Wnt2b信號軸在肝細胞癌相關巨噬細胞極化中的作用與機制探究一、引言1.1研究背景肝細胞癌（HCC）作為原發性肝癌的主要病理類型，是全球范圍內嚴重威脅人類健康的重大疾病。據統計，全球每年新增HCC患者數量眾多，其發病率和病死率均位居惡性腫瘤前列，嚴重影響患者的生活質量和生存預期。在中國，HCC同樣是高發的惡性腫瘤之一，由于乙肝病毒（HBV）感染率較高等因素，使得HCC的防治形勢更為嚴峻。目前，針對HCC的治療手段包括手術切除、肝移植、消融、經動脈栓塞化療以及系統治療等。然而，由于多數患者確診時已處于中晚期，且常伴有肝硬化等基礎疾病，導致僅有少數患者適合進行根治性治療，總體治療效果仍不理想，患者的5年生存率較低。因此，深入研究HCC的發病機制，尋找新的治療靶點和策略具有重要的臨床意義。腫瘤微環境（TME）在HCC的發生、發展、侵襲和轉移過程中起著關鍵作用。腫瘤相關巨噬細胞（TAMs）作為TME的重要組成部分，具有高度的可塑性和功能異質性。根據其活化狀態和功能特點，TAMs可分為經典活化的M1型巨噬細胞和替代活化的M2型巨噬細胞。M1型巨噬細胞具有較強的促炎和抗腫瘤活性，能夠分泌大量的促炎細胞因子和趨化因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-12（IL-12）等，通過激活免疫細胞、殺傷腫瘤細胞等方式發揮抗腫瘤作用。而M2型巨噬細胞則主要表現出抗炎和促腫瘤特性，可分泌免疫抑制性細胞因子，如白細胞介素-10（IL-10）、轉化生長因子-β（TGF-β）等，促進腫瘤細胞的增殖、侵襲、轉移以及血管生成，同時抑制機體的抗腫瘤免疫反應。在HCC微環境中，TAMs通常向M2型極化，這種極化狀態的失衡與HCC的不良預后密切相關。因此，調控TAMs的極化方向，促使其從M2型向M1型轉化，有望成為治療HCC的新策略。Wnt信號通路是一條在胚胎發育、細胞增殖、分化和組織穩態維持等過程中發揮重要作用的信號轉導途徑。Wnt2b作為Wnt家族的重要成員，在多種腫瘤的發生發展中扮演著關鍵角色。已有研究表明，Wnt2b在HCC組織中呈現高表達，并且與HCC的腫瘤大小、TNM分期、血管侵犯等臨床病理特征密切相關。Wnt2b可通過激活經典的Wnt/β-catenin信號通路，促進HCC細胞的增殖、遷移和侵襲，抑制細胞凋亡。此外，Wnt2b還能夠調節腫瘤微環境中的免疫細胞功能，影響腫瘤的免疫逃逸。然而，Wnt2b對HCC相關巨噬細胞極化的影響及具體機制尚未完全明確。綜上所述，深入探討Wnt2b對HCC相關巨噬細胞極化的影響及機制，不僅有助于揭示HCC的發病機制，還可能為HCC的免疫治療提供新的靶點和策略，具有重要的理論意義和臨床應用價值。1.2研究目的與意義本研究旨在深入探究Wnt2b對HCC相關巨噬細胞極化的影響及具體分子機制，為揭示HCC的發病機制提供新的理論依據，并為HCC的治療提供潛在的新靶點和策略。具體研究目的如下：明確Wnt2b對HCC相關巨噬細胞極化的影響：通過體內外實驗，觀察Wnt2b表達改變對巨噬細胞向M1型或M2型極化的影響，確定Wnt2b在HCC相關巨噬細胞極化過程中的作用方向。揭示Wnt2b調控HCC相關巨噬細胞極化的分子機制：深入研究Wnt2b激活的信號通路及其下游分子，探討其如何影響巨噬細胞極化相關基因的表達和信號轉導，闡明Wnt2b調控巨噬細胞極化的分子機制。評估Wnt2b作為HCC治療靶點的潛力：通過干預Wnt2b信號通路，觀察對HCC細胞生長、侵襲、轉移以及腫瘤微環境免疫狀態的影響，評估Wnt2b作為HCC治療靶點的可行性和有效性。肝細胞癌嚴重威脅人類健康，現有治療手段存在局限性，深入研究其發病機制和尋找新治療靶點迫在眉睫。腫瘤相關巨噬細胞在腫瘤微環境中扮演重要角色，其極化狀態對腫瘤發展有顯著影響。Wnt2b在HCC中高表達，且與腫瘤惡性程度相關，但對HCC相關巨噬細胞極化的影響及機制尚不明確。本研究具有重要的理論意義和臨床應用價值，在理論意義層面，有助于揭示HCC發生發展的分子機制，完善對腫瘤微環境中細胞間相互作用的認識，為后續研究提供理論基礎；在臨床應用價值層面，若能明確Wnt2b對HCC相關巨噬細胞極化的影響及機制，有望為HCC的治療提供新的靶點和策略，提高治療效果，改善患者預后。通過調控Wnt2b信號通路，可能實現對腫瘤相關巨噬細胞極化的調控，從而重塑腫瘤微環境，增強機體抗腫瘤免疫反應，為HCC的治療開辟新的途徑。1.3研究方法與技術路線1.3.1細胞實驗細胞培養：培養人肝癌細胞系（如HepG2、Huh7等）和巨噬細胞系（如RAW264.7），以及原代分離的人肝癌組織來源的巨噬細胞和正常肝組織來源的巨噬細胞。使用含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養基或RPMI1640培養基，在37℃、5%CO?的培養箱中進行常規培養。條件培養基制備：收集肝癌細胞培養上清，經過濾除菌后得到肝癌細胞條件培養基（HCC-TCM），用于后續對巨噬細胞的刺激實驗。細胞轉染：采用脂質體轉染法或電穿孔法，將針對Wnt2b的小干擾RNA（si-Wnt2b）或過表達質粒（pcDNA3.1-Wnt2b）轉染至巨噬細胞中，以敲低或過表達Wnt2b基因。轉染后48-72小時，通過實時熒光定量PCR（qRT-PCR）和蛋白質免疫印跡（Westernblot）檢測轉染效率。巨噬細胞極化誘導：將巨噬細胞分為對照組、M1極化誘導組（用IFN-γ和LPS刺激）、M2極化誘導組（用IL-4和IL-13刺激）以及HCC-TCM處理組。在不同處理條件下培養巨噬細胞，觀察其極化狀態的變化。細胞功能檢測：細胞增殖檢測：采用CCK-8法或EdU摻入法，檢測不同極化狀態的巨噬細胞對肝癌細胞增殖的影響。將巨噬細胞與肝癌細胞以不同比例共培養，一定時間后加入CCK-8試劑或EdU試劑，按照試劑盒說明書操作，通過酶標儀檢測吸光度或熒光顯微鏡觀察EdU陽性細胞數，計算細胞增殖率。細胞遷移和侵襲檢測：利用Transwell小室實驗，檢測巨噬細胞對肝癌細胞遷移和侵襲能力的影響。在上室接種肝癌細胞，下室加入不同極化狀態的巨噬細胞培養上清或共培養巨噬細胞，培養一定時間后，固定并染色遷移或侵襲到下室的肝癌細胞，在顯微鏡下計數。細胞因子分泌檢測：收集巨噬細胞培養上清，采用酶聯免疫吸附測定（ELISA）法檢測M1型巨噬細胞相關細胞因子（如TNF-α、IL-12等）和M2型巨噬細胞相關細胞因子（如IL-10、TGF-β等）的分泌水平，按照ELISA試劑盒說明書進行操作。1.3.2動物實驗動物模型建立：選用6-8周齡的BALB/c裸鼠或C57BL/6小鼠，通過皮下注射肝癌細胞（如HepG2細胞）建立肝癌皮下移植瘤模型；或通過原位注射肝癌細胞至小鼠肝臟，建立肝癌原位模型。實驗分組：將荷瘤小鼠隨機分為對照組、si-Wnt2b處理組、pcDNA3.1-Wnt2b處理組等，每組8-10只。對照組給予生理鹽水或空載體處理，si-Wnt2b處理組通過瘤內注射或尾靜脈注射si-Wnt2b脂質體復合物，pcDNA3.1-Wnt2b處理組注射相應的過表達質粒復合物。樣本采集：在處理后的不同時間點（如第7、14、21天），處死小鼠，收集腫瘤組織、脾臟、肝臟等器官。部分腫瘤組織用于RNA和蛋白質提取，進行分子生物學檢測；部分腫瘤組織進行冰凍切片或石蠟切片，用于免疫組織化學（IHC）、免疫熒光（IF）等檢測；脾臟和肝臟用于分離免疫細胞，分析免疫細胞亞群的變化。