡心、嘔吐、脫發(fā)、骨髓抑制等，這些不良反應(yīng)會(huì)嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和治療依從性。外陰鱗癌的侵襲和轉(zhuǎn)移是影響患者預(yù)后的關(guān)鍵因素。腫瘤細(xì)胞的侵襲能力使其能夠突破基底膜，侵入周圍組織，進(jìn)一步侵犯鄰近器官，導(dǎo)致病情惡化。而轉(zhuǎn)移則使得癌細(xì)胞通過(guò)淋巴道或血行轉(zhuǎn)移到遠(yuǎn)處器官，形成新的轉(zhuǎn)移灶，極大地增加了治療的難度和患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)。研究表明，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者5年生存率明顯低于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，例如，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者5年生存率可達(dá)90%，而存在5-6枚淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者5年生存率僅為24%。此外，腫瘤的大小、間質(zhì)浸潤(rùn)深度等因素也與侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，腫瘤越大、間質(zhì)浸潤(rùn)越深，發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移的可能性就越高，患者的預(yù)后也就越差。三、研究設(shè)計(jì)3.1實(shí)驗(yàn)材料本實(shí)驗(yàn)所使用的標(biāo)本均選自[醫(yī)院名稱]病理研究室內(nèi)[具體時(shí)間段]經(jīng)手術(shù)切除活檢存檔的蠟塊，其中外陰鱗癌（VSCC）標(biāo)本30例，外陰硬化性苔蘚（VLS）標(biāo)本20例，外陰正常皮膚標(biāo)本10例。所有患者的病理資料完整，且標(biāo)本均經(jīng)病理學(xué)證實(shí)，在手術(shù)前均未接受過(guò)放化療及激光等物理治療。將外陰鱗癌標(biāo)本作為病例組，外陰硬化性苔蘚標(biāo)本作為疾病對(duì)照組，外陰正常皮膚標(biāo)本作為正常對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)所用到的主要試劑如下：鼠抗人S100A8A9多克隆抗體（工作濃度1:50）與鼠抗人S100A4多克隆抗體（工作濃度1:100），均購(gòu)自美國(guó)SANTACRUZ公司，用于特異性識(shí)別組織中的S100A8A9和S100A4蛋白；即用型SABC試劑盒和DAB顯色劑購(gòu)自北京博奧深生物工程有限公司，SABC試劑盒用于免疫組化染色過(guò)程中信號(hào)的放大，DAB顯色劑則用于使抗原抗體結(jié)合部位顯色，以便于在顯微鏡下觀察。此外，實(shí)驗(yàn)中還用到了蘇木素染液，用于對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行復(fù)染，增強(qiáng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的對(duì)比度，方便后續(xù)的觀察和分析。3.2實(shí)驗(yàn)方法采用SABC免疫組織化學(xué)方法分別檢測(cè)外陰正常組織、外陰硬化性苔蘚及外陰鱗癌中S100A8A9及S100A4的表達(dá)情況。SABC免疫組織化學(xué)方法的原理基于抗原與抗體的特異性結(jié)合，以及生物素-鏈霉親和素系統(tǒng)的信號(hào)放大作用。具體來(lái)說(shuō)，組織切片首先要進(jìn)行預(yù)處理，經(jīng)過(guò)脫脂、脫水等步驟，以去除組織中的雜質(zhì)和水分，使后續(xù)的抗體能夠更好地與抗原結(jié)合。接著進(jìn)行抗原修復(fù)，常用的方法有熱處理、酶解等，目的是恢復(fù)抗原的免疫表位，因?yàn)樵诮M織固定和處理過(guò)程中，抗原表位可能會(huì)被掩蓋，通過(guò)抗原修復(fù)可以提高抗體與抗原的結(jié)合效率。將特異性一抗加入組織樣本中，一抗會(huì)識(shí)別并與目標(biāo)蛋白質(zhì)（即S100A8A9或S100A4）的表位特異性結(jié)合。隨后加入經(jīng)過(guò)生物素化的二抗，二抗能夠識(shí)別并結(jié)合在一抗上，從而形成一抗體-二抗體復(fù)合物。由于生物素與鏈霉親和素之間具有極高的親和力，加入鏈霉親和素后，它會(huì)與復(fù)合物中的生物素化二抗體結(jié)合，形成一抗體-二抗體-鏈霉親和素復(fù)合物。最后，加入標(biāo)記有辣根過(guò)氧化物酶（HRP）等標(biāo)記物的鏈霉親和素，這些標(biāo)記物能夠與鏈霉親和素結(jié)合。