生物藥物分析與檢查氨基酸多肽和蛋白質類藥物檢查基本規定：掌握氨基酸定性鑒別的措施，熟悉氨基酸特殊雜質及安全性檢查，掌握氨基酸含量測定措施，掌握多肽因子類藥物的定性鑒別措施，熟悉多肽因子類藥物的檢查措施，掌握多肽因子類藥物生物效價的測定措施，掌握蛋白質類藥物的鑒別和檢查措施，掌握蛋白質含量測定和效價測定措施，理解幾種氨基酸、多肽因子和蛋白質藥物的質量分析過程。基本內容第一節氨基酸類藥物檢查第二節多肽因子類和蛋白質類藥物檢查第三節幾種氨基酸、多肽和蛋白質藥物的質量分析第一節氨基酸類藥物檢查氨基酸是治療蛋白質代謝紊亂、蛋白質缺損所引起的一系列疾病的重要生化藥物，也是具有高度營養價值的蛋白質補充劑，有著廣泛的生化作用和臨床療效。目前氨基酸及其衍生物臨床應用不停發展和擴大，創制了某些新的生化藥物。如甲基酪氨酸治療嗜鉻細胞瘤氧苯丙氨酸用于類癌瘤綜合征偶氮絲氨酸治療白血病乙酰羥脯氨酸用于治療類風濕關節炎第一節氨基酸類藥物檢查氨基酸為白色晶狀體，熔點很高，多在熔融時分解，都能溶解在強酸強堿中，形成的鹽多能溶于水。氨基酸在等電點（pI）時溶解度最小，最穩定。中性pI值在5～6.3左右。酸性pI值在2.8～3.2左右。堿性氨基酸的pI值在7.6～10.8左右。第一節氨基酸類藥物檢查一、氨基酸的定性鑒別旋光度、熔點、溶解度、紙層析、氨基酸自動化分析、氣相色譜等均可作為氨基酸鑒別的根據。1、化學鑒別法氨基酸的鑒別最常用的措施是根據所有氨基酸均能與茚三酮顯藍紫色。采用茚三酮顯色法，中國藥典（）二部對所收載的氨基酸類藥物大多采用此措施進行鑒別。第一節氨基酸類藥物檢查茚三酮反應：茚三酮在酸性溶液中與α-氨基酸共熱，引起氨基酸氧化脫氫、脫羧反應，最終生成紫色物質。第一節氨基酸類藥物檢查2、光譜鑒別法（1）紫外吸取光譜法在20種天然氨基酸中，只有酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸在紫外區有最大吸取。酪氨酸的max＝275nm苯丙氨酸的max＝257nm色氨酸的max＝280nm1：酪氨酸2：色氨酸3：苯丙氨酸。第一節氨基酸類藥物檢查這三種氨基酸可以通過紫外吸取光譜加以鑒別。精密稱取酪氨酸、色氨酸、苯丙氫酸各適量。用水制成每1mL含20μg（色氨酸）、40μg（酪氨酸）、200μg（苯丙氨酸）。在波長230～300nm測定各氨基酸的吸取光譜，如右圖。第一節氨基酸類藥物檢查（2）紅外吸取光譜圖氨基酸在紅外區均有特性圖譜，可以通過與原則氨基酸圖譜比較作為氨基酸的鑒別根據。所得的吸取圖譜各重要吸取峰波長和各吸取峰間的互相強度關系均應與對照的圖譜一致。第一節氨基酸類藥物檢查3、薄層色譜鑒別法在薄層板上點樣，通過與原則氨基酸對照而鑒別氨基酸。（1）薄層板的制備第一節氨基酸類藥物檢查（2）十一種氨基酸混合液（色、蛋、亮、異亮、甘、賴、蘇、纈、苯丙、組、精）與對照液的制備。第一節氨基酸類藥物檢查（3）點樣、展開和顯色

吸取混合液和對照液各3μL，分別點于同一薄層板上。以正丁醇-水-異丁酸-醋酸（50︰50︰5︰7）之上層作展開劑，進行單向三次展開，展開約15cm，每次必須待溶劑揮發盡后，再進行下一次展開。噴以顯色劑（吲哚醌1g，溶于100mL無水乙醇和10mL冰醋酸中）置100℃干燥5～10min至顯色完全為止。第一節氨基酸類藥物檢查本層析系統中，由于分離的程度與多種氨基酸顯出不一樣的顏色，可以區別十一種氨基酸。用茚三酮-硝酸鈉試劑亦能顯出不一樣顏色的色斑，且敏捷度較高。第一節氨基酸類藥物檢查4、旋光性除甘氨酸外，所有的天然氨基酸均有旋光性，且每種氨基酸的比旋度不一樣，因此，可以用比旋度作為氨基酸藥物的鑒別指標。第一節氨基酸類藥物檢查二、氨基酸特殊雜質及安全性檢查1、特殊雜質檢查氨基酸原料藥所具有的特殊雜質一般為某些其他種類的氨基酸。