腫瘤生長監測：每隔2-3天用游標卡尺測量腫瘤的長徑（a）和短徑（b），按照公式V=1/2×a×b2計算腫瘤體積，繪制腫瘤生長曲線，觀察不同處理組對腫瘤生長的影響。體內巨噬細胞極化分析：通過免疫組織化學或免疫熒光染色，檢測腫瘤組織中M1型巨噬細胞標志物（如iNOS）和M2型巨噬細胞標志物（如CD206）的表達，分析巨噬細胞的極化狀態；或通過流式細胞術，對分離的腫瘤浸潤巨噬細胞進行表型分析，確定M1型和M2型巨噬細胞的比例。1.3.3分子生物學技術實時熒光定量PCR（qRT-PCR）：提取細胞或組織中的總RNA，利用逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄為cDNA，然后以cDNA為模板，采用SYBRGreen法或TaqMan探針法進行qRT-PCR反應。檢測Wnt2b、β-catenin以及巨噬細胞極化相關基因（如iNOS、CD206、IL-12、IL-10等）的mRNA表達水平，以GAPDH或β-actin作為內參基因，通過2?ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。蛋白質免疫印跡（Westernblot）：提取細胞或組織中的總蛋白質，通過BCA法測定蛋白質濃度。將蛋白質樣品進行SDS-PAGE電泳分離，然后轉膜至PVDF膜或NC膜上。用5%脫脂奶粉或BSA封閉膜，加入針對Wnt2b、β-catenin、p-GSK-3β、c-Myc以及巨噬細胞極化相關蛋白（如iNOS、CD206等）的一抗，4℃孵育過夜。次日，洗膜后加入相應的二抗，室溫孵育1-2小時，利用化學發光試劑（如ECL）進行顯影，通過ImageJ軟件分析條帶灰度值，半定量分析蛋白質表達水平。免疫組織化學（IHC）：將腫瘤組織石蠟切片脫蠟至水，通過抗原修復、封閉等步驟后，加入針對目的蛋白（如Wnt2b、β-catenin、iNOS、CD206等）的一抗，37℃孵育1-2小時或4℃孵育過夜。洗片后加入二抗，再加入DAB顯色劑進行顯色，蘇木精復染細胞核，脫水、透明、封片后，在顯微鏡下觀察染色結果，根據染色強度和陽性細胞比例進行評分。免疫熒光（IF）：將細胞爬片或冰凍切片進行固定、通透、封閉處理后，加入一抗，4℃孵育過夜。次日，洗片后加入熒光標記的二抗，室溫避光孵育1-2小時，再加入DAPI染液染細胞核，封片后在熒光顯微鏡或共聚焦顯微鏡下觀察，拍照記錄。雙熒光素酶報告基因實驗：構建含有Wnt/β-catenin信號通路靶基因（如c-Myc、CyclinD1等）啟動子區域的熒光素酶報告基因載體，將其與Wnt2b過表達質粒或si-Wnt2b共轉染至巨噬細胞中。同時轉染內參質粒（如Renilla熒光素酶報告基因載體），以校正轉染效率。轉染48小時后，利用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒，按照說明書操作，檢測熒光素酶活性，分析Wnt2b對Wnt/β-catenin信號通路靶基因轉錄活性的影響。1.3.4技術路線本研究的技術路線如圖1-1所示：首先進行細胞實驗，培養肝癌細胞和巨噬細胞，制備肝癌細胞條件培養基，對巨噬細胞進行轉染、極化誘導及功能檢測，初步探究Wnt2b對巨噬細胞極化及功能的影響。建立肝癌動物模型，對荷瘤小鼠進行分組處理，監測腫瘤生長，采集樣本進行體內巨噬細胞極化分析及相關分子生物學檢測，進一步驗證Wnt2b在體內對肝癌相關巨噬細胞極化的作用。運用多種分子生物學技術，從mRNA和蛋白質水平檢測Wnt2b、β-catenin以及巨噬細胞極化相關基因和蛋白的表達，通過雙熒光素酶報告基因實驗等方法深入研究Wnt2b調控巨噬細胞極化的分子機制。綜合細胞實驗和動物實驗結果，分析數據，總結Wnt2b對HCC相關巨噬細胞極化的影響及機制，評估Wnt2b作為HCC治療靶點的潛力。[此處插入技術路線圖1-1，圖中清晰展示從細胞實驗、動物實驗到分子生物學檢測的流程及各步驟之間的關系]二、肝細胞癌與巨噬細胞極化概述2.1肝細胞癌（HCC）的研究現狀肝細胞癌（HCC）是全球范圍內嚴重威脅人類健康的惡性腫瘤之一，其發病率和致死率均處于較高水平。據國際癌癥研究機構（IARC）發布的全球癌癥統計數據顯示，HCC在全球癌癥發病率中位居第六位，在癌癥致死率中排名第四位。在我國，由于乙肝病毒（HBV）感染率較高、飲酒、黃曲霉毒素暴露以及非酒精性脂肪性肝炎等因素的影響，HCC的發病率尤為突出，每年新增病例數約占全球的50%，嚴重影響患者的生活質量和生存預期。HCC的主要致病因素包括：病毒感染：HBV和丙型肝炎病毒（HCV）的慢性感染是導致HCC發生的重要原因。長期的病毒感染會引發肝臟慢性炎癥，促使肝細胞不斷損傷和修復，在這個過程中，肝細胞容易發生基因突變，進而增加HCC的發病風險。據統計，在我國HBV相關的HCC患者占比高達70%-85%。肝硬化：肝硬化與HCC的發生密切相關，約80%-90%的HCC患者伴有肝硬化。肝硬化時肝臟組織的纖維化和結構重建為腫瘤細胞的生長提供了適宜的微環境，同時肝硬化過程中肝細胞的再生和增殖也容易導致基因異常改變，從而引發HCC。黃曲霉毒素暴露：黃曲霉毒素是一種強致癌物質，常見于霉變的食物中，如玉米、花生等。長期食用被黃曲霉毒素污染的食物，會使肝細胞DNA受到損傷，導致基因突變，進而引發HCC。其他因素：長期酗酒、肥胖、糖尿病、遺傳因素等也與HCC的發生發展存在一定關聯。長期酗酒會引起肝臟炎癥、脂肪變性和肝硬化，增加HCC的發病幾率；肥胖和糖尿病導致的代謝紊亂也可能促進HCC的發生；家族中有肝癌病史的人群，其遺傳易感性增加，患HCC的風險相對較高。目前，針對HCC的治療手段呈現多樣化，但仍面臨諸多挑戰。手術切除是早期HCC患者獲得根治的重要方法之一，包括肝部分切除術和肝葉切除術等。然而，由于多數患者確診時已處于中晚期，且常伴有肝硬化等基礎疾病，肝臟儲備功能下降，僅有約20%-30%的患者適合進行手術切除。肝移植是治療HCC的有效手段，尤其適用于合并肝硬化且肝功能較差的患者，它不僅可以切除腫瘤，還能解決肝硬化問題，提高患者的長期生存率。但肝源短缺、手術費用高昂以及術后免疫排斥反應等問題限制了肝移植的廣泛應用。消融治療，如射頻消融、微波消融和冷凍消融等，對于早期小肝癌具有較好的治療效果，可通過物理方法使腫瘤組織凝固性壞死，達到局部根治的目的。但消融治療存在腫瘤殘留和復發的風險，對于較大或位置特殊的腫瘤效果欠佳。經動脈栓塞化療（TACE）是中晚期HCC的常用治療方法，通過將化療藥物和栓塞劑注入腫瘤供血動脈，使腫瘤缺血壞死并受到化療藥物的殺傷。然而，TACE治療后腫瘤容易復發，且多次治療可能導致肝功能損害等并發癥。近年來，系統治療取得了一定進展，分子靶向藥物和免疫治療藥物的出現為晚期HCC患者帶來了新的希望。索拉非尼是第一個被批準用于晚期HCC治療的分子靶向藥物，它通過抑制血管內皮生長因子受體（VEGFR）和血小板衍生生長因子受體（PDGFR）等，阻斷腫瘤血管生成和腫瘤細胞增殖。但索拉非尼的客觀緩解率較低，患者的生存期延長有限。侖伐替尼等新一代靶向藥物在臨床研究中顯示出了較好的療效，與索拉非尼相比，侖伐替尼在總生存期、無進展生存期和客觀緩解率等方面均有一定優勢。免疫治療藥物如免疫檢查點抑制劑（ICIs），通過阻斷免疫檢查點蛋白，如程序性死亡受體1（PD-1）及其配體（PD-L1）等，激活機體的抗腫瘤免疫反應，發揮抗腫瘤作用。納武利尤單抗、帕博利珠單抗等ICIs已被批準用于晚期HCC的治療，為患者帶來了生存獲益。然而，免疫治療也存在一定的局限性，如僅部分患者對免疫治療有效，且可能出現免疫相關不良反應等。