當(dāng)加入DAB顯色劑后，HRP會(huì)催化DAB發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生棕色或棕黃色沉淀，從而使抗原抗體結(jié)合部位顯色，便于在顯微鏡下觀察。具體操作步驟如下：脫蠟至水：將組織切片依次放入二甲苯Ⅰ中浸泡20min，二甲苯Ⅱ中浸泡20min，以去除切片中的石蠟；然后依次經(jīng)過(guò)3-8號(hào)酒精各浸泡2min，使切片逐漸水化。自來(lái)水沖洗：用自來(lái)水沖洗切片5min，水流要小，以避免組織切片受損。3%雙氧水修復(fù)內(nèi)源性過(guò)氧化氫酶：將30%的雙氧水按1：9的比例配置成100ml3%雙氧水，將切片浸泡其中，室溫下避光處理30min，以消除組織內(nèi)源性過(guò)氧化氫酶的活性，防止其對(duì)后續(xù)顯色反應(yīng)產(chǎn)生干擾。單蒸水洗與PBS緩沖液洗：用單蒸水沖洗切片5min，重復(fù)2次；再用PBS緩沖液沖洗切片5min，共1次，以去除殘留的雙氧水和雜質(zhì)。熱修復(fù)抗原：將切片浸入0.01M的枸櫞酸鹽緩沖液中，放入微波爐中處理，高火5min，低火20min，然后自然冷卻。通過(guò)熱修復(fù)，可以使抗原表位充分暴露，增強(qiáng)抗原與抗體的結(jié)合能力。PBS緩沖液洗：將冷卻后的切片放入染色缸中，用PBS緩沖液沖洗5min，共1次。封閉：取出切片放入濕盒中，滴加5%BSA封閉液，以蓋滿組織為宜，室溫下孵育30min，封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)，減少背景染色。一抗孵育：甩去封閉液，滴加適量一抗（鼠抗人S100A8A9多克隆抗體或鼠抗人S100A4多克隆抗體），同樣以蓋滿組織為宜；陰性對(duì)照則滴加等量PBS緩沖液，然后將切片放入37℃烘箱中孵育2h，使一抗與目標(biāo)抗原充分結(jié)合。PBS緩沖液洗：將切片放入染色缸中，用PBS緩沖液沖洗5min，重復(fù)3次，以去除未結(jié)合的一抗。二抗孵育：取出切片放入濕盒，滴加生物素化二抗，覆蓋滿組織為宜，室溫下孵育30min，使二抗與一抗結(jié)合，形成免疫復(fù)合物。PBS緩沖液洗：再次將切片放入染色缸中，用PBS緩沖液沖洗5min，重復(fù)3次，去除未結(jié)合的二抗。SABC孵育：將切片放入濕盒中，加入SABC試劑，覆蓋滿組織為宜，室溫下孵育30min，進(jìn)一步放大信號(hào)。PBS緩沖液洗：將切片放入染色缸中，用PBS緩沖液沖洗5min，重復(fù)3次，去除未結(jié)合的SABC試劑。DAB顯色：取粉狀DAB0.02g充分溶于100ml單蒸水中，然后加入100μl雙氧水混勻，倒入染色缸中進(jìn)行顯色，顯色時(shí)間為14-15min，在鏡下控制顯色時(shí)間，當(dāng)目標(biāo)部位出現(xiàn)明顯的棕色或棕黃色沉淀時(shí)，立即終止顯色。中止顯色與水洗：用單蒸水沖洗切片5min，重復(fù)2次，然后用自來(lái)水沖洗5min，以終止顯色反應(yīng)，并去除殘留的DAB試劑。蘇木素復(fù)染：用蘇木素對(duì)切片進(jìn)行復(fù)染2min，使細(xì)胞核著色，便于觀察細(xì)胞結(jié)構(gòu)；然后用自來(lái)水沖洗2min，接著用鹽酸分化5s，以增強(qiáng)細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)的對(duì)比度；最后再用自來(lái)水沖洗10min，去除多余的蘇木素和鹽酸。在免疫組化染色完成后，利用顯微圖象分析系統(tǒng)MetaMorph（UIC/OLUMPUS.US/JP）進(jìn)行積分光密度測(cè)定。積分光密度（IntegratedOpticalDensity，IOD），又稱積分吸光度，是被測(cè)量范圍內(nèi)各像素吸光度的總和，它能夠表述測(cè)量范圍內(nèi)各像素吸光物質(zhì)的總含量，測(cè)量范圍可以是面積或體積。在本實(shí)驗(yàn)中，每張切片選取5個(gè)不同高倍視野，通過(guò)顯微圖象分析系統(tǒng)測(cè)量每個(gè)視野中陽(yáng)性細(xì)胞的積分光密度值，然后計(jì)算同一張切片的平均積分光密度值。通過(guò)對(duì)不同組織切片中S100A8A9和S100A4蛋白表達(dá)的積分光密度值進(jìn)行分析，可以半定量地了解這兩種蛋白在不同組織中的表達(dá)水平差異，從而為后續(xù)的研究提供數(shù)據(jù)支持。3.3數(shù)據(jù)處理利用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。在本研究中，由于主要是比較不同組（外陰正常組織、外陰硬化性苔蘚及外陰鱗癌組）之間S100A8A9和S100A4蛋白表達(dá)的平均積分光密度值，所以采用t檢驗(yàn)中的獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)方法。獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)的前提是樣本來(lái)自的總體應(yīng)服從或近似服從正態(tài)分布，且兩組樣本相互獨(dú)立，兩樣本的總體方差相等。若兩樣本的總體方差不相等時(shí)，采用近似t檢驗(yàn)。在進(jìn)行t檢驗(yàn)之前，首先需要對(duì)樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，以確保數(shù)據(jù)滿足t檢驗(yàn)的前提條件。在SPSS軟件中，可通過(guò)“分析”菜單下的“描述統(tǒng)計(jì)”中的“探索”選項(xiàng)，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，查看數(shù)據(jù)的偏度和峰度值，以及進(jìn)行K-S檢驗(yàn)等方法來(lái)判斷數(shù)據(jù)是否服從正態(tài)分布。若數(shù)據(jù)近似服從正態(tài)分布，則可繼續(xù)進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。在SPSS軟件中，具體操作步驟為：選擇“分析”菜單下的“比較均值”中的“獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)”，在彈出的對(duì)話框中，將平均積分光密度值變量選入“檢驗(yàn)變量”框中，將分組變量（如分為正常對(duì)照組、疾病對(duì)照組、病例組）選入“分組變量”框中，并點(diǎn)擊“定義分組”按鈕，輸入相應(yīng)的組別值進(jìn)行分組定義。在檢驗(yàn)選項(xiàng)中，選擇是否假定方差相等，SPSS會(huì)自動(dòng)生成兩種檢驗(yàn)結(jié)果，一種是“方差齊性假設(shè)成立”時(shí)的T檢驗(yàn)結(jié)果，另一種是“不等方差”情況下的T檢驗(yàn)結(jié)果。通過(guò)t檢驗(yàn)，計(jì)算出t值、自由度（df）以及概率P值。P值反映了樣本數(shù)據(jù)與原假設(shè)（通常是兩組總體均值無(wú)差異）的吻合程度。當(dāng)P值小于0.05時(shí)，認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即拒絕原假設(shè)，表明兩組總體均值存在顯著性差異；當(dāng)P值大于或等于0.05時(shí)，認(rèn)為差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即無(wú)法拒絕原假設(shè)，表明兩組總體均值不存在顯著性差異。在本研究中，通過(guò)t檢驗(yàn)結(jié)果來(lái)判斷S100A8A9和S100A4蛋白在不同組織組中的表達(dá)是否存在顯著差異，從而為后續(xù)探討其與外陰硬化性苔蘚及外陰鱗癌的關(guān)系提供有力的數(shù)據(jù)支持。四、S100A8A9與S100A4表達(dá)結(jié)果4.1S100A8A9表達(dá)情況通過(guò)SABC免疫組織化學(xué)方法對(duì)不同組織標(biāo)本進(jìn)行染色后，在光學(xué)顯微鏡下可觀察到S100A8A9蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，S100A8A9蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞核及細(xì)胞漿，呈棕黃色顆粒。在外陰正常皮膚組織中，陽(yáng)性細(xì)胞多位于基底細(xì)胞層，陽(yáng)性例數(shù)為8例。利用顯微圖象分析系統(tǒng)MetaMorph進(jìn)行積分光密度測(cè)定，得到陽(yáng)性細(xì)胞的平均光密度值為0.79461±2.094。這表明在正常生理狀態(tài)下，S100A8A9在外陰皮膚的基底細(xì)胞層有一定程度的表達(dá)，其可能參與維持基底細(xì)胞的正常生理功能，如細(xì)胞的增殖、分化等過(guò)程。在外陰硬化性苔蘚組織中，陽(yáng)性細(xì)胞位于表皮近全層，陽(yáng)性例數(shù)達(dá)到15例，表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞的平均光密度值為1.62064±1.287。與外陰正常皮膚組織相比，S100A8A9的表達(dá)范圍明顯擴(kuò)大，從基底細(xì)胞層擴(kuò)展至表皮近全層，且平均光密度值顯著升高，經(jīng)t檢驗(yàn)，兩者有顯著性差異（P＜0.05）。這一結(jié)果提示，S100A8A9在外陰硬化性苔蘚的病變過(guò)程中可能發(fā)揮著重要作用。考慮到外陰硬化性苔蘚是一種慢性炎癥性皮膚病，S100A8A9表達(dá)的增加可能與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。