用薄層色譜法進行限量檢查：將樣品配成一定濃度的供試品液，取一定量供試品液稀釋后作為對照液，在同一硅膠G薄板上，一般用正丁醇︰水︰冰醋酸（3︰1︰1）展開晾干后，噴茚三酮的丙酮溶液顯色，規定供試品所顯雜質斑點的顏色不得深于對照液主斑點，以此限制其他氨基酸的含量。第一節氨基酸類藥物檢查2、安全性檢查影響氨基酸安全用藥的原因除其中的一般雜質，重要為熱原的含量。中國藥典所收載的氨基酸基本上都規定了熱原檢查。采用家兔法，將一定劑量的供試品，靜脈注入家兔體內，在規定期間內觀測家兔體溫升高的狀況，以鑒定供試品中所含熱原的程度與否符合規定。第一節氨基酸類藥物檢查三、氨基酸含量測定1、茚三酮法茚三酮法是氨基酸定量測定應用最廣泛的措施之一。當茚三酮在酸性條件下和氨基酸反應時，氨基酸被氧化分解生成醛，放出氨和二氧化碳，水合茚三酮則成還原型水合茚三酮。然后還原型茚三酮與氨，另一分子茚三酮深入縮合生成藍紫色物，最大吸取值的波長為570nm。茚三酮反應為一切α-氨基酸所共有，反應敏捷，根據反應所生成的藍紫色深淺，可以測定氨基酸含量。本法可容許的測定范圍是0.5～50μg氨基酸。第一節氨基酸類藥物檢查2、酸堿滴定法谷氨酸、天冬氨酸和賴氨酸賴氨酸（lysine）片中賴氨酸的測定取本品20片，精密稱定，研細，精密稱取適量（約相稱于賴氨酸0.15g）置燒杯中，加水25mL，滴加氫氧化鈉滴定液（0.1mol/L），用酸度計調整至pH值為7.0，加入預先調整至pH值9.0的甲醛溶液15mL，攪勻，再用氫氧化鈉滴定液（0.1mol/L）滴定至pH值為9.0，并持續30s。按加入甲醛液后所耗用氫氧化鈉滴定液（0.1mol/L）體積計算，每毫升氫氧化鈉滴定液（0.1mol/L）相稱于9.132mg的C6H14N2O2·HCl。第一節氨基酸類藥物檢查3、非水溶液滴定法中國藥典、美國藥典和英國藥典對所收載氨基酸類藥物，除谷氨酸用氫氧化鈉為原則溶液的酸堿滴定法，其他均根據其構造特性，采用了非水酸堿滴定法。用冰醋酸作溶劑，高氯酸作原則溶液滴定，電位法或指示劑法確定終點。合用于常量氨基酸的含量測定。第一節氨基酸類藥物檢查4、定氮法精氨酸和天冬酰胺的原料及其制劑可以采用定氮法測定含量。將被測藥物置于凱式燒瓶中，加濃硫酸、硫酸鹽及適量的催化劑，加熱進行有機物的破壞，其中所含的氮完全轉化為氨，再與硫酸結合成硫酸銨，硫酸銨與強堿反應，放出氨，將其蒸出，吸取于定量酸溶液，酸堿滴定法滴定，從而計算出氮的含量并換算成被測藥物的含量。第一節氨基酸類藥物檢查5、HPLC對于多種復方氨基酸制劑中氨基酸的含量測定，目前較多地采用了高效液相色譜法（HPLC）。因大多數氨基酸沒有紫外吸取，不能用紫外檢測器測定。為改善被測物的檢測特性，提高檢測敏捷度，需進行化學衍生化。衍生方式包括柱后衍生法和柱前衍生法。柱后衍生法是將樣品經離子互換柱分離后進行衍生；柱前衍生法是將樣品制成合適的衍生物再進行HPLC分離。第二節多肽因子類和蛋白質類藥物檢查蛋白質和多肽因子是生物體內廣泛存在的生化物質，具多種生理功能，是一大類非常重要的生化藥物。多肽因子類藥物指分子量不算太大的，在體內含量極微，但卻發揮極大生理作用的一類生物活性物質。其中包括天然動物體內提取的藥物如干擾素、白細胞介素、胸腺肽、轉移因子等和通過現代基因工程技術生產的藥物如重組人干擾素、重組白細胞介素、重組乙肝疫苗等。第二節多肽因子類和蛋白質類藥物檢查一、多肽因子類藥物的定性鑒別基因重組多肽因子類藥物的鑒別重要采用SDS法和免疫印跡法。1、SDS法用SDS鑒別生物樣品必須是該品有極純的原則對照品，通過電泳成果的對比，確定所測樣品與否與原則品有相似的遷移率，從而鑒別該品。