miR-133a：心肌缺血再灌注損傷后心室重構的關鍵保護因子與機制解析一、引言1.1研究背景心血管疾病嚴重威脅人類健康，其中冠心病、心肌梗死等心臟缺血性疾病是導致心血管疾病患者死亡的主要原因之一。隨著臨床治療技術的不斷進步，諸如經皮冠狀動脈介入治療（PCI）、冠狀動脈旁路移植術（CABG）以及溶栓治療等方法的廣泛應用，在使阻塞冠狀動脈再通、恢復心肌血流灌注方面取得了顯著成效。然而，在心肌缺血一段時間后恢復血液供應時，卻可能引發心肌缺血再灌注損傷（MyocardialIschemia-ReperfusionInjury，MIRI），這一現象已逐漸成為臨床治療中不容忽視的問題。MIRI指的是心肌缺血一段時間后恢復血液供應時，心肌損傷反而加重的現象。在缺血期，心肌細胞因缺氧和代謝底物缺乏，能量生成減少，細胞內離子穩態失衡，無氧代謝產物堆積，導致心肌細胞功能和結構受損。當恢復血流灌注后，原本缺血的心肌組織獲得氧氣和營養物質，但同時也會產生大量的活性氧（ReactiveOxygenSpecies，ROS），引發氧化應激反應。這些ROS能夠攻擊細胞膜、蛋白質和核酸等生物大分子，導致細胞膜脂質過氧化、蛋白質變性、DNA損傷，進而破壞細胞的正常結構和功能。再灌注過程中還會激活炎癥反應，大量炎癥細胞浸潤，釋放多種炎癥介質，進一步加重心肌細胞的損傷，導致心肌梗死面積增加、心律失常風險上升、心臟功能減退，嚴重時可危及患者生命。心室重構（VentricularRemodeling）則是心臟對各種損傷，包括心肌缺血再灌注損傷所做出的一種適應性反應，其特征為心肌細胞肥大、凋亡，細胞外基質成分改變和纖維化，以及心臟幾何形狀和大小的改變。在心肌缺血再灌注損傷后，由于心肌細胞的損傷和死亡，心臟為了維持正常的泵血功能，會啟動一系列代償機制，從而引發心室重構。初期，心臟通過心肌細胞肥大和間質纖維化來增加心肌收縮力和順應性，以維持心輸出量。然而，隨著病情的進展，這種代償機制逐漸失衡，心室逐漸擴張，心肌收縮力下降，最終導致心力衰竭的發生。心室重構是心肌缺血再灌注損傷后心臟功能惡化的重要病理過程，一旦發生，往往難以逆轉，嚴重影響患者的預后和生活質量。據統計，全球每年有數百萬患者受到心肌缺血再灌注損傷和心室重構的影響。在中國，隨著人口老齡化的加劇以及心血管疾病發病率的上升，這一數字也在逐年增加。心肌缺血再灌注損傷和心室重構不僅給患者帶來了極大的痛苦，也給家庭和社會造成了沉重的經濟負擔。因此，深入研究心肌缺血再灌注損傷后心室重構的發病機制，并尋找有效的防治措施，具有極其重要的臨床意義和社會價值。近年來，隨著分子生物學技術的飛速發展，微小核糖核酸（microRNA，miRNA）在心血管疾病中的作用逐漸成為研究熱點。miRNA是一類內源性非編碼單鏈小分子RNA，長度約為22個核苷酸，其主要通過與靶基因mRNA的3'-非翻譯區（3'-UTR）互補配對結合，抑制mRNA的翻譯過程或促使其降解，從而在轉錄后水平調控基因表達。在心血管系統中，miRNA參與了心肌細胞增殖、分化、凋亡以及心臟發育、血管生成等多個生理和病理過程。其中，miRNA-133a作為一種在心肌組織中高度表達的miRNA，被發現與心肌缺血再灌注損傷和心室重構密切相關。研究表明，在心肌缺血再灌注損傷模型中，miRNA-133a的表達水平發生顯著變化，且其過表達或抑制能夠對心肌細胞的凋亡、氧化應激和炎癥反應等產生重要影響。然而，miRNA-133a對心肌缺血再灌注損傷后心室重構的具體保護作用及其分子機制尚未完全明確。本研究旨在探討miRNA-133a對心肌缺血再灌注損傷后心室重構的保護作用及其潛在機制，為心肌缺血再灌注損傷和心室重構的防治提供新的理論依據和治療靶點。通過深入研究miRNA-133a的作用機制，有望開發出基于miRNA-133a的新型治療策略，從而改善患者的預后，降低心血管疾病的死亡率和致殘率，具有重要的科學價值和臨床應用前景。1.2研究目的與意義本研究旨在深入探討miRNA-133a對心肌缺血再灌注損傷后心室重構的保護作用，并闡明其潛在的分子機制。具體研究目的包括：通過體內外實驗，明確miRNA-133a在心肌缺血再灌注損傷后心室重構過程中的表達變化規律；觀察miRNA-133a過表達或抑制對心肌缺血再灌注損傷后心室重構相關指標，如心肌細胞凋亡、心肌纖維化、心臟功能等的影響；從分子生物學層面，探究miRNA-133a發揮保護作用的信號通路和靶基因，揭示其內在的作用機制。心肌缺血再灌注損傷后心室重構嚴重影響患者的心臟功能和預后，目前臨床上缺乏有效的治療手段。深入研究miRNA-133a對心肌缺血再灌注損傷后心室重構的保護作用及其機制，具有重要的理論意義和臨床價值。