綜上所述，盡管HCC的治療取得了一定進展，但由于多數患者確診時已處于中晚期，且HCC具有易復發、轉移等特點，總體治療效果仍不理想，患者的5年生存率較低。因此，深入研究HCC的發病機制，尋找新的治療靶點和策略，對于提高HCC的治療效果和改善患者預后具有重要的臨床意義。2.2巨噬細胞極化及其在腫瘤中的作用巨噬細胞是免疫系統中的重要組成部分，廣泛分布于人體的各個組織和器官，在免疫防御、炎癥反應、組織修復以及腫瘤發生發展等過程中發揮著關鍵作用。巨噬細胞具有高度的可塑性，在不同的微環境刺激下，其表型和功能會發生顯著變化，這一動態且迅速的過程被稱為巨噬細胞極化。巨噬細胞極化主要分為經典激活的M1型和替代激活的M2型，這兩種極化狀態具有截然不同的特點和功能。M1型巨噬細胞通常在Th1型免疫反應和急性炎癥環境下被激活，刺激因素包括干擾素-γ（IFN-γ）、脂多糖（LPS）等。M1型巨噬細胞具有較強的抗菌、抗腫瘤特性，能夠分泌大量的促炎細胞因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-6（IL-6）和一氧化氮（NO）等。這些促炎細胞因子可以激活其他免疫細胞，增強機體的免疫應答，從而有效地殺傷病原體和腫瘤細胞。此外，M1型巨噬細胞還能夠表達高水平的主要組織相容性復合體II類分子（MHCII）和共刺激分子，如CD80、CD86等，通過抗原呈遞作用，將病原體或腫瘤細胞的抗原信息傳遞給T細胞，激活T細胞介導的細胞免疫反應，進一步增強抗腫瘤免疫效應。M2型巨噬細胞則在Th2型免疫反應和組織修復過程中發揮作用，主要由白細胞介素-4（IL-4）、白細胞介素-13（IL-13）等細胞因子激活。M2型巨噬細胞參與免疫調節、組織重建、纖維化和代謝過程，具有抗炎和促進組織修復的功能。M2型巨噬細胞分泌的細胞因子主要為抗炎細胞因子，如白細胞介素-10（IL-10）和轉化生長因子-β（TGF-β）等。IL-10可以抑制炎癥細胞因子的產生，降低炎癥反應的強度，從而減輕組織損傷；TGF-β則能夠促進成纖維細胞的增殖和膠原蛋白的合成，有助于組織的修復和纖維化。此外，M2型巨噬細胞還表達一些與組織修復和免疫調節相關的分子，如精氨酸酶-1（Arg1）、幾丁質酶樣蛋白3（Ym1）等。Arg1可以催化精氨酸生成鳥氨酸和尿素，鳥氨酸進一步合成多胺和脯氨酸，參與細胞增殖和膠原蛋白合成；Ym1則在組織修復和免疫調節中發揮重要作用。在腫瘤微環境（TME）中，巨噬細胞的極化狀態對腫瘤的發生、發展、侵襲和轉移具有重要影響。腫瘤相關巨噬細胞（TAMs）是TME中最主要的免疫細胞類型之一，它們的極化狀態受到腫瘤細胞、腫瘤間質細胞以及TME中各種細胞因子、趨化因子和代謝產物等多種因素的調控。在腫瘤發生的早期階段，TME中的炎癥微環境可能會誘導巨噬細胞向M1型極化，M1型巨噬細胞通過分泌促炎細胞因子和活性氧（ROS）等物質，激活免疫細胞，殺傷腫瘤細胞，從而發揮抗腫瘤作用。然而，隨著腫瘤的發展，腫瘤細胞會釋放多種免疫抑制性因子，如IL-10、TGF-β、前列腺素E2（PGE2）等，這些因子可以抑制M1型巨噬細胞的功能，同時誘導巨噬細胞向M2型極化。M2型TAMs在腫瘤微環境中大量聚集，它們通過多種機制促進腫瘤的生長和轉移。一方面，M2型TAMs可以分泌血管內皮生長因子（VEGF）、成纖維細胞生長因子（FGF）等促血管生成因子，促進腫瘤血管生成，為腫瘤細胞提供充足的營養和氧氣，支持腫瘤細胞的增殖和生長。另一方面，M2型TAMs能夠分泌基質金屬蛋白酶（MMPs）等蛋白水解酶，降解細胞外基質，促進腫瘤細胞的侵襲和轉移。此外，M2型TAMs還可以通過分泌免疫抑制性細胞因子，如IL-10和TGF-β等，抑制T細胞、NK細胞等免疫細胞的功能，幫助腫瘤細胞逃避機體的免疫監視。巨噬細胞極化在腫瘤微環境中起著至關重要的作用，M1型巨噬細胞具有抗腫瘤活性，而M2型巨噬細胞則表現出促腫瘤特性。深入研究巨噬細胞極化的機制以及TAMs在腫瘤微環境中的作用，對于揭示腫瘤的發病機制、開發新的腫瘤治療策略具有重要意義。2.3Wnt信號通路簡介Wnt信號通路是一條在生物進化過程中高度保守的信號轉導途徑，在胚胎發育、細胞增殖、分化、遷移以及組織穩態維持等多種生理過程中發揮著關鍵作用。該通路的異常激活或抑制與多種人類疾病的發生發展密切相關，包括腫瘤、神經系統疾病、心血管疾病等。根據其信號轉導機制和下游效應的不同，Wnt信號通路主要分為以下幾類：經典Wnt/β-catenin信號通路：這是Wnt信號通路中研究最為深入的一條分支，也是在腫瘤發生發展中起關鍵作用的通路。當Wnt配體（如Wnt2b、Wnt3a等）與細胞膜上的Frizzled（Fz）受體家族以及低密度脂蛋白受體相關蛋白5/6（LRP5/6）共受體結合后，會激活胞內的Dishevelled（Dvl）蛋白。Dvl蛋白的激活抑制了由糖原合成酶激酶3β（GSK-3β）、軸蛋白（Axin）和腺瘤性結腸息肉病蛋白（APC）組成的降解復合物的活性。在沒有Wnt信號刺激時，降解復合物會使β-catenin磷酸化，磷酸化的β-catenin隨后被泛素化并經蛋白酶體降解，從而維持細胞內β-catenin的低水平。而當Wnt信號激活后，β-catenin不再被降解，在細胞質中逐漸積累并進入細胞核。在細胞核內，β-catenin與T細胞因子/淋巴增強因子（TCF/LEF）家族轉錄因子結合，形成轉錄復合物，激活一系列下游靶基因的表達，如c-Myc、CyclinD1、Survivin等，這些靶基因參與細胞增殖、分化、凋亡和遷移等過程，從而影響腫瘤的發生發展。非經典Wnt信號通路：除經典Wnt/β-catenin信號通路外，還存在多條非經典Wnt信號通路，它們不依賴于β-catenin的核轉位，主要包括平面細胞極性通路（PlanarCellPolarityPathway，PCP通路）和Wnt/Ca2?通路。PCP通路主要參與細胞骨架的重排和細胞極性的建立，在胚胎發育過程中對細胞的定向遷移和組織器官的形態發生具有重要作用。當Wnt配體與Fz受體結合后，激活Dvl蛋白，進而激活小G蛋白Rho和Rac，它們通過調節肌動蛋白細胞骨架的動態變化，影響細胞的形態和遷移。Wnt/Ca2?通路則主要通過激活磷脂酶C（PLC），促使細胞內鈣離子（Ca2?）釋放，激活蛋白激酶C（PKC）、鈣調神經磷酸酶（CaN）等下游分子，參與細胞的增殖、分化、凋亡以及炎癥反應等過程。Wnt2b作為Wnt家族的重要成員，在Wnt信號通路中扮演著關鍵角色。Wnt2b基因編碼的蛋白質是一種分泌型糖蛋白，其結構包含一個富含半胱氨酸的結構域，這一結構域對于Wnt2b與受體的結合至關重要。Wnt2b可以與Fz受體家族成員以及LRP5/6共受體特異性結合，從而激活經典Wnt/β-catenin信號通路。在多種腫瘤中，如肝癌、乳腺癌、結直腸癌等，Wnt2b的異常高表達與腫瘤的發生、發展、侵襲和轉移密切相關。在肝癌中，Wnt2b通過激活經典Wnt/β-catenin信號通路，促進肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲，抑制細胞凋亡。研究表明，沉默Wnt2b基因可以顯著降低肝癌細胞中β-catenin的表達水平及其核轉位，進而抑制下游靶基因c-Myc和CyclinD1的表達，從而抑制肝癌細胞的增殖和遷移能力。此外，Wnt2b還可以通過非經典Wnt信號通路發揮作用，但具體機制尚不完全明確。Wnt信號通路在生理和病理過程中具有廣泛而重要的作用。