前文已提及S100A8A9在炎癥反應(yīng)中扮演著核心角色，其高表達(dá)可能通過(guò)激活相關(guān)信號(hào)通路，如與細(xì)胞膜上的晚期糖基化終產(chǎn)物受體（RAGE）結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路，促使免疫細(xì)胞釋放多種炎癥因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）等，進(jìn)一步放大炎癥反應(yīng)，從而參與外陰硬化性苔蘚的發(fā)病機(jī)制。在外陰鱗癌組織中，癌巢中陽(yáng)性細(xì)胞呈高表達(dá)，陽(yáng)性例數(shù)為21例，S100A8A9蛋白表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞的平均光密度值為2.5358±3.476。與外陰正常皮膚組織相比，S100A8A9的表達(dá)水平顯著升高，經(jīng)t檢驗(yàn)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。這表明S100A8A9在外陰鱗癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中可能起到促進(jìn)作用。有研究表明，S100A8A9的高表達(dá)與腫瘤的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后呈正相關(guān)。在腫瘤細(xì)胞中，S100A8A9可能通過(guò)多種途徑促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和存活。例如，它可以調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，使腫瘤細(xì)胞更快地進(jìn)入細(xì)胞分裂周期，加速腫瘤的生長(zhǎng)；還可能影響腫瘤細(xì)胞的凋亡信號(hào)通路，抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)展。4.2S100A4表達(dá)情況經(jīng)SABC免疫組織化學(xué)染色后，在光學(xué)顯微鏡下觀察可見(jiàn)，S100A4蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞核及細(xì)胞漿，呈現(xiàn)為棕黃色顆粒狀。在外陰正常皮膚組織中，S100A4陽(yáng)性細(xì)胞主要集中于基底細(xì)胞層，陽(yáng)性例數(shù)為8例，同時(shí)間質(zhì)呈現(xiàn)少量陽(yáng)性表達(dá)或者陰性表達(dá)狀態(tài)。通過(guò)顯微圖象分析系統(tǒng)MetaMorph測(cè)定其陽(yáng)性細(xì)胞的平均光密度值為0.30204±1.672。這表明在正常外陰皮膚組織中，S100A4在基底細(xì)胞層有一定程度的表達(dá)，可能參與維持基底細(xì)胞的正常生理功能，如細(xì)胞間的連接、細(xì)胞的增殖與分化調(diào)控等，但在間質(zhì)中的表達(dá)相對(duì)較少，對(duì)間質(zhì)的生理過(guò)程影響較小。在外陰硬化性苔蘚組織中，S100A4陽(yáng)性細(xì)胞分布于表皮全層，陽(yáng)性例數(shù)為14例，而間質(zhì)近陰性表達(dá)。其表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞的平均光密度值為0.3583±1.497。與外陰正常皮膚組織相比，S100A4在陽(yáng)性細(xì)胞的分布范圍上有所擴(kuò)大，從基底細(xì)胞層擴(kuò)展至表皮全層，但平均光密度值經(jīng)t檢驗(yàn)后，兩者無(wú)明顯差異（P＞0.05）。這說(shuō)明雖然S100A4在陽(yáng)性細(xì)胞分布上有變化，但整體表達(dá)水平在正常組織與外陰硬化性苔蘚組織之間并未出現(xiàn)顯著差異，推測(cè)S100A4在外陰硬化性苔蘚的發(fā)病機(jī)制中可能并非起關(guān)鍵作用，或者其作用機(jī)制較為復(fù)雜，不僅僅依賴于表達(dá)量的改變，還可能與蛋白的活性調(diào)節(jié)、與其他分子的相互作用等因素有關(guān)。在外陰鱗癌組織中，癌巢中S100A4呈陰性表達(dá)或僅有極少細(xì)胞陽(yáng)性，陽(yáng)性例數(shù)為19例，然而間質(zhì)細(xì)胞卻呈高表達(dá)狀態(tài)。S100A4蛋白表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞的平均光密度值為0.5310±2.768。與外陰正常皮膚組織相比，S100A4的表達(dá)水平顯著升高，經(jīng)t檢驗(yàn)，存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。這一結(jié)果表明，S100A4在外陰鱗癌間質(zhì)中的高表達(dá)可能在外陰鱗癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。