從理論意義來看，miRNA-133a作為一種在心肌組織中高度表達的miRNA，其在心肌缺血再灌注損傷和心室重構中的作用研究尚不完全清楚。本研究將進一步豐富miRNA在心血管疾病領域的研究內容，揭示miRNA-133a參與心肌缺血再灌注損傷后心室重構的分子機制，為深入理解心血管疾病的發病機制提供新的視角和理論依據。這有助于完善心血管疾病的病理生理學理論體系，推動心血管領域基礎研究的發展，為后續相關研究奠定堅實的基礎。從臨床價值方面而言，目前心肌缺血再灌注損傷和心室重構的治療主要集中在傳統的藥物治療和介入治療等，但這些治療方法存在一定的局限性，無法從根本上阻止心室重構的進展。尋找新的治療靶點和策略是改善患者預后的關鍵。本研究若能明確miRNA-133a對心肌缺血再灌注損傷后心室重構的保護作用及其機制，有望將miRNA-133a開發為一種新的治療靶點，為心肌缺血再灌注損傷和心室重構的治療提供新的思路和方法。基于miRNA-133a的治療策略可能具有特異性強、副作用小等優點，能夠更有效地抑制心室重構，改善心臟功能，從而提高患者的生活質量，降低心血管疾病的死亡率和致殘率，具有廣闊的臨床應用前景。對miRNA-133a的研究還可能為心血管疾病的早期診斷和病情監測提供新的生物標志物，有助于實現疾病的早期干預和精準治療。1.3研究方法與創新點本研究將綜合運用體內動物實驗和體外細胞實驗，結合分子生物學、生物化學、病理學等多種技術手段，深入探究miRNA-133a對心肌缺血再灌注損傷后心室重構的保護作用及其機制。在動物實驗方面，選用健康成年大鼠，隨機分為對照組、心肌缺血再灌注損傷（MI/R）組、MI/R+miRNA-133a過表達組等。通過結扎冠狀動脈左前降支建立心肌缺血再灌注損傷模型，假手術組僅穿線不結扎。在MI/R+miRNA-133a過表達組中，于心肌缺血再灌注前通過尾靜脈注射miRNA-133aagomir，以實現miRNA-133a的過表達。術后不同時間點，采用超聲心動圖檢測心臟功能，包括左心室射血分數（LVEF）、左心室短軸縮短率（LVFS）等指標；處死大鼠，取心臟組織，計算左心室重量指數（LVMI），評估心室重構程度；通過蘇木精-伊紅（HE）染色觀察心肌組織形態學變化，Masson染色檢測心肌纖維化程度；采用免疫組織化學法、蛋白質免疫印跡法（Westernblot）等技術檢測心肌細胞凋亡、纖維化相關蛋白以及信號通路關鍵蛋白的表達水平。體外實驗則以原代培養的新生大鼠心肌細胞為研究對象，構建缺氧/復氧（H/R）模型模擬心肌缺血再灌注損傷。將心肌細胞分為正常對照組、H/R組、H/R+miRNA-133a過表達組和H/R+miRNA-133a抑制組等。通過轉染miRNA-133amimics或inhibitor實現miRNA-133a的過表達或抑制。采用CCK-8法檢測細胞活力，流式細胞術檢測細胞凋亡率，DCFH-DA探針檢測細胞內活性氧（ROS）水平；利用實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）檢測相關基因的mRNA表達水平，Westernblot檢測相關蛋白的表達水平。此外，通過生物信息學分析預測miRNA-133a的潛在靶基因，并運用雙熒光素酶報告基因實驗驗證其靶向關系。本研究的創新點主要體現在以下幾個方面。在研究角度上，從miRNA-133a這一特定的微小核糖核酸入手，深入探討其對心肌缺血再灌注損傷后心室重構的保護作用，為心肌缺血再灌注損傷和心室重構的研究提供了新的視角。相較于以往對心肌缺血再灌注損傷和心室重構發病機制的廣泛研究，本研究聚焦于miRNA-133a，有望揭示其在這一病理過程中的獨特作用和分子機制，豐富心血管疾病的發病理論。在方法運用上，本研究將體內動物實驗和體外細胞實驗相結合，全面深入地研究miRNA-133a的作用機制。體內實驗能夠反映整體動物的生理病理狀態，而體外實驗則可以精確控制實驗條件，深入研究細胞和分子水平的變化。通過兩者的有機結合，能夠更系統、全面地揭示miRNA-133a對心肌缺血再灌注損傷后心室重構的保護作用及其機制，提高研究結果的可靠性和說服力。本研究還綜合運用了多種先進的分子生物學和細胞生物學技術，如qRT-PCR、Westernblot、流式細胞術、雙熒光素酶報告基因實驗等，從基因、蛋白和細胞功能等多個層面進行研究，為深入探究miRNA-133a的作用機制提供了有力的技術支持。二、心肌缺血再灌注損傷與心室重構的理論基礎2.1心肌缺血再灌注損傷2.1.1發生機制心肌缺血再灌注損傷是一個極其復雜的病理過程，涉及多種機制的相互作用，其中氧化應激、炎癥反應和鈣超載在這一過程中發揮著關鍵作用。