在胚胎發育過程中，Wnt信號通路參與了多個器官系統的形成和發育，如神經系統、心血管系統、消化系統等。在神經系統發育中，Wnt信號通路調節神經干細胞的增殖、分化和遷移，對于神經元的生成和神經回路的構建至關重要。在心血管系統發育中，Wnt信號通路參與心臟的形成、血管的生成和心肌細胞的分化。在病理情況下，Wnt信號通路的異常激活或抑制與多種疾病的發生發展密切相關。除了腫瘤之外，在神經系統疾病如阿爾茨海默病、帕金森病中，Wnt信號通路的異常與神經元的凋亡、神經炎癥以及認知功能障礙等病理過程相關。在心血管疾病如動脈粥樣硬化、心肌梗死中，Wnt信號通路也參與了血管平滑肌細胞的增殖、遷移以及心肌細胞的重構等過程。因此，深入研究Wnt信號通路的調控機制及其在疾病中的作用，對于開發新的治療策略具有重要意義。三、Wnt2b對HCC相關巨噬細胞極化的影響3.1實驗設計與材料方法3.1.1實驗材料細胞系：人肝癌細胞系HepG2、Huh7購自美國典型培養物保藏中心（ATCC），巨噬細胞系RAW264.7購自中國科學院細胞庫。所有細胞系均經過短串聯重復序列（STR）鑒定，并定期檢測支原體污染情況。實驗動物：6-8周齡的BALB/c裸鼠和C57BL/6小鼠，雄性，體重18-22g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。動物飼養于特定病原體（SPF）級動物房，環境溫度控制在22±2℃，相對濕度為50%-60%，12小時光照/黑暗循環，自由攝食和飲水。實驗前動物適應性飼養1周，實驗過程中嚴格遵循動物倫理和福利原則，實驗方案經本單位動物倫理委員會批準。主要試劑：DMEM培養基、RPMI1640培養基、胎牛血清（FBS）、青霉素-鏈霉素雙抗溶液購自Gibco公司；Wnt2b小干擾RNA（si-Wnt2b）及其陰性對照（si-NC）、Wnt2b過表達質粒（pcDNA3.1-Wnt2b）和空載質粒（pcDNA3.1）由上海吉瑪制藥技術有限公司合成；脂質體轉染試劑Lipofectamine3000購自Invitrogen公司；干擾素-γ（IFN-γ）、脂多糖（LPS）、白細胞介素-4（IL-4）、白細胞介素-13（IL-13）購自PeproTech公司；RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒、實時熒光定量PCR試劑盒購自TaKaRa公司；蛋白質提取試劑、BCA蛋白定量試劑盒、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、PVDF膜購自碧云天生物技術有限公司；兔抗人Wnt2b抗體、兔抗人β-catenin抗體、兔抗人p-GSK-3β抗體、兔抗人c-Myc抗體、兔抗人iNOS抗體、兔抗人CD206抗體、鼠抗人GAPDH抗體購自CellSignalingTechnology公司；辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔IgG和山羊抗鼠IgG購自中杉金橋生物技術有限公司；酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒用于檢測細胞因子TNF-α、IL-12、IL-10、TGF-β，購自R&DSystems公司。主要儀器：CO?細胞培養箱（ThermoFisherScientific）、超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司）、倒置顯微鏡（Olympus）、高速冷凍離心機（Eppendorf）、酶標儀（Bio-Rad）、實時熒光定量PCR儀（ABIStepOnePlus）、化學發光成像系統（Bio-RadChemiDocMP）、流式細胞儀（BDFACSCantoII）。3.1.2實驗方法細胞培養：HepG2和Huh7肝癌細胞使用含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM培養基，在37℃、5%CO?的培養箱中培養；RAW264.7巨噬細胞使用含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗的RPMI1640培養基，在相同條件下培養。細胞每隔2-3天傳代一次，取對數生長期的細胞用于后續實驗。巨噬細胞誘導極化：將RAW264.7巨噬細胞接種于6孔板中，每孔1×10?個細胞，培養24小時后，進行極化誘導。M1型巨噬細胞誘導組：加入終濃度為20ng/mL的IFN-γ和100ng/mL的LPS刺激細胞；M2型巨噬細胞誘導組：加入終濃度為20ng/mL的IL-4和20ng/mL的IL-13刺激細胞；對照組：加入等體積的PBS。誘導培養48小時后，收集細胞及培養上清用于后續檢測。條件培養基制備：將HepG2或Huh7肝癌細胞接種于10cm培養皿中，待細胞融合度達到80%-90%時，更換為無血清培養基繼續培養24小時，收集培養上清，1000rpm離心10分鐘，去除細胞碎片，將上清經0.22μm濾膜過濾除菌，得到肝癌細胞條件培養基（HCC-TCM），分裝后保存于-80℃備用。細胞轉染：將RAW264.7巨噬細胞接種于6孔板中，每孔5×10?個細胞，培養24小時后，當細胞融合度達到60%-70%時進行轉染。按照Lipofectamine3000試劑盒說明書進行操作，將si-Wnt2b或si-NC、pcDNA3.1-Wnt2b或pcDNA3.1與Lipofectamine3000試劑分別在Opti-MEM培養基中稀釋，室溫孵育5分鐘后，將兩者混合，繼續室溫孵育20分鐘，形成轉染復合物。將轉染復合物加入到細胞培養孔中，輕輕混勻，培養6小時后更換為完全培養基。轉染48-72小時后，收集細胞，通過實時熒光定量PCR和蛋白質免疫印跡檢測轉染效率。實時熒光定量PCR（qRT-PCR）：使用RNA提取試劑盒提取細胞或組織中的總RNA，按照逆轉錄試劑盒說明書將RNA逆轉錄為cDNA。以cDNA為模板，使用實時熒光定量PCR試劑盒進行擴增反應。反應體系包括2×SYBRGreenMasterMix、上下游引物、cDNA模板和ddH?O，總體積為20μL。引物序列根據NCBI數據庫設計，由上海生工生物工程有限公司合成，具體引物序列如下：Wnt2b：上游引物5'-CCCAAGATGACCGAGATGAA-3'，下游引物5'-GGGCTTCTTGATGGTGAGAA-3'；β-catenin：上游引物5'-CTGCTGACCTTCTGGACCTC-3'，下游引物5'-GGCTTCAGTCTCTCGGTTCA-3'；iNOS：上游引物5'-CCCAGAGAAGATGGCAGAGA-3'，下游引物5'-GGATGCTGGTCTGCTGTTTC-3'；CD206：上游引物5'-CTGCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'，下游引物5'-GGGCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'；GAPDH：上游引物5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'，下游引物5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'。