相關(guān)研究指出，S100A4能夠調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的多種生物學(xué)行為。在腫瘤間質(zhì)中，S100A4可能通過(guò)與間質(zhì)細(xì)胞表面的受體結(jié)合，激活相關(guān)信號(hào)通路，促進(jìn)間質(zhì)細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）等，這些因子可以促進(jìn)腫瘤血管生成，為腫瘤細(xì)胞提供充足的營(yíng)養(yǎng)和氧氣供應(yīng)，從而支持腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。同時(shí)，S100A4還可能影響腫瘤間質(zhì)中的細(xì)胞外基質(zhì)成分，改變細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)和組成，使得腫瘤細(xì)胞更容易突破基底膜，侵入周圍組織，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。五、S100A8A9和S100A4表達(dá)的影響5.1對(duì)外陰硬化性苔蘚的影響S100A8A9在炎癥反應(yīng)中扮演著核心角色，其在外陰硬化性苔蘚組織中的高表達(dá)與疾病的慢性炎癥狀態(tài)密切相關(guān)。有研究表明，S100A8A9可能通過(guò)激活轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β激活激酶1（TAK1）和核因子-κB（NF-κB）信號(hào)通路來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在正常生理狀態(tài)下，TAK1和NF-κB信號(hào)通路處于相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)，細(xì)胞凋亡維持在正常水平。然而，當(dāng)外陰硬化性苔蘚發(fā)生時(shí)，S100A8A9表達(dá)上調(diào)，它可以與細(xì)胞膜上的特定受體結(jié)合，如晚期糖基化終產(chǎn)物受體（RAGE），進(jìn)而激活TAK1。激活后的TAK1會(huì)磷酸化并激活下游的IκB激酶（IKK），IKK使抑制性蛋白IκB磷酸化，導(dǎo)致IκB降解，從而釋放出NF-κB。NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核后，與相關(guān)基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，啟動(dòng)一系列促凋亡基因的轉(zhuǎn)錄，促使細(xì)胞凋亡。這一過(guò)程可能導(dǎo)致外陰皮膚組織中細(xì)胞數(shù)量減少，進(jìn)而引起皮膚萎縮、變薄等病理變化，與外陰硬化性苔蘚的臨床癥狀相吻合。S100A8A9還可以通過(guò)參與炎癥反應(yīng)來(lái)調(diào)控纖維細(xì)胞增殖。在炎癥過(guò)程中，免疫細(xì)胞被激活，釋放出多種炎癥因子，如白細(xì)胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等。S100A8A9可以與這些炎癥因子相互作用，進(jìn)一步放大炎癥信號(hào)。一方面，炎癥因子可以刺激成纖維細(xì)胞的增殖，使其合成過(guò)多的細(xì)胞外基質(zhì)成分，如膠原纖維等。過(guò)多的膠原纖維沉積在真皮層，導(dǎo)致真皮淺層膠原纖維玻璃樣變，皮膚彈性下降，出現(xiàn)硬化的表現(xiàn)。另一方面，S100A8A9可能直接作用于成纖維細(xì)胞，調(diào)節(jié)其增殖和分化相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)成纖維細(xì)胞的異常增殖，從而參與外陰硬化性苔蘚的發(fā)展。S100A4在外陰硬化性苔蘚中的具體作用機(jī)制尚未完全明確。雖然從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，其在正常組織與外陰硬化性苔蘚組織中的表達(dá)水平無(wú)明顯差異，但這并不意味著它在疾病中不起作用。有研究推測(cè)，S100A4可能在蛋白的活性調(diào)節(jié)、與其他分子的相互作用等方面發(fā)揮作用。例如，S100A4可能與細(xì)胞內(nèi)的某些蛋白形成復(fù)合物，改變這些蛋白的活性或功能，從而間接影響外陰硬化性苔蘚的發(fā)病過(guò)程。也有可能S100A4的表達(dá)受到其他因素的精細(xì)調(diào)控，在疾病的特定階段或特定微環(huán)境中發(fā)揮作用，只是目前的檢測(cè)方法未能檢測(cè)到其表達(dá)量的顯著變化。