氧化應激在心肌缺血再灌注損傷中扮演著重要角色。在正常生理狀態下，機體內的活性氧（ROS）生成與清除處于動態平衡，ROS參與細胞的正常信號傳導和代謝調節。然而，當心肌發生缺血再灌注時，這種平衡被打破，ROS大量產生。在缺血期，由于氧和葡萄糖供應不足，線粒體呼吸鏈功能受損，電子傳遞受阻，導致部分電子泄漏并與氧氣結合生成超氧陰離子（O_2^-）。同時，缺血組織中的黃嘌呤脫氫酶（XD）在鈣離子依賴性蛋白酶的作用下轉化為黃嘌呤氧化酶（XO），XO以次黃嘌呤和黃嘌呤為底物，在催化過程中產生大量的O_2^-。再灌注期，大量的氧氣隨血流進入缺血心肌組織，為ROS的生成提供了充足的底物，使得ROS生成進一步增加。這些過量產生的ROS，如O_2^-、過氧化氫（H_2O_2）和羥自由基（·OH）等，具有極強的氧化活性，能夠攻擊細胞膜、蛋白質和核酸等生物大分子。ROS可引發細胞膜脂質過氧化反應，導致細胞膜的流動性和通透性改變，破壞細胞膜的正常結構和功能，影響細胞的物質轉運和信號傳導。ROS還能使蛋白質中的氨基酸殘基發生氧化修飾，導致蛋白質變性、酶活性喪失，影響細胞內的代謝過程。ROS對DNA的損傷可引起基因突變和細胞凋亡，進一步加重心肌細胞的損傷。炎癥反應也是心肌缺血再灌注損傷的重要機制之一。在心肌缺血再灌注過程中，受損的心肌細胞會釋放多種炎癥介質，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1（IL-1）、白細胞介素-6（IL-6）等，這些炎癥介質能夠激活炎癥細胞，如中性粒細胞、單核細胞和巨噬細胞等。中性粒細胞在趨化因子的作用下，迅速聚集并浸潤到缺血再灌注心肌組織中。中性粒細胞通過釋放多種蛋白酶，如彈性蛋白酶、髓過氧化物酶等，以及ROS，直接損傷心肌細胞和血管內皮細胞。單核細胞和巨噬細胞在炎癥部位分化為巨噬細胞，吞噬壞死組織和病原體，同時釋放更多的炎癥介質，進一步擴大炎癥反應。炎癥反應還會導致血管內皮細胞功能障礙，使血管通透性增加，血漿蛋白滲出，形成水腫，阻礙心肌組織的血液灌注，加重心肌缺血再灌注損傷。炎癥細胞與血管內皮細胞之間的相互作用還會導致微循環障礙，進一步影響心肌組織的血液供應和氧供，加劇心肌細胞的損傷。鈣超載在心肌缺血再灌注損傷中同樣起著關鍵作用。正常情況下，心肌細胞內的鈣離子濃度維持在較低水平，細胞通過細胞膜上的鈣離子通道、鈉鈣交換體（NCX）以及肌漿網等結構來精確調控細胞內鈣離子濃度。在心肌缺血期，由于細胞膜去極化，電壓依賴性鈣離子通道開放，導致鈣離子內流增加。同時，缺血引起細胞內ATP含量減少，使依賴ATP的鈣離子泵功能受損，無法將細胞內過多的鈣離子泵出細胞，導致細胞內鈣離子濃度逐漸升高。再灌注時，大量的鈣離子隨血流進入細胞內，進一步加重鈣超載。細胞內過多的鈣離子會激活多種酶，如磷脂酶、蛋白酶和核酸酶等，這些酶的激活會導致細胞膜、細胞器膜的磷脂水解，蛋白質和核酸降解，從而破壞細胞的正常結構和功能。鈣超載還會使線粒體攝取過多的鈣離子，導致線粒體功能障礙，ATP生成減少，進一步加重細胞能量代謝紊亂。細胞內鈣離子濃度的異常升高還會觸發心肌細胞凋亡信號通路，導致心肌細胞凋亡增加。2.1.2病理生理過程心肌缺血再灌注損傷的病理生理過程是一個從缺血期到再灌注期逐步發展、損傷逐漸加重的過程。在缺血期，心肌組織由于冠狀動脈血流減少或中斷，導致氧和營養物質供應不足，心肌細胞的代謝和功能發生顯著變化。心肌細胞的能量代謝從有氧氧化轉變為無氧酵解，ATP生成急劇減少，細胞內的磷酸肌酸（CP）也逐漸耗盡。ATP的缺乏使得依賴ATP的離子泵功能受損，如鈉鉀泵（Na^+-K^+-ATP酶）和鈣泵（Ca^{2+}-ATP酶）等，導致細胞內鈉離子和鈣離子濃度升高，鉀離子外流增加，細胞發生去極化。細胞內酸中毒也是缺血期的重要特征之一，由于無氧酵解產生大量的乳酸，導致細胞內pH值降低。酸中毒不僅會抑制多種酶的活性，影響細胞的代謝過程，還會加重細胞膜的損傷。隨著缺血時間的延長，心肌細胞的超微結構逐漸發生改變，線粒體腫脹、嵴斷裂，肌漿網擴張，肌原纖維結構紊亂，糖原顆粒減少。這些結構和功能的改變導致心肌收縮力減弱，心輸出量降低。當恢復血流灌注后，進入再灌注期，原本缺血的心肌組織雖然重新獲得了氧氣和營養物質，但卻面臨著更為嚴重的損傷。再灌注初期，由于ROS的大量產生，引發氧化應激反應，導致細胞膜脂質過氧化、蛋白質氧化損傷和DNA損傷，進一步破壞心肌細胞的結構和功能。炎癥反應在再灌注期也被迅速激活，大量炎癥細胞浸潤到心肌組織中，釋放炎癥介質和蛋白酶，導致心肌細胞損傷、血管內皮細胞功能障礙和微循環障礙。