缺陷：必須有原則品；凝膠中多肽需保留生物活性，或可以復性，或電泳前可將檢測配基與待測多肽共價交聯。第二節多肽因子類和蛋白質類藥物檢查2、蛋白質免疫印跡電泳法（轉移電泳、westernblot）原理：借助聚丙烯酰胺凝膠技術，將生物活性物質高效分離，分離后的樣品可以原位、定量驅動或吸印在另一種固相載體（一般用醋酸纖維素薄膜，簡稱NC膜）上，能保持原有的生物活性，可以進行多種生物檢測、免疫識別、掃描、積分和保留。第二節多肽因子類和蛋白質類藥物檢查（1）基本操作分3個部分：聚丙烯酰胺凝膠電泳；轉移電泳（即將凝膠中的多肽條帶轉移到硝酸纖維素紙上）；檢測或鑒定薄膜上的多肽條帶。①聚丙烯酰胺凝膠電泳先將待分離樣品進行凝膠電泳分離。凝膠可用瓊脂糖凝膠，也可用聚丙烯酰胺凝膠，可以是均一的，也可用梯度凝膠，凝膠緩沖體系中可具有多種變性劑，如SDS、LDS、尿素等，可進行單向或雙向電泳，也可用等電聚焦電泳。第二節多肽因子類和蛋白質類藥物檢查②轉移電泳將濕醋酸纖維素（NC）薄膜緊貼凝膠，凝膠與薄膜之間不能有氣泡，否則在氣泡所在部位的條帶將不能轉移，在NC膜和凝膠的另一側放上兩層濕濾紙，也不能有氣泡，再在兩邊貼上海綿，最終用塑料網框架夾緊，插入電泳槽，根據凝膠中樣品所帶電荷的性質，決定有NC膜的一邊是靠近正極還是靠近負極一側。電泳條件取決于凝膠類型、轉移裝置和蛋白質自身性質等。一般采用低電壓和低電流（2mA/cm2以內）。緩沖液中一般具有20％的甲醇或乙醇，其作用重要是保持凝膠的幾何形狀。第二節多肽因子類和蛋白質類藥物檢查③檢測或鑒定NC膜借助非共價鍵吸附蛋白質，經轉移后蛋白質條帶就固定在NC膜上，完全保留凝膠中的蛋白譜，可直接用考馬斯亮藍、氨基黑10B等染色。假如運用蛋白質生物活性，或用蛋白質生物探針來檢測，就要先用1％～3％的牛血清蛋白或血紅蛋白，或非離子去垢劑（0.3％吐溫-20）等處理NC紙，以封閉NC紙上未吸附蛋白質區域，使其不再能吸附蛋白質。使用非離子去垢劑比較經濟，但有也許把NC紙上的某些蛋白質洗掉，同步還要將NC紙反復洗滌以清除變性劑，第二節多肽因子類和蛋白質類藥物檢查二、多肽因子類藥物的檢查1、分子量檢查常用還原型SDS法檢查分子量，用量約1μg。也可采用凝膠過濾法，例如Sephadecx系列（G-75，-100）；waters1～60，125，250；BackmanTSKSW，3000SW，4000SW。凝膠過濾是測定完整蛋白質分子的分子量，而SDS是測定蛋白質亞基的分子量，同步用這二種措施測定同一蛋白質的分子量，可以以便地判斷樣品蛋白質與否是寡聚蛋白質。第二節多肽因子類和蛋白質類藥物檢查2、等電點測定等電點是蛋白質的物理化學常數，它表達蛋白質的帶電性質。一般采用凝膠等電聚焦電泳技術測定等電點。3、紫外吸取不一樣的蛋白質分子均有其特定的紫外吸取，對于某種蛋白質或多肽來說，它的最大吸取波長是固定的。紫外吸取光譜是檢查蛋白質的一種重要指標。第二節多肽因子類和蛋白質類藥物檢查4、純度基因工程產品蛋白質純度是一項重要指標，但它也是一項相對的指標，需根據實際規定而定。蛋白質純度一般是指與否具有其他雜蛋白，而不包括鹽、緩沖液離子、SDS等小分子在內。目前較常用的是HPLC法（包括凝膠過濾、多種反相HPLC、離子色譜、疏水色譜等）、非還原SDS凝膠電泳法、毛細管電泳法（CE）、等電聚焦電泳，此外也應用某些化學措施，觀測末端與否均一。第二節多肽因子類和蛋白質類藥物檢查至少應用兩種以上的措施，并且是兩種不一樣分離機理的措施來鑒定蛋白質的純度才比較可靠。常發現某同樣品在凝膠過濾中是純的，而在離子色譜中卻辨別為二個組分，反之亦然。又如一種樣品用凝膠過濾法和SDS電泳證明是純的，但這仍不充足，由于這兩者機理相似。