此外，S100A4在細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)方面具有重要作用，它可能通過(guò)調(diào)節(jié)外陰皮膚細(xì)胞的骨架結(jié)構(gòu)，影響細(xì)胞的形態(tài)和運(yùn)動(dòng)，進(jìn)而參與外陰硬化性苔蘚的病理過(guò)程。5.2對(duì)外陰鱗癌的影響S100A8A9在外陰鱗癌癌巢中呈高表達(dá)狀態(tài)，這表明其在腫瘤細(xì)胞的增殖過(guò)程中可能發(fā)揮著重要作用。有研究指出，S100A8A9可以通過(guò)激活細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）信號(hào)通路來(lái)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。在正常生理狀態(tài)下，ERK信號(hào)通路處于相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)，細(xì)胞的增殖和分化保持平衡。然而，當(dāng)S100A8A9表達(dá)上調(diào)時(shí)，它可以與細(xì)胞膜上的相關(guān)受體結(jié)合，激活Ras蛋白，進(jìn)而激活下游的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（Raf）。Raf會(huì)磷酸化并激活MEK蛋白，MEK再激活ERK。激活后的ERK會(huì)進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)節(jié)一系列與細(xì)胞增殖相關(guān)基因的表達(dá)，如c-Myc、CyclinD1等，促進(jìn)細(xì)胞周期的進(jìn)程，使腫瘤細(xì)胞更快地進(jìn)入細(xì)胞分裂周期，從而加速腫瘤的生長(zhǎng)。S100A8A9的高表達(dá)還與外陰鱗癌患者的預(yù)后密切相關(guān)。相關(guān)研究表明，S100A8A9表達(dá)水平越高，患者的預(yù)后越差。這可能是因?yàn)镾100A8A9不僅促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，還可能影響腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲能力。例如，S100A8A9可以通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的相互作用，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的遷移能力，使其更容易突破基底膜，侵入周圍組織。同時(shí)，S100A8A9還可能影響腫瘤細(xì)胞的血管生成能力，為腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移提供充足的營(yíng)養(yǎng)和氧氣供應(yīng)，進(jìn)一步惡化患者的病情。S100A4在腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在腫瘤間質(zhì)中，S100A4呈高表達(dá)狀態(tài)，它可以通過(guò)多種途徑促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。一方面，S100A4可以調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的重構(gòu)，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力。研究表明，S100A4可以與肌動(dòng)蛋白等細(xì)胞骨架蛋白相互作用，改變細(xì)胞骨架的排列和結(jié)構(gòu)，使腫瘤細(xì)胞的偽足形成增多，從而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力。另一方面，S100A4可以促進(jìn)腫瘤血管生成。它可以刺激間質(zhì)細(xì)胞分泌血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）等血管生成因子，這些因子能夠誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和管腔形成，促進(jìn)腫瘤血管的生成，為腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移提供必要的營(yíng)養(yǎng)和氧氣支持。S100A4還可能參與腫瘤的免疫逃逸過(guò)程。腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制之一，它使得腫瘤細(xì)胞能夠逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)的監(jiān)視和攻擊。