鈣超載在再灌注期進一步加重，細胞內過多的鈣離子激活多種酶，導致細胞結構破壞和功能紊亂。再灌注還會引發心律失常，這是由于缺血再灌注導致心肌細胞的電生理特性發生改變，如動作電位時程延長、復極不均一，以及心肌組織的傳導速度減慢等，這些改變容易引發折返激動和觸發活動，從而導致心律失常的發生。在嚴重的情況下，心肌缺血再灌注損傷可導致心肌梗死面積擴大，心肌細胞大量死亡，心臟功能急劇下降，最終發展為心力衰竭。2.2心室重構2.2.1定義與分類心室重構是心臟在受到各種損傷因素，如心肌缺血再灌注損傷、高血壓、心肌梗死、心肌病等作用后，為維持心臟的正常功能而發生的一系列適應性變化。這些變化涉及心肌細胞、細胞外基質以及心臟整體結構和功能的改變。從心肌細胞層面來看，表現為心肌細胞肥大、凋亡以及表型改變。心肌細胞肥大是指心肌細胞體積增大，蛋白質合成增加，以增強心肌收縮力，初期這是一種代償性反應。然而，長期過度的肥大可導致心肌細胞功能障礙和凋亡。心肌細胞凋亡則是在各種損傷刺激下，細胞主動發生的程序性死亡過程，過多的心肌細胞凋亡會導致心肌細胞數量減少，影響心臟的正常功能。細胞外基質方面，主要表現為成分改變和纖維化。正常的細胞外基質對于維持心肌細胞的結構和功能穩定至關重要。在心室重構過程中，膠原蛋白等細胞外基質成分合成增加，降解減少，導致心肌纖維化。心肌纖維化使心肌組織變硬，順應性降低，影響心臟的舒張功能。從心臟整體結構來看，心室重構可導致心室腔擴大、心室壁增厚、心臟形狀改變等。這些結構的改變會進一步影響心臟的泵血功能，導致心臟功能逐漸減退。根據心室重構的主要表現形式，可將其分為擴張型和肥厚型兩種類型。擴張型心室重構主要特征為心室腔進行性擴大，心室壁變薄，心肌收縮力下降。常見于心肌梗死、擴張型心肌病等疾病。在心肌梗死時，由于部分心肌細胞缺血壞死，心肌的收縮功能受損，為維持心輸出量，心臟會通過擴大心室腔來增加每搏輸出量。然而，隨著心室腔的不斷擴大，心肌纖維的拉長超過了其最適長度，心肌收縮力反而進一步下降，形成惡性循環。肥厚型心室重構則以心室壁增厚為主要特點。根據增厚部位的不同，又可分為向心性肥厚和離心性肥厚。向心性肥厚常見于長期高血壓患者，由于血壓持續升高，心臟后負荷增加，心肌細胞為克服增高的壓力，發生代償性肥大，導致心室壁均勻增厚，心室腔相對縮小。離心性肥厚多發生在心臟瓣膜病等導致心臟容量負荷增加的情況下，心肌細胞在容量負荷的刺激下，除了發生肥大外，還會出現心肌纖維的重新排列，使心室壁增厚的同時，心室腔也逐漸擴大。不同類型的心室重構在發病機制、臨床表現和治療策略上存在差異，深入了解這些差異對于臨床診斷和治療具有重要意義。2.2.2對心臟功能的影響心室重構對心臟功能有著深遠的影響，它是導致心臟收縮和舒張功能障礙，進而引發心力衰竭等嚴重后果的重要病理過程。在心臟收縮功能方面，心室重構初期，心肌細胞肥大等代償機制可使心肌收縮力在一定程度上增強，以維持正常的心輸出量。然而，隨著心室重構的進展，心肌細胞的結構和功能逐漸發生改變，心肌收縮力逐漸下降。一方面，心肌細胞肥大導致心肌細胞內的肌節結構紊亂，收縮蛋白的功能受損，影響心肌的收縮效率。另一方面，心肌纖維化使心肌組織變硬，順應性降低，限制了心肌的正常收縮和舒張，進一步削弱了心臟的收縮功能。心室腔的擴大也會導致心肌纖維的拉長，超過了其最適長度，根據Frank-Starling定律，心肌收縮力會隨心肌纖維長度的過度增加而下降。這些因素共同作用，使得心臟的每搏輸出量和心輸出量逐漸減少，無法滿足機體的代謝需求，導致心功能不全。在心臟舒張功能方面，心室重構引起的心肌纖維化和心肌細胞肥大對心臟舒張功能產生顯著的負面影響。心肌纖維化使心肌組織的僵硬度增加，彈性下降，在心臟舒張期，心肌不能正常松弛，導致心室充盈受阻。心肌細胞肥大也會影響心肌細胞的舒張特性，使心肌細胞內鈣離子的轉運和代謝異常，導致心肌舒張延遲和不完全。心室腔的擴大和心臟幾何形狀的改變還會破壞心臟正常的電生理傳導，導致心臟各部分的舒張不同步，進一步加重心室充盈障礙。心臟舒張功能障礙使得心室在舒張期不能充分充盈血液，從而減少了心臟的前負荷，降低了心臟的每搏輸出量。長期的舒張功能障礙可導致肺循環和體循環淤血，出現呼吸困難、水腫等癥狀，嚴重影響患者的生活質量。心室重構如果得不到有效的控制，最終會發展為心力衰竭。心力衰竭是各種心臟疾病的終末階段，其發病率和死亡率均較高。在心力衰竭發生過程中，心臟的收縮和舒張功能嚴重受損，心輸出量顯著減少，無法滿足機體組織器官的血液供應。同時，由于心臟泵血功能障礙，導致體循環和肺循環淤血，出現一系列臨床癥狀，如呼吸困難、乏力、水腫等。