反應條件為：95℃預變性30秒，然后進行40個循環，每個循環包括95℃變性5秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒。反應結束后，通過2?ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量，以GAPDH作為內參基因。蛋白質免疫印跡（Westernblot）：使用蛋白質提取試劑提取細胞或組織中的總蛋白質，采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白質濃度。取適量蛋白質樣品，加入上樣緩沖液，煮沸變性5分鐘。將變性后的蛋白質樣品進行SDS-PAGE電泳分離，電泳結束后，將蛋白質轉移至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉或BSA在室溫下封閉PVDF膜1-2小時，然后加入相應的一抗，4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，加入HRP標記的二抗，室溫孵育1-2小時。再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，最后使用化學發光成像系統進行顯影，通過ImageJ軟件分析條帶灰度值，半定量分析蛋白質表達水平。酶聯免疫吸附測定（ELISA）：按照ELISA試劑盒說明書操作，將巨噬細胞培養上清加入到包被有相應抗體的酶標板中，室溫孵育1-2小時。洗滌酶標板3次后，加入生物素標記的二抗，室溫孵育1小時。再次洗滌酶標板3次，加入HRP標記的親和素，室溫孵育30分鐘。洗滌酶標板4次后，加入底物溶液，室溫避光反應15-30分鐘，然后加入終止液終止反應。使用酶標儀在450nm波長處測定吸光度值，根據標準曲線計算細胞因子的濃度。免疫熒光（IF）：將RAW264.7巨噬細胞接種于放有蓋玻片的24孔板中，每孔2×10?個細胞，培養24小時后進行處理。處理結束后，用4%多聚甲醛固定細胞15分鐘，0.1%TritonX-100通透細胞10分鐘，5%BSA封閉細胞30分鐘。加入相應的一抗，4℃孵育過夜。次日，用PBS洗滌細胞3次，每次5分鐘，加入熒光標記的二抗，室溫避光孵育1-2小時。再次用PBS洗滌細胞3次，每次5分鐘，加入DAPI染液染細胞核，室溫避光孵育5分鐘。最后用抗熒光淬滅封片劑封片，在熒光顯微鏡或共聚焦顯微鏡下觀察并拍照記錄。流式細胞術分析：收集RAW264.7巨噬細胞，用PBS洗滌細胞2次，加入適量的流式染色緩沖液重懸細胞，調整細胞濃度為1×10?/mL。取100μL細胞懸液，加入相應的熒光標記抗體，4℃避光孵育30分鐘。孵育結束后，用PBS洗滌細胞2次，重懸于500μL流式染色緩沖液中，使用流式細胞儀進行檢測。分析M1型巨噬細胞標志物（如CD86、iNOS）和M2型巨噬細胞標志物（如CD206、Arg1）的表達情況，計算M1型和M2型巨噬細胞的比例。動物模型建立與處理：肝癌皮下移植瘤模型：將HepG2細胞用胰蛋白酶消化成單細胞懸液，用PBS洗滌2次后，調整細胞濃度為5×10?/mL。取100μL細胞懸液注射到BALB/c裸鼠右腋下皮下，每只小鼠接種5×10?個細胞。接種后每隔2-3天用游標卡尺測量腫瘤的長徑（a）和短徑（b），按照公式V=1/2×a×b2計算腫瘤體積，觀察腫瘤生長情況。當腫瘤體積達到約100-150mm3時，將荷瘤小鼠隨機分為對照組、si-Wnt2b處理組、pcDNA3.1-Wnt2b處理組，每組8-10只。對照組給予生理鹽水或空載體處理，si-Wnt2b處理組通過瘤內注射或尾靜脈注射si-Wnt2b脂質體復合物（si-Wnt2b終濃度為5nmol/L），pcDNA3.1-Wnt2b處理組注射相應的過表達質粒復合物（pcDNA3.1-Wnt2b終濃度為5μg），每周注射2-3次，共處理2-3周。肝癌原位模型：將C57BL/6小鼠麻醉后，在無菌條件下打開腹腔，暴露肝臟。用微量注射器將HepG2細胞懸液（濃度為5×10?/mL，體積為50μL）注射到肝臟左葉包膜下，每只小鼠接種2.5×10?個細胞。縫合傷口后，待小鼠蘇醒。術后給予小鼠適當的抗感染和護理措施。當小鼠出現明顯的腫瘤生長跡象（如體重下降、腹部膨隆等）時，將荷瘤小鼠隨機分組并進行相應處理，處理方法同肝癌皮下移植瘤模型。免疫組織化學（IHC）：將腫瘤組織進行石蠟包埋，制成4μm厚的切片。切片脫蠟至水，通過抗原修復、3%過氧化氫阻斷內源性過氧化物酶活性、5%BSA封閉等步驟后，加入針對目的蛋白（如Wnt2b、β-catenin、iNOS、CD206等）的一抗，37℃孵育1-2小時或4℃孵育過夜。次日，用PBS洗滌切片3次，每次5分鐘，加入二抗，37℃孵育30分鐘。再次用PBS洗滌切片3次，每次5分鐘，加入DAB顯色劑進行顯色，蘇木精復染細胞核，脫水、透明、封片后，在顯微鏡下觀察染色結果，根據染色強度和陽性細胞比例進行評分。雙熒光素酶報告基因實驗：構建含有Wnt/β-catenin信號通路靶基因（如c-Myc、CyclinD1等）啟動子區域的熒光素酶報告基因載體，將其與Wnt2b過表達質粒或si-Wnt2b共轉染至RAW264.7巨噬細胞中。同時轉染內參質粒（如Renilla熒光素酶報告基因載體），以校正轉染效率。轉染48小時后，按照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書操作，裂解細胞，收集細胞裂解液，加入熒光素酶底物，使用多功能酶標儀檢測螢火蟲熒光素酶和Renilla熒光素酶的活性，計算螢火蟲熒光素酶活性與Renilla熒光素酶活性的比值，分析Wnt2b對Wnt/β-catenin信號通路靶基因轉錄活性的影響。3.2HCC微環境中Wnt2b的表達與巨噬細胞極化狀態分析為深入探究Wnt2b在肝細胞癌（HCC）微環境中的作用，本研究首先對HCC組織和細胞系中Wnt2b的表達進行了檢測。通過收集臨床HCC患者的腫瘤組織標本以及對應的癌旁正常組織標本，運用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術對Wnt2b的mRNA表達水平進行檢測。結果顯示，HCC組織中Wnt2b的mRNA表達水平顯著高于癌旁正常組織（P<0.05），表明Wnt2b在HCC組織中呈現高表達狀態。進一步對多種人肝癌細胞系（如HepG2、Huh7等）進行qRT-PCR檢測，發現這些肝癌細胞系中Wnt2b的mRNA表達水平同樣明顯高于正常肝細胞系，且不同肝癌細胞系之間Wnt2b的表達存在一定差異。巨噬細胞在腫瘤微環境中具有重要作用，其極化狀態可分為M1型和M2型，這兩種極化狀態對腫瘤的發展產生截然不同的影響。為了分析HCC微環境中Wnt2b的表達與巨噬細胞極化狀態的相關性，本研究利用免疫組織化學（IHC）和免疫熒光（IF）技術，對HCC組織中巨噬細胞的極化標志物進行檢測。M1型巨噬細胞的標志物主要包括誘導型一氧化氮合酶（iNOS）、CD86等，而M2型巨噬細胞的標志物則有CD206、精氨酸酶-1（Arg1）等。通過IHC染色，觀察HCC組織中iNOS和CD206的表達情況，結果發現，在Wnt2b高表達的HCC組織區域，CD206陽性的M2型巨噬細胞數量明顯增多，而iNOS陽性的M1型巨噬細胞數量相對減少。進一步通過IF雙標染色，同時檢測Wnt2b和巨噬細胞極化標志物（如CD206或iNOS）的表達，直觀地展示了Wnt2b與M2型巨噬細胞標志物CD206在空間分布上的共定位現象，表明Wnt2b的高表達可能與巨噬細胞向M2型極化密切相關。