有研究發(fā)現(xiàn)，S100A4可以抑制免疫細(xì)胞的活性，如T淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）等。S100A4可以通過(guò)與免疫細(xì)胞表面的受體結(jié)合，干擾免疫細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)通路，抑制免疫細(xì)胞的增殖、活化和細(xì)胞毒性作用，從而降低機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫監(jiān)視和清除能力，使腫瘤細(xì)胞能夠在體內(nèi)得以生存和發(fā)展。六、研究結(jié)論與展望6.1研究結(jié)論總結(jié)本研究通過(guò)SABC免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)S100A8A9和S100A4在外陰正常組織、外陰硬化性苔蘚及外陰鱗癌中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)S100A8A9和S100A4在這三種組織中的表達(dá)呈現(xiàn)出不同的規(guī)律，且與外陰硬化性苔蘚及外陰鱗癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。S100A8A9蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞核及細(xì)胞漿，呈棕黃色顆粒。在外陰正常皮膚組織中，陽(yáng)性細(xì)胞多位于基底細(xì)胞層；而在外陰硬化性苔蘚組織中，陽(yáng)性細(xì)胞位于表皮近全層，表達(dá)范圍明顯擴(kuò)大，且平均光密度值顯著升高，與外陰正常皮膚組織相比有顯著性差異（P＜0.05），表明S100A8A9可能參與了外陰硬化性苔蘚的病變過(guò)程。這一結(jié)果與相關(guān)研究中提到的S100A8A9在炎癥反應(yīng)中扮演核心角色相呼應(yīng)，其高表達(dá)可能通過(guò)激活相關(guān)信號(hào)通路，如與細(xì)胞膜上的晚期糖基化終產(chǎn)物受體（RAGE）結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路，促使免疫細(xì)胞釋放多種炎癥因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）等，進(jìn)一步放大炎癥反應(yīng)，從而參與外陰硬化性苔蘚的發(fā)病機(jī)制。在外陰鱗癌組織中，癌巢中陽(yáng)性細(xì)胞呈高表達(dá)，與外陰正常皮膚組織相比，表達(dá)水平顯著升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），說(shuō)明S100A8A9在外陰鱗癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中可能起到促進(jìn)作用，可能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，使腫瘤細(xì)胞更快地進(jìn)入細(xì)胞分裂周期，加速腫瘤的生長(zhǎng)，還可能影響腫瘤細(xì)胞的凋亡信號(hào)通路，抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)展。S100A4蛋白同樣表達(dá)于細(xì)胞核及細(xì)胞漿，呈棕黃色顆粒。在外陰正常皮膚組織中，陽(yáng)性細(xì)胞主要集中于基底細(xì)胞層，間質(zhì)呈現(xiàn)少量陽(yáng)性表達(dá)或者陰性表達(dá)狀態(tài)；在外陰硬化性苔蘚組織中，陽(yáng)性細(xì)胞分布于表皮全層，但平均光密度值與外陰正常皮膚組織相比無(wú)明顯差異（P＞0.05），推測(cè)S100A4在外陰硬化性苔蘚的發(fā)病機(jī)制中可能并非起關(guān)鍵作用，或者其作用機(jī)制較為復(fù)雜，不僅僅依賴于表達(dá)量的改變。在外陰鱗癌組織中，癌巢中S100A4呈陰性表達(dá)或僅有極少細(xì)胞陽(yáng)性，然而間質(zhì)細(xì)胞卻呈高表達(dá)狀態(tài)，與外陰正常皮膚組織相比，表達(dá)水平顯著升高，存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），表明S100A4在外陰鱗癌間質(zhì)中的高表達(dá)可能在外陰鱗癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，可能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的重構(gòu)，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力，促進(jìn)腫瘤血管生成，以及參與腫瘤的免疫逃逸過(guò)程等多種途徑，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。