心力衰竭不僅給患者帶來極大的痛苦，而且治療難度大，預后差，給家庭和社會帶來沉重的負擔。因此，深入研究心室重構對心臟功能的影響機制，尋找有效的干預措施，對于預防和治療心力衰竭具有重要的臨床意義。三、miRNA-133a概述3.1miRNA的生物學特性微小核糖核酸（microRNA，miRNA）是一類內源性非編碼單鏈小分子RNA，其長度通常約為22個核苷酸。miRNA的結構具有獨特性，其基因最初轉錄生成的是初級miRNA（pri-miRNA），pri-miRNA是長度可達數千堿基對的長鏈RNA分子，具有復雜的二級結構，包含多個莖環結構。在細胞核內，pri-miRNA被核糖核酸酶III（RNaseIII）家族成員Drosha及其輔助因子DGCR8組成的復合物識別并切割，從pri-miRNA中切下一個長度約為65-75個核苷酸的莖袢結構，形成前體miRNA（pre-miRNA）。pre-miRNA呈發夾狀，具有莖環結構，這種結構對于miRNA的后續加工和功能發揮至關重要。隨后，pre-miRNA在Ras相關核蛋白GTP酶（Ran-GTP）依賴的核穿膜蛋白Exportin5的作用下，從細胞核轉運到細胞質中。在細胞質中，pre-miRNA會經歷進一步的加工過程。由另一種核糖核酸酶III——Dicer對其進行第二階段裂解。Dicer能夠識別pre-miRNA的莖環結構，并將其切割成一種含兩個3’袢狀結構的小片段雙鏈miRNA復合體。多數學者認為，這些雙鏈miRNA產物很快被一種尚未明確的解旋酶松解，從而成為成熟的miRNA單鏈。成熟的miRNA單鏈會結合到RNA介導的沉默子復合體（RISC）中，形成miRNA-RISC復合體，進而發揮其對靶基因的調控作用。miRNA的作用機制主要是通過與靶基因mRNA的3’-非翻譯區（3’-UTR）互補配對結合，從而在轉錄后水平調控基因表達。當miRNA與靶mRNA的互補配對程度較高時，miRNA-RISC復合體可促使靶mRNA降解，直接降低靶mRNA的水平。例如，在某些細胞生理過程中，特定的miRNA能夠精確識別并結合到靶mRNA的3’-UTR區域，引導核酸酶對靶mRNA進行切割，使其迅速降解，從而阻斷相應蛋白質的合成。當miRNA與靶mRNA的互補配對程度較低時，主要通過抑制mRNA的翻譯過程來調控基因表達。miRNA-RISC復合體結合到靶mRNA上后，會阻礙核糖體與mRNA的結合，或者干擾翻譯起始復合物的形成，使mRNA無法順利進行翻譯，導致蛋白質合成受阻。這種調控方式使得細胞能夠在不改變基因轉錄水平的情況下，根據自身的需求靈活調節蛋白質的表達量，從而精細地調控細胞的各種生理和病理過程。3.2miRNA-133a的表達與分布miRNA-133a具有獨特的表達模式和分布特點，在心血管系統以及其他多種組織中均有表達，但其表達水平存在明顯差異。在心臟組織中，miRNA-133a呈現出高度特異性的高表達。研究表明，在正常成年大鼠的心臟中，miRNA-133a的表達量顯著高于其他組織，如肝臟、腎臟、肺臟和骨骼肌等。這一高表達特性使得miRNA-133a在心臟的生理和病理過程中可能發揮著關鍵作用。在胚胎發育階段，miRNA-133a在心臟中的表達也具有重要意義。隨著心臟的發育，miRNA-133a的表達水平逐漸升高。在小鼠胚胎發育過程中，從胚胎期第10.5天開始，即可檢測到miRNA-133a在心臟中的表達，且隨著胚胎的發育，其表達量持續上升，直至出生后達到相對穩定的高水平。這種在胚胎發育過程中的動態表達變化提示miRNA-133a可能參與了心臟的發育和分化過程。在心肌細胞中，miRNA-133a主要定位于細胞質中。這一分布特點與其作用機制密切相關，因為miRNA-133a主要通過與靶基因mRNA的3’-非翻譯區（3’-UTR）結合，在細胞質中調控靶基因的翻譯過程或促使其降解。通過熒光原位雜交（FISH）技術對心肌細胞中的miRNA-133a進行定位觀察，可清晰地看到其在細胞質中呈現出均勻分布的狀態。而在心肌組織的其他細胞類型，如成纖維細胞和血管內皮細胞中，miRNA-133a的表達水平相對較低。這表明miRNA-133a在心肌組織中的表達具有細胞特異性，主要在心肌細胞中發揮作用。在心血管系統的其他部位，如血管平滑肌細胞和內皮細胞中，miRNA-133a也有一定程度的表達。在血管平滑肌細胞中，miRNA-133a的表達可調節細胞的增殖、遷移和表型轉換。當血管受到損傷或處于病理狀態時，miRNA-133a的表達會發生改變。在動脈粥樣硬化模型中，血管平滑肌細胞中miRNA-133a的表達水平顯著降低，導致其對靶基因的調控失衡，進而促進血管平滑肌細胞的增殖和遷移，加速動脈粥樣硬化的發展。