第二節多肽因子類和蛋白質類藥物檢查三、蛋白質類藥物的鑒別和檢查1、蛋白質類藥物的鑒別蛋白質類藥物可根據其各自的物理、化學性質、生理作用等采用不一樣的措施進行鑒別。（1）茚三酮反應構成蛋白質的氨基酸都能與茚三酮反應生成紫色化合物，因此蛋白質也有此反應，這是蛋白質鑒別的最常用措施。（2）福林酚反應或雙縮脲反應這兩種常用來測定蛋白質的含量，但有時也用于蛋白質的鑒別。（3）紫外吸取由于構成蛋白質的氨基酸中，酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸在紫外區的光吸取特性，因此可運用此種特性鑒別蛋白質。第二節多肽因子類和蛋白質類藥物檢查五、蛋白質含量測定和效價測定1、蛋白質含量測定蛋白質的定量可用化學措施如凱氏定氮法、雙縮脲法、福林酚法、紫外光吸取法來測定；也可用染色法，如氨基黑、考馬斯亮藍測定；此外還可用熒光激發、氯胺T、放射性核素計數等敏捷度較高措施。上述措施中凱氏定氮法、福林酚法、紫外光吸取法最為常用，它們操作簡樸、設備廉價。第二節多肽因子類和蛋白質類藥物檢查（1）凱氏定氮法凱氏定氮法常用來測定有機物的含氮量。①原理：A、含氮有機物的消化當含氮有機物與硫酸共熱時，分解出氮、二氧化碳、水。氮轉變出的氨與硫酸化合生成硫酸銨。分解反應進行得很慢，可加入硫酸銅及硫酸鉀或硫酸鈉增進反應，其中硫酸銅為催化劑，硫酸鉀或硫酸鈉可提高沸點。過氧化氫也能加速反應。第二節多肽因子類和蛋白質類藥物檢查B、銨離子的生成消化完了后來，在凱氏定氮瓶中加入強堿（氫氧化鈉溶液）消化液，使硫酸銨分解，放出氨。用水蒸汽蒸餾法，將氨蒸入過量的硼酸溶液中，氨與溶液中的氫離子結合，生成銨離子，使溶液中氫離子濃度減少。C、測定用強酸滴定，直至恢復溶液中本來的氫離子濃度為止。所用強酸的摩爾數即相稱于被測樣品中氨的摩爾數。第二節多肽因子類和蛋白質類藥物檢查（2）紫外吸取法①280nm光吸取法由于蛋白質中酪氨酸和色氨酸殘基的苯環具有共軛雙鍵，因此蛋白質在275～280nm波長處有一種紫外吸取高峰，在一定范圍內，蛋白質溶液在280nm波長處的光吸取度值（A280）與其濃度成正比，因此可作定量測定。該法測定范圍為0.01～0.1mg/mL。該法簡樸、敏捷、迅速、不消耗樣品，低濃度的鹽類不干擾測定，因此在蛋白質和酶的生化制備中廣泛應用。第二節多肽因子類和蛋白質類藥物檢查②280nm和260nm光吸取差法若樣品中具有嘌呤、嘧啶等核酸類吸取紫外光的物質，在用來測定蛋白質濃度時，會有較大的干擾。由于核酸在260nm波長處的光吸取比280nm波長處更強，因此可運用280nm和260nm的吸取差來計算蛋白質濃度。常用下列經驗公式估算：蛋白質濃度（mg/mL）=1.45A280－0.74A260（假設1mg/mL蛋白質溶液的A280為1.0）第二節多肽因子類和蛋白質類藥物檢查（3）考馬斯亮藍G-250染色法考馬斯亮藍G-250在酸性溶液中為棕紅色，當它與蛋白質通過疏水作用結合后變為藍色，可在595nm波長處進行比色測定。該法反應快、操作簡便、消耗樣品少，但不一樣蛋白質之間差異較大，且原則曲線線性較差。測定范圍為0.01～1.0mg/mL蛋白質。高濃度的Tris、EDTA、尿素、甘油、蔗糖、丙酮、硫酸銨、去垢劑對測定有干擾，緩沖液濃度過高或變化測定液的pH也會影響顯色。第二節多肽因子類和蛋白質類藥物檢查A、溶液的配制原則蛋白質溶液0.1或1.0mg/mL牛血清白蛋白。染色液稱取100mg考馬斯亮藍G-250溶解于50mL95％乙醇中，加100mL85％的磷酸，加水稀釋到1000mL。該染色液可保留數月。若不加水可長期保留，臨用前再稀釋。B、原則曲線在試管中分別加原則蛋白質溶液0、6、12、24、36、48、60μL，用水補足至60μL，加3mL染色液，