綜上所述，S100A8A9和S100A4在外陰硬化性苔蘚及外陰鱗癌中的表達(dá)異常升高，這兩種蛋白在疾病的發(fā)展機(jī)制中發(fā)揮著重要的作用。S100A8A9可能是外陰硬化性苔蘚及外陰鱗癌的重要分子標(biāo)志物，其表達(dá)水平與腫瘤的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后呈正相關(guān)。高表達(dá)的S100A4能夠增強(qiáng)外陰鱗癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，并且對(duì)外陰鱗癌患者的預(yù)后也有著重要的影響。本研究結(jié)果為外陰硬化性苔蘚及外陰鱗癌的診治提供了重要的參考價(jià)值，為這兩種疾病的分子治療和預(yù)后評(píng)估提供了新的思路和方向。6.2研究的局限性本研究雖然取得了一定的成果，為外陰硬化性苔蘚及外陰鱗癌的研究提供了新的思路和方向，但仍存在一些局限性。在樣本數(shù)量方面，本研究?jī)H選取了30例外陰鱗癌標(biāo)本、20例外陰硬化性苔蘚標(biāo)本以及10例外陰正常皮膚標(biāo)本。相對(duì)較小的樣本量可能無(wú)法全面、準(zhǔn)確地反映S100A8A9和S100A4在不同個(gè)體、不同疾病階段的表達(dá)差異和作用機(jī)制。不同個(gè)體之間存在遺傳背景、生活環(huán)境、基礎(chǔ)疾病等多方面的差異，這些因素都可能影響S100A8A9和S100A4的表達(dá)。較小的樣本量可能會(huì)掩蓋這些個(gè)體差異對(duì)研究結(jié)果的影響，導(dǎo)致研究結(jié)果的代表性不足。此外，外陰硬化性苔蘚和外陰鱗癌的疾病進(jìn)程較為復(fù)雜，不同階段的病理特征和分子機(jī)制可能存在差異。有限的樣本量難以涵蓋疾病的各個(gè)階段，從而無(wú)法深入探討S100A8A9和S100A4在疾病發(fā)展過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化和作用。在研究方法上，本研究主要采用SABC免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)S100A8A9和S100A4的表達(dá)情況。這種方法雖然能夠直觀地觀察到蛋白在組織中的定位和表達(dá)水平，但只能提供半定量的結(jié)果，無(wú)法精確地測(cè)定蛋白的含量。而且免疫組織化學(xué)方法的結(jié)果可能受到多種因素的影響，如抗體的特異性和親和力、組織切片的質(zhì)量、染色過(guò)程中的操作誤差等，這些因素都可能導(dǎo)致結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性受到一定程度的影響。同時(shí)，本研究?jī)H從蛋白表達(dá)水平進(jìn)行分析，未進(jìn)一步從基因水平，如通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR等技術(shù)檢測(cè)相關(guān)基因的表達(dá)情況，也未研究蛋白的活性變化以及與其他蛋白之間的相互作用關(guān)系。基因水平的研究可以更深入地了解S100A8A9和S100A4表達(dá)調(diào)控的機(jī)制，而蛋白相互作用關(guān)系的研究則有助于揭示它們?cè)诩膊“l(fā)生發(fā)展過(guò)程中的具體作用途徑。針對(duì)以上局限性，未來(lái)的研究可以從以下幾個(gè)方面進(jìn)行改進(jìn)。首先，擴(kuò)大樣本量，收集來(lái)自不同地區(qū)、不同年齡段、不同臨床特征的患者標(biāo)本，以增強(qiáng)研究結(jié)果的代表性和可靠性。通過(guò)多中心合作的方式，可以更廣泛地獲取樣本，從而更好地分析個(gè)體差異和疾病階段對(duì)S100A8A9和S100A4表達(dá)及功能的影響。其次，綜合運(yùn)用多種研究方法，如在免疫組織化學(xué)的基礎(chǔ)上，結(jié)合實(shí)時(shí)熒光定量PCR、蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）等技術(shù)，從基因和蛋白水平全面分析S100A8A9和S100A4的表達(dá)情況。同時(shí)，利用蛋白質(zhì)組學(xué)、免疫共沉淀等技術(shù)深入研究它們與其他蛋白之間的相互作用關(guān)系，進(jìn)一步揭示其在疾病發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制。此外，還可以建立動(dòng)物模型，模擬外陰硬化性苔蘚及外陰鱗癌的發(fā)病過(guò)程，在體內(nèi)環(huán)境下研究S100A8A9和S100A4的功能，為疾病的防治提供更有力的理論支持。6.3未來(lái)研究方向基于本研究及當(dāng)前領(lǐng)域的研究現(xiàn)狀，未來(lái)針對(duì)S100A8A9和S100A4在外