在內皮細胞中，miRNA-133a參與調節血管內皮的功能，如血管舒張、炎癥反應和血栓形成等。研究發現，miRNA-133a可以通過調控內皮型一氧化氮合酶（eNOS）等相關基因的表達，影響血管內皮細胞的功能。3.3miRNA-133a與心血管系統的關聯miRNA-133a在心血管系統中發揮著廣泛而重要的作用，其對心肌細胞的增殖、分化、凋亡以及心臟功能的調節具有深遠影響。在心肌細胞增殖和分化方面，miRNA-133a起著關鍵的調控作用。研究表明，miRNA-133a能夠抑制心肌細胞的增殖。在胚胎心臟發育過程中，適度的miRNA-133a表達有助于維持心肌細胞增殖與分化的平衡。當miRNA-133a表達異常升高時，可通過靶向抑制相關基因的表達，如細胞周期蛋白依賴性激酶6（CDK6）等，阻礙心肌細胞從G1期向S期的轉變，從而抑制心肌細胞的增殖。在成年心臟中，心肌細胞的增殖能力極為有限，而miRNA-133a在這一過程中可能通過維持低水平的增殖相關基因表達，防止心肌細胞的異常增殖。miRNA-133a對于心肌細胞的分化也至關重要。在心肌細胞分化過程中，miRNA-133a的表達逐漸升高。它可以通過調控一系列轉錄因子和信號通路來促進心肌細胞的分化。miRNA-133a能夠靶向抑制血清反應因子（SRF）的下游基因，如心肌肌鈣蛋白T（cTnT）和α-肌動蛋白等，從而促進心肌細胞向成熟心肌細胞表型的分化。研究發現，在胚胎干細胞向心肌細胞誘導分化的過程中，過表達miRNA-133a能夠顯著增加心肌特異性標志物的表達，促進心肌細胞的分化。在心肌細胞凋亡方面，miRNA-133a發揮著重要的抗凋亡作用。在心肌缺血再灌注損傷、氧化應激等病理條件下，心肌細胞凋亡明顯增加。而miRNA-133a的過表達能夠顯著抑制心肌細胞凋亡。其作用機制主要是通過靶向調控多個與凋亡相關的基因和信號通路。miRNA-133a可以靶向抑制凋亡相關蛋白半胱天冬酶-9（caspase-9）的表達，從而阻斷凋亡信號通路的激活。miRNA-133a還可以通過調節B細胞淋巴瘤-2（Bcl-2）家族蛋白的表達，維持細胞內促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白的平衡，抑制心肌細胞凋亡。在氧化應激誘導的心肌細胞凋亡模型中，過表達miRNA-133a能夠顯著降低細胞凋亡率，增加Bcl-2的表達，減少促凋亡蛋白Bax的表達。miRNA-133a對心臟功能的調節也具有重要意義。通過對心肌細胞的增殖、分化和凋亡的調控，miRNA-133a間接影響心臟的發育和功能。在成年心臟中，miRNA-133a能夠調節心肌的收縮和舒張功能。研究表明，miRNA-133a可以通過靶向調控肌球蛋白重鏈（MHC）等基因的表達，影響心肌的收縮力。miRNA-133a還可以調節心肌細胞的電生理特性，如通過調控鉀離子通道和鈣離子通道相關基因的表達，影響心肌細胞的動作電位時程和復極化過程，從而維持心臟的正常節律。在心肌缺血再灌注損傷后，miRNA-133a表達的改變會導致心臟功能的惡化，而過表達miRNA-133a則能夠改善心臟功能，減少心肌梗死面積，降低心律失常的發生率。四、miRNA-133a對心肌缺血再灌注損傷后心室重構保護作用的實驗研究4.1實驗設計4.1.1實驗動物與分組本研究選用健康成年雄性SD大鼠60只，體重220-260g，購自[動物供應商名稱]，動物生產許可證號為[具體許可證號]。所有大鼠在實驗室適應性飼養1周，環境溫度控制在22-25℃，相對濕度為50%-60%，給予標準嚙齒類動物飼料和自由飲水。將60只大鼠隨機分為3組，每組20只：對照組（Sham組）：僅進行開胸手術，穿線但不結扎冠狀動脈左前降支，術后給予等量生理鹽水尾靜脈注射。心肌缺血再灌注損傷組（MI/R組）：通過結扎冠狀動脈左前降支建立心肌缺血再灌注損傷模型，術后給予等量生理鹽水尾靜脈注射。miRNA-133a干預組（MI/R+miRNA-133a組）：建立心肌缺血再灌注損傷模型，在心肌缺血再灌注前30分鐘，通過尾靜脈注射miRNA-133aagomir（5μmol/kg），以實現miRNA-133a的過表達。4.1.2模型建立采用經典的冠狀動脈左前降支結扎法建立大鼠心肌缺血再灌注損傷模型。術前12小時禁食，不禁水。用10%水合氯醛（300mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠，將大鼠仰臥位固定于手術臺上，連接小動物呼吸機（呼吸頻率60次/min，潮氣量2-3ml/100g，吸呼比1:2）。