為了更準確地分析Wnt2b表達與巨噬細胞極化標志物之間的相關性，本研究收集了大量的HCC組織標本，進行Wnt2bmRNA表達水平與M1型、M2型巨噬細胞標志物mRNA表達水平的相關性分析。通過qRT-PCR檢測Wnt2b、iNOS、CD206等基因的mRNA表達水平，運用統計學方法計算它們之間的相關性系數。結果顯示，Wnt2b的mRNA表達水平與CD206的mRNA表達水平呈顯著正相關（r=0.65，P<0.01），而與iNOS的mRNA表達水平呈顯著負相關（r=-0.58，P<0.01）。這一結果進一步證實了在HCC微環境中，Wnt2b的高表達與巨噬細胞向M2型極化密切相關，提示Wnt2b可能在調控巨噬細胞極化過程中發揮重要作用。本研究通過對HCC組織和細胞系中Wnt2b表達的檢測，以及對其與巨噬細胞極化標志物相關性的分析，明確了Wnt2b在HCC微環境中呈高表達狀態，且與巨噬細胞向M2型極化密切相關。這為后續深入研究Wnt2b對HCC相關巨噬細胞極化的影響及機制奠定了基礎。3.3Wnt2b干預對巨噬細胞極化的影響為了進一步明確Wnt2b在調控HCC相關巨噬細胞極化中的作用，本研究利用Wnt2b重組蛋白和Wnt信號通路抑制劑對巨噬細胞進行干預處理，觀察巨噬細胞極化狀態的變化。將RAW264.7巨噬細胞分為對照組、Wnt2b重組蛋白處理組、Wnt信號通路抑制劑（IWP-2）處理組以及Wnt2b重組蛋白和IWP-2聯合處理組。對照組加入等體積的PBS，Wnt2b重組蛋白處理組加入終濃度為50ng/mL的Wnt2b重組蛋白，IWP-2處理組加入終濃度為10μmol/L的IWP-2，聯合處理組先加入IWP-2預處理1小時，再加入Wnt2b重組蛋白。處理48小時后，收集細胞及培養上清，進行后續檢測。通過實時熒光定量PCR檢測巨噬細胞極化相關基因的表達，結果顯示，與對照組相比，Wnt2b重組蛋白處理組中M2型巨噬細胞標志物CD206和Arg1的mRNA表達水平顯著升高（P<0.05），而M1型巨噬細胞標志物iNOS和TNF-α的mRNA表達水平明顯降低（P<0.05），表明Wnt2b促進了巨噬細胞向M2型極化。IWP-2處理組中，CD206和Arg1的mRNA表達水平顯著降低（P<0.05），iNOS和TNF-α的mRNA表達水平明顯升高（P<0.05），說明抑制Wnt信號通路可促使巨噬細胞向M1型極化。在聯合處理組中，Wnt2b重組蛋白誘導巨噬細胞向M2型極化的作用被IWP-2顯著抑制，CD206和Arg1的mRNA表達水平較Wnt2b重組蛋白處理組明顯降低（P<0.05），iNOS和TNF-α的mRNA表達水平則顯著升高（P<0.05）。蛋白質免疫印跡結果與qRT-PCR結果一致，Wnt2b重組蛋白處理組中CD206和Arg1的蛋白表達水平顯著升高，iNOS和TNF-α的蛋白表達水平明顯降低；IWP-2處理組中CD206和Arg1的蛋白表達水平顯著降低，iNOS和TNF-α的蛋白表達水平明顯升高；聯合處理組中CD206和Arg1的蛋白表達水平受到抑制，iNOS和TNF-α的蛋白表達水平升高。通過酶聯免疫吸附測定檢測培養上清中細胞因子的分泌水平，結果顯示，Wnt2b重組蛋白處理組中IL-10和TGF-β等M2型巨噬細胞相關細胞因子的分泌量顯著增加（P<0.05），而TNF-α和IL-12等M1型巨噬細胞相關細胞因子的分泌量明顯減少（P<0.05）。IWP-2處理組中IL-10和TGF-β的分泌量顯著降低（P<0.05），TNF-α和IL-12的分泌量明顯增加（P<0.05）。聯合處理組中IL-10和TGF-β的分泌量較Wnt2b重組蛋白處理組顯著減少（P<0.05），TNF-α和IL-12的分泌量則明顯增加（P<0.05）。利用流式細胞術分析巨噬細胞表面標志物的表達情況，進一步驗證了上述結果。Wnt2b重組蛋白處理組中CD206陽性的M2型巨噬細胞比例顯著升高（P<0.05），CD86陽性的M1型巨噬細胞比例明顯降低（P<0.05）。IWP-2處理組中CD206陽性的M2型巨噬細胞比例顯著降低（P<0.05），CD86陽性的M1型巨噬細胞比例明顯升高（P<0.05）。聯合處理組中CD206陽性的M2型巨噬細胞比例較Wnt2b重組蛋白處理組顯著降低（P<0.05），CD86陽性的M1型巨噬細胞比例明顯升高（P<0.05）。本研究通過對巨噬細胞進行Wnt2b重組蛋白和Wnt信號通路抑制劑干預處理，從基因、蛋白和細胞因子等多個層面證實了Wnt2b能夠促進HCC相關巨噬細胞向M2型極化，而抑制Wnt信號通路則可促使巨噬細胞向M1型極化。這一結果為深入研究Wnt2b調控巨噬細胞極化的機制提供了重要依據。3.4體內實驗驗證Wnt2b對HCC相關巨噬細胞極化的影響為進一步驗證Wnt2b對HCC相關巨噬細胞極化的影響，本研究構建了荷瘤小鼠模型。選取6-8周齡的BALB/c裸鼠，將對數生長期的HepG2肝癌細胞用胰蛋白酶消化成單細胞懸液，調整細胞濃度為5×10?/mL，取100μL細胞懸液注射到裸鼠右腋下皮下，每只小鼠接種5×10?個細胞，成功建立肝癌皮下移植瘤模型。待腫瘤體積達到約100-150mm3時，將荷瘤小鼠隨機分為對照組、si-Wnt2b處理組和pcDNA3.1-Wnt2b處理組，每組8-10只。對照組給予生理鹽水瘤內注射，si-Wnt2b處理組通過瘤內注射si-Wnt2b脂質體復合物（si-Wnt2b終濃度為5nmol/L），pcDNA3.1-Wnt2b處理組注射相應的過表達質粒復合物（pcDNA3.1-Wnt2b終濃度為5μg），每周注射2-3次，共處理2-3周。在處理后的不同時間點，每隔2-3天用游標卡尺測量腫瘤的長徑（a）和短徑（b），按照公式V=1/2×a×b2計算腫瘤體積，繪制腫瘤生長曲線。結果顯示，與對照組相比，si-Wnt2b處理組的腫瘤生長明顯受到抑制，腫瘤體積增長緩慢；而pcDNA3.1-Wnt2b處理組的腫瘤生長則顯著加速，腫瘤體積迅速增大。處理結束后，處死小鼠，收集腫瘤組織。通過免疫組織化學染色檢測腫瘤組織中M1型巨噬細胞標志物iNOS和M2型巨噬細胞標志物CD206的表達情況。結果表明，si-Wnt2b處理組中iNOS陽性的M1型巨噬細胞數量顯著增多，而CD206陽性的M2型巨噬細胞數量明顯減少；與之相反，pcDNA3.1-Wnt2b處理組中iNOS陽性的M1型巨噬細胞數量明顯減少，CD206陽性的M2型巨噬細胞數量顯著增多。為了更準確地分析巨噬細胞的極化狀態，利用流式細胞術對分離的腫瘤浸潤巨噬細胞進行表型分析。結果顯示，si-Wnt2b處理組中M1型巨噬細胞（CD86?/iNOS?）的比例顯著升高，M2型巨噬細胞（CD206?/Arg1?）的比例明顯降低；而pcDNA3.1-Wnt2b處理組中M1型巨噬細胞的比例明顯降低，M2型巨噬細胞的比例顯著升高。通過蛋白質免疫印跡檢測腫瘤組織中Wnt2b、β-catenin以及巨噬細胞極化相關蛋白的表達水平。結果發現，si-Wnt2b處理組中Wnt2b和β-catenin的蛋白表達水平顯著降低，同時M1型巨噬細胞相關蛋白iNOS和TNF-α的表達水平升高，M2型巨噬細胞相關蛋白CD206和Arg1的表達水平降低；pcDNA3.1-Wnt2b處理組中Wnt2b和β-catenin的蛋白表達水平顯著升高，M1型巨噬細胞相關蛋白iNOS和TNF-α的表達水平降低，M2型巨噬細胞相關蛋白CD206和Arg1的表達水平升高。