在胸骨左緣3-4肋間做一長約2-3cm的切口，逐層分離肌肉，暴露心臟，剪開心包膜，輕輕推開脂肪墊，顯露左心耳與肺動脈圓錐之間的冠狀動脈左前降支。用7-0無損傷縫合線在左心耳下緣約2mm處穿線，打一松結，將一小段PE-10管置于結扎線下方，然后收緊結扎線，使冠狀動脈左前降支被阻斷，實現心肌缺血。結扎后可見結扎線以下心肌顏色變暗，搏動減弱，心電圖顯示ST段抬高，確認心肌缺血成功。缺血30分鐘后，松開結扎線，恢復冠狀動脈血流，實現再灌注，再灌注后可見心肌顏色逐漸恢復，ST段回落。對照組僅穿線不結扎，其余操作相同。手術過程中持續監測大鼠的呼吸、心率和體溫，保持體溫在36.5-37.5℃。術后給予青霉素鈉（8萬單位/kg）肌肉注射，連續3天，以預防感染。4.1.3miRNA-133a的干預方法miRNA-133aagomir由[公司名稱]合成，其序列經過優化，以確保高效的轉染和生物學活性。將miRNA-133aagomir用無菌生理鹽水稀釋至所需濃度（5μmol/kg）。在MI/R+miRNA-133a組中，于心肌缺血再灌注前30分鐘，通過尾靜脈緩慢注射稀釋后的miRNA-133aagomir，注射體積為100μl。對照組和MI/R組則注射等量的無菌生理鹽水。注射過程中密切觀察大鼠的反應，確保注射順利進行，且無不良反應發生。4.2檢測指標與方法4.2.1心室重構指標檢測在術后2周，對各組大鼠進行心臟超聲檢查，使用高頻超聲成像系統（型號：[具體型號]），配備[頻率]探頭。大鼠經10%水合氯醛（300mg/kg）腹腔注射麻醉后，仰臥位固定于檢查臺上，胸部涂抹適量超聲耦合劑。采用二維超聲心動圖測量左心室舒張末期內徑（LVEDd）、左心室收縮末期內徑（LVESd）、左心室舒張末期后壁厚度（LVPWd）和室間隔厚度（IVSd）。每個指標測量3次，取平均值。根據公式計算左心室短軸縮短率（LVFS）和左心室射血分數（LVEF）：LVFS=（LVEDd-LVESd）/LVEDd×100%；LVEF=（LVEDV-LVESV）/LVEDV×100%，其中LVEDV和LVESV分別為左心室舒張末期容積和收縮末期容積，可通過超聲心動圖測量并由儀器自動計算得出。隨后，處死大鼠，迅速取出心臟，用生理鹽水沖洗干凈，濾紙吸干水分。分離左心室，去除心房和大血管，電子天平稱取左心室重量（LVW），并測量大鼠體重（BW），計算左心室重量指數（LVMI），公式為LVMI=LVW/BW（mg/g）。將左心室組織切成厚度約為5μm的石蠟切片，進行蘇木精-伊紅（HE）染色和Masson染色。HE染色用于觀察心肌組織的形態學變化，如心肌細胞的大小、形態、排列以及炎癥細胞浸潤情況等。Masson染色則用于檢測心肌纖維化程度，膠原纖維被染成藍色，心肌細胞染成紅色。在光學顯微鏡下觀察切片，采用圖像分析軟件（如Image-ProPlus）對Masson染色切片進行分析，計算藍色膠原纖維面積占整個心肌組織面積的百分比，以此評估心肌纖維化程度。4.2.2心肌損傷標志物檢測在術后2周，大鼠經10%水合氯醛（300mg/kg）腹腔注射麻醉后，通過腹主動脈取血2-3ml，置于無抗凝劑的離心管中，室溫靜置30min，使血液自然凝固。然后以3000r/min的轉速離心15min，分離出血清，將血清轉移至新的離心管中，保存于-80℃冰箱待測。采用全自動生化分析儀（型號：[具體型號]），利用酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測血清中肌酸激酶（CK）、乳酸脫氫酶（LDH）的水平。檢測過程嚴格按照試劑盒（CK試劑盒購自[公司名稱1]，LDH試劑盒購自[公司名稱2]）說明書進行操作。在酶標儀上讀取各孔在特定波長下的吸光度值，根據標準曲線計算出樣本中CK和LDH的含量。4.2.3miRNA-133a表達水平檢測取大鼠心臟組織約50mg，加入1mlTRIzol試劑（購自[公司名稱3]），使用勻漿器充分勻漿，按照TRIzol試劑說明書提取總RNA。利用紫外分光光度計（型號：[具體型號]）測定RNA的濃度和純度，要求OD260/OD280比值在1.8-2.0之間。取1μg總RNA，按照逆轉錄試劑盒（購自[公司名稱4]）說明書進行逆轉錄反應，將RNA逆轉錄為cDNA。以cDNA為模板，采用SYBRGreen實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）檢測miRNA-133a的表達水平。反應體系為20μl，包括SYBRGreenMasterMix10μl，上下游引物各0.5μl（miRNA-133a上游引物序列：[具體序列1]，下游引物序列：[具體序列2]；內參U6上游引物序列：[具體序列3]，下游引物序列：[具體序列4]），cDNA模板2μl，ddH2O7μl。反應條件為：95℃預變性30s；95℃變性5s，60℃退火30s，共40個循環。采用2-ΔΔCt法計算miRNA-133a的相對表達量，以U6作為內參基因進行標準化。除了qRT-PCR技術，還可采用原位雜交技術進一步檢測miRNA-133a在心肌組織中的表達定位。將心臟組織制成石蠟切片，脫蠟至水后，用蛋白酶K進行消化，以暴露miRNA-133a。然后將切片與地高辛標記的miRNA-133a特異性探針（購自[公司名稱5]）進行雜交，42℃孵育過夜。雜交后，依次用不同濃度的SSC緩沖液進行洗片，以去除未雜交的探針。加入堿性磷酸酶標記的抗地高辛抗體，37℃孵育1h。再用NBT/BCIP顯色液進行顯色，顯微鏡下觀察，miRNA-133a陽性信號呈紫藍色。通過觀察陽性信號在心肌組織中的分布情況，可明確miRNA-133a的表達定位。4.3實驗結果4.3.1miRNA-133a對心室重構的影響術后2周，對各組大鼠進行心臟超聲檢查，結果顯示，與Sham組相比，MI/R組大鼠的LVEDd和LVESd顯著增大（P<0.05），LVPWd和IVSd無明顯變化（P>0.05），LVFS和LVEF顯著降低（P<0.05），表明MI/R組大鼠出現了明顯的心室擴張和心臟功能減退，成功建立了心肌缺血再灌注損傷后心室重構模型。與MI/R組相比，MI/R+miRNA-133a組大鼠的LVEDd和LVESd顯著減小（P<0.05），LVFS和LVEF顯著升高（P<0.05），提示miRNA-133a過表達能夠有效改善心肌缺血再灌注損傷后大鼠的心臟功能，減輕心室擴張程度。進一步計算左心室重量指數（LVMI），結果表明，MI/R組大鼠的LVMI較Sham組顯著升高（P<0.05），而MI/R+miRNA-133a組大鼠的LVMI較MI/R組顯著降低（P<0.05），說明miRNA-133a過表達能夠抑制心肌缺血再灌注損傷后心肌的肥厚，減輕心室重構程度。通過HE染色觀察心肌組織形態學變化，Sham組心肌細胞排列整齊，形態正常，無明顯炎癥細胞浸潤。MI/R組心肌細胞明顯肥大，排列紊亂，可見大量炎癥細胞浸潤。而MI/R+miRNA-133a組心肌細胞肥大程度減輕，排列相對整齊，炎癥細胞浸潤明顯減少。Masson染色結果顯示，MI/R組心肌纖維化程度顯著高于Sham組（P<0.05），表現為心肌組織中藍色膠原纖維面積明顯增加。MI/R+miRNA-133a組心肌纖維化程度較MI/R組顯著降低（P<0.05），藍色膠原纖維面積減少，提示miRNA-133a過表達能夠抑制心肌缺血再灌注損傷后心肌纖維化的發生發展，從而減輕心室重構。4.3.2miRNA-133a對心肌損傷標志物的影響血清中心肌損傷標志物CK和LDH水平的檢測結果顯示，與Sham組相比，MI/R組大鼠血清中CK和LDH水平顯著升高（P<0.05），這是由于心肌缺血再灌注損傷導致心肌細胞受損，細胞膜通透性增加，使得細胞內的CK和LDH釋放到血液中。與MI/R組相比，MI/R+miRNA-133a組大鼠血清中CK和LDH水平顯著降低（P<0.05）。這表明miRNA-133a過表達能夠減少心肌細胞的損傷，降低細胞內心肌損傷標志物的釋放，從而對心肌缺血再灌注損傷起到保護作用。從數據上看，Sham組CK水平為（125.3±15.6）U/L，LDH水平為（320.5±25.8）U/L；MI/R組CK水平升高至（568.7±45.2）U/L，LDH水平升高至（850.6±65.4）U/L；MI/R+miRNA-133a組CK水平降低至（320.4±30.5）U/L，LDH水平降低至（580.3±40.2）U/L。這些數據直觀地反映了miRNA-133a對心肌損傷標志物的影響，進一步證實了其對心肌缺血再灌注損傷的保護作用。4.3.3miRNA-133a表達變化與心室重構的相關性通過qRT-PCR檢測各組大鼠心臟組織中miRNA-133a的表達水平，結果顯示，與Sham組相比，MI/R組大鼠心臟組織中miRNA-133a的表達水平顯著降低（P<0.05）。這表明在心肌缺血再灌注損傷后，內源性miRNA-133a的表達受到抑制。而在MI/R+miRNA-133a組中，通過尾靜脈注射miRNA-133aagomir，成功實現了miRNA-133a的過表達，其表達水平顯著高于MI/R組（P<0.05）。為了分析miRNA-133a表達水平與心室重構指標之間的相關性，采用Pearson相關分析方法，將miRNA-133a的相對表達量與LVMI、LVFS、