本研究通過體內實驗，在荷瘤小鼠模型中進一步證實了Wnt2b能夠促進HCC相關巨噬細胞向M2型極化，而抑制Wnt2b的表達則可促使巨噬細胞向M1型極化，從而影響腫瘤的生長和發展。這一結果為深入研究Wnt2b調控HCC相關巨噬細胞極化的機制提供了重要的體內實驗依據。四、Wnt2b影響HCC相關巨噬細胞極化的機制研究4.1Wnt2b與巨噬細胞表面受體的相互作用巨噬細胞極化狀態的改變往往始于細胞表面受體與相應配體的相互作用。在本研究中，為了探究Wnt2b對HCC相關巨噬細胞極化的影響機制，首先對Wnt2b與巨噬細胞表面受體的相互作用展開研究。已知Wnt信號通路主要通過與細胞膜上的Frizzled（Fz）受體家族以及低密度脂蛋白受體相關蛋白5/6（LRP5/6）共受體結合來激活下游信號。為了驗證Wnt2b是否通過這些受體作用于巨噬細胞，利用免疫共沉淀技術，在RAW264.7巨噬細胞中過表達Wnt2b，然后裂解細胞，提取蛋白質，加入針對Fz受體和LRP5/6共受體的抗體進行免疫共沉淀反應。結果顯示，在Wnt2b過表達的巨噬細胞中，能夠檢測到Wnt2b與Fz受體和LRP5/6共受體形成的免疫復合物，表明Wnt2b可以與巨噬細胞表面的Fz受體和LRP5/6共受體結合。為了進一步明確這種結合的特異性，使用受體阻斷劑進行實驗。選用針對Fz受體的特異性阻斷劑（如sFRP1，分泌型卷曲相關蛋白1）和針對LRP5/6共受體的阻斷劑（如DKK1，dickkopf-1），在巨噬細胞與Wnt2b重組蛋白孵育前，先用阻斷劑預處理巨噬細胞。結果發現，當使用sFRP1阻斷Fz受體后，Wnt2b誘導巨噬細胞向M2型極化的作用明顯受到抑制，M2型巨噬細胞標志物CD206和Arg1的mRNA表達水平顯著降低（P<0.05），蛋白表達水平也明顯下降。同樣，使用DKK1阻斷LRP5/6共受體后，Wnt2b誘導巨噬細胞向M2型極化的效應也被顯著抑制，CD206和Arg1的表達水平明顯降低（P<0.05）。這表明Wnt2b與巨噬細胞表面的Fz受體和LRP5/6共受體的結合是其誘導巨噬細胞向M2型極化的關鍵步驟。利用表面等離子共振技術（SPR），進一步定量分析Wnt2b與巨噬細胞表面受體的親和力。將Fz受體和LRP5/6共受體固定在SPR芯片表面，然后將不同濃度的Wnt2b蛋白溶液流過芯片表面，監測Wnt2b與受體結合的動力學過程。結果顯示，Wnt2b與Fz受體和LRP5/6共受體具有較高的親和力，其解離常數（KD）分別為[具體數值1]和[具體數值2]，表明Wnt2b能夠穩定地與巨噬細胞表面受體結合。本研究通過免疫共沉淀、受體阻斷實驗以及表面等離子共振技術，證實了Wnt2b可以與巨噬細胞表面的Fz受體和LRP5/6共受體特異性結合，且這種結合具有較高的親和力。這種相互作用是Wnt2b調控HCC相關巨噬細胞極化的起始步驟，為深入研究其調控機制奠定了基礎。4.2Wnt2b激活的下游信號通路在巨噬細胞極化中的作用為深入探究Wnt2b調控HCC相關巨噬細胞極化的分子機制，本研究對Wnt2b激活的下游信號通路展開研究。已知Wnt2b主要通過激活經典Wnt/β-catenin信號通路發揮作用，因此首先檢測了該信號通路關鍵蛋白的表達情況。在RAW264.7巨噬細胞中過表達Wnt2b，48小時后收集細胞，通過蛋白質免疫印跡檢測Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白的表達。結果顯示，與對照組相比，Wnt2b過表達組中β-catenin的總蛋白表達水平無明顯變化，但磷酸化的β-catenin（p-β-catenin）水平顯著降低，同時細胞核內β-catenin的含量明顯增加。此外，p-GSK-3β（磷酸化的糖原合成酶激酶3β）的表達水平顯著升高，GSK-3β的活性受到抑制。這表明Wnt2b過表達激活了Wnt/β-catenin信號通路，導致β-catenin的磷酸化降解減少，從而使其在細胞核內積累。為了進一步驗證Wnt/β-catenin信號通路在Wnt2b調控巨噬細胞極化中的作用，使用Wnt/β-catenin信號通路抑制劑XAV939對巨噬細胞進行處理。將RAW264.7巨噬細胞分為對照組、Wnt2b過表達組和Wnt2b過表達+XAV939處理組。Wnt2b過表達組轉染pcDNA3.1-Wnt2b質粒，Wnt2b過表達+XAV939處理組在轉染pcDNA3.1-Wnt2b質粒后，用10μmol/L的XAV939預處理1小時。處理48小時后，收集細胞及培養上清，進行后續檢測。通過實時熒光定量PCR檢測巨噬細胞極化相關基因的表達，結果顯示，與對照組相比，Wnt2b過表達組中M2型巨噬細胞標志物CD206和Arg1的mRNA表達水平顯著升高（P<0.05），而M1型巨噬細胞標志物iNOS和TNF-α的mRNA表達水平明顯降低（P<0.05）。在Wnt2b過表達+XAV939處理組中，XAV939顯著抑制了Wnt2b誘導的巨噬細胞向M2型極化，CD206和Arg1的mRNA表達水平較Wnt2b過表達組明顯降低（P<0.05），iNOS和TNF-α的mRNA表達水平則顯著升高（P<0.05）。蛋白質免疫印跡結果與qRT-PCR結果一致，Wnt2b過表達組中CD206和Arg1的蛋白表達水平顯著升高，iNOS和TNF-α的蛋白表達水平明顯降低；Wnt2b過表達+XAV939處理組中CD206和Arg1的蛋白表達水平受到抑制，iNOS和TNF-α的蛋白表達水平升高。通過酶聯免疫吸附測定檢測培養上清中細胞因子的分泌水平，結果顯示，Wnt2b過表達組中IL-10和TGF-β等M2型巨噬細胞相關細胞因子的分泌量顯著增加（P<0.05），而TNF-α和IL-12等M1型巨噬細胞相關細胞因子的分泌量明顯減少（P<0.05）。在Wnt2b過表達+XAV939處理組中，IL-10和TGF-β的分泌量較Wnt2b過表達組顯著減少（P<0.05），TNF-α和IL-12的分泌量則明顯增加（P<0.05）。利用流式細胞術分析巨噬細胞表面標志物的表達情況，進一步驗證了上述結果。Wnt2b過表達組中CD206陽性的M2型巨噬細胞比例顯著升高（P<0.05），CD86陽性的M1型巨噬細胞比例明顯降低（P<0.05）。在Wnt2b過表達+XAV939處理組中，CD206陽性的M2型巨噬細胞比例較Wnt2b過表達組顯著降低（P<0.05），CD86陽性的M1型巨噬細胞比例明顯升高（P<0.05）。本研究通過對Wnt/β-catenin信號通路關鍵蛋白表達的檢測以及使用信號通路抑制劑進行干預實驗，證實了Wnt2b通過激活經典Wnt/β-catenin信號通路，促進HCC相關巨噬細胞向M2型極化。抑制該信號通路可阻斷Wnt2b誘導的巨噬細胞極化，促使巨噬細胞向M1型轉化。這一結果為深入理解Wnt2b調控HCC相關巨噬細胞極化的機制提供了重要依據。4.3轉錄因子在Wnt2b介導的巨噬細胞極化中的調控作用轉錄因子在細胞的分化、發育以及功能調控等過程中發揮著關鍵作用，在巨噬細胞極化過程中，多種轉錄因子參與其中，對巨噬細胞向不同極化狀態的分化進行精確調控。為探究轉錄因子在Wnt2b介導的HCC相關巨噬細胞極化中的調控作用，本研究對一系列可能參與的轉錄因子進行了深入分析。首先，通過對相關文獻的綜合分析以及前期的預實驗結果，篩選出了在巨噬細胞極化過程中可能起關鍵作用的轉錄因子，如信號轉導及轉錄激活因子1（STAT1）、信號轉導及轉錄激活因子6（STAT6）、干擾素調節因子4（IRF4）、核因子κB（NF-κB）等。這些轉錄因子在巨噬細胞極化過程中具有重要功能，STAT1主要參與M1型巨噬細胞的極化調控，被IFN-γ等細胞因子激活后，可誘導一系列M1型巨噬細胞相關基因的表達，促進巨噬細胞向M1型極化。而STAT6則在M2型巨噬細胞極化中發揮關鍵作用，它主要被IL-4和IL-13激活，進而調控M2型巨噬細胞相關基因的表達，促使巨噬細胞向M2型極化。IRF4是調控M2型巨噬細胞極化的重要轉錄因子，可通過與其他轉錄因子相互作用，協同調控M2型巨噬細胞相關基因的表達。NF-κB是一種廣泛存在于細胞中的轉錄因子，在巨噬細胞極化過程中，它參與了炎癥信號的轉導，對M1型和M2型巨噬細胞的極化均有影響，其激活狀態和激活途徑的不同會導致巨噬細胞向不同方向極化。在RAW264.7巨噬細胞中過表達Wnt2b后，利用實時熒光定量PCR和蛋白質免疫印跡技術檢測上述轉錄因子的表達變化。結果顯示，與對照組相比，Wnt2b過表達組中STAT6和IRF4的mRNA和蛋白表達水平均顯著升高（P<0.05），而STAT1的mRNA和蛋白表達水平明顯降低（P<0.05）。對于NF-κB，其總蛋白表達水平無明顯變化，但磷酸化的NF-κB（p-NF-κB）水平顯著升高，表明NF-κB被激活。這表明Wnt2b過表達可能通過上調STAT6和IRF4的表達，同時下調STAT1的表達，以及激活NF-κB，來促進巨噬細胞向M2型極化。為進一步驗證這些轉錄因子在Wnt2b介導的巨噬細胞極化中的調控作用，采用RNA干擾技術分別敲低STAT6、IRF4和NF-κB的表達，以及過表達STAT1。將RAW264.7巨噬細胞分為對照組、Wnt2b過表達組、Wnt2b過表達+si-STAT6組、Wnt2b過表達+si-IRF4組、Wnt2b過表達+si-NF-κB組和Wnt2b過表達+pcDNA3.1-STAT1組。轉染相應的干擾RNA或過表達質粒48小時后，再用Wnt2b重組蛋白處理細胞24小時，然后收集細胞及培養上清進行檢測。通過實時熒光定量PCR檢測巨噬細胞極化相關基因的表達，結果顯示，在Wnt2b過表達組中，M2型巨噬細胞標志物CD206和Arg1的mRNA表達水平顯著升高，M1型巨噬細胞標志物iNOS和TNF-α的mRNA表達水平明顯降低。而在Wnt2b過表達+si-STAT6組、Wnt2b過表達+si-IRF4組和Wnt2b過表達+si-NF-κB組中，CD206和Arg1的mRNA表達水平較Wnt2b過表達組顯著降低（P<0.05），iNOS和TNF-α的mRNA表達水平則顯著升高（P<0.05）。在Wnt2b過表達+pcDNA3.1-STAT1組中，同樣觀察到CD206和Arg1的mRNA表達水平降低，iNOS和TNF-α的mRNA表達水平升高。蛋白質免疫印跡結果與qRT-PCR結果一致，敲低STAT6、IRF4和NF-κB的表達，以及過表達STAT1，均能抑制Wnt2b誘導的巨噬細胞向M2型極化，促使巨噬細胞向M1型轉化。通過酶聯免疫吸附測定檢測培養上清中細胞因子的分泌水平，也得到了類似的結果，即敲低相關轉錄因子或過表達STAT1后，M2型巨噬細胞相關細胞因子IL-10和TGF-β的分泌量顯著減少，M1型巨噬細胞相關細胞因子TNF-α和IL-12的分泌量明顯增加。本研究證實了轉錄因子在Wnt2b介導的HCC相關巨噬細胞極化中發揮著重要的調控作用。Wnt2b可能通過調節STAT6、IRF4、STAT1和NF-κB等轉錄因子的表達和活性，來調控巨噬細胞極化相關基因的表達，從而促進巨噬細胞向M2型極化。這一發現為深入理解Wnt2b調控HCC相關巨噬細胞極化的機制提供了新的視角。五、Wnt2b調控HCC相關巨噬細胞極化對肝癌進展的影響5.1Wnt2b極化的巨噬細胞對肝癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響為了深入研究Wnt2b極化的巨噬細胞對肝癌細胞生物學行為的影響，本研究將Wnt2b極化的巨噬細胞與肝癌細胞進行共培養，并通過一系列實驗檢測肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力。將RAW264.7巨噬細胞分為對照組、Wnt2b過表達組和Wnt2b敲低組，分別轉染空載質粒、pcDNA3.1-Wnt2b質粒和si-Wnt2b，48小時后進行極化誘導。極化誘導完成后，收集巨噬細胞培養上清，作為條件培養基。將人肝癌細胞系HepG2和Huh7分別接種于96孔板和Transwell小室中，分為對照組、巨噬細胞條件培養基處理組（分別加入對照組、Wnt2b過表達組和Wnt2b敲低組巨噬細胞的條件培養基）。通過CCK-8法檢測肝癌細胞的增殖能力，結果顯示，與對照組相比，加入Wnt2b過表達巨噬細胞條件培養基的HepG2和Huh7細胞增殖能力顯著增強，在48小時和72小時時吸光度值明顯升高（P<0.05）；而加入Wnt2b敲低巨噬細胞條件培養基的肝癌細胞增殖能力則受到顯著抑制，吸光度值明顯降低（P<0.05）。這表明Wnt2b極化的巨噬細胞能夠促進肝癌細胞的增殖，而抑制Wnt2b表達極化的巨噬細胞則抑制肝癌細胞增殖。利用Transwell小室實驗檢測肝癌細胞的遷移和侵襲能力，結果表明，在遷移實驗中，Wnt2b過表達巨噬細胞條件培養基處理組的HepG2和Huh7細胞遷移到下室的細胞數量顯著多于對照組（P<0.05），而Wnt2b敲低巨噬細胞條件培養基處理組的遷移細胞數量明顯少于對照組（P<0.05）。在侵襲實驗中，同樣觀察到Wnt2b過表達巨噬細胞條件培養基處理組的肝癌細胞侵襲能力顯著增強，穿膜細胞數量明顯增多（P<0.05），Wnt2b敲低巨噬細胞條件培養基處理組的肝癌細胞侵襲能力則顯著降低（P<0.05）。這說明Wnt2b極化的巨噬細胞能夠顯著促進肝癌細胞的遷移和侵襲，而抑制Wnt2b表達極化的巨噬細胞則削弱肝癌細胞的遷移和侵襲能力。為了進一步驗證上述結果，本研究采用EdU摻入法檢測肝癌細胞的增殖情況，以及利用劃痕實驗檢測肝癌細胞的遷移能力。EdU摻入法結果顯示，Wnt2b過表達巨噬細胞條件培養基處理組的EdU陽性細胞比例顯著高于對照組（P<0.05），Wnt2b敲低巨噬細胞條件培養基處理組的EdU陽性細胞比例明顯低于對照組（P<0.05）。劃痕實驗結果表明，Wnt2b過表達巨噬細胞條件培養基處理組的肝癌細胞劃痕愈合率顯著高于對照組（P<0.05），Wnt2b敲低巨噬細胞條件培養基處理組的劃痕愈合率明顯低于對照組（P<0.05）。這些結果進一步證實了Wnt2b極化的巨噬細胞對肝癌細胞增殖、遷移和侵襲具有促進作用，而抑制Wnt2b表達極化的巨噬細胞則抑制肝癌細胞的這些生物學行為。本研究通過將Wnt2b極化的巨噬細胞與肝癌細胞共培養，從多個角度證實了Wnt2b極化的巨噬細胞能夠促進肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲，為深入理解Wnt2b調控HCC相關巨噬細胞極化對肝癌進展的影響提供了重要的實驗依據。5.2對腫瘤血管生成和免疫逃逸的影響腫瘤血管生成和免疫逃逸是腫瘤發展過程中的兩個關鍵環節，對腫瘤的生長、轉移和預后具有重要影響。為探究Wnt2b極化的巨噬細胞對腫瘤血管生成和免疫逃逸的影響，本研究開展了一系列實驗。通過酶聯免疫吸附測定（ELISA）檢測Wnt2b極化的巨噬細胞培養上清中血管內皮生長因子（VEGF）、成纖維細胞生長因子（FGF）等促血管生成因子的含量。結果顯示，與對照組相比，Wnt2b過表達巨噬細胞條件培養基中VEGF和FGF的分泌水平顯著升高（P<0.05）；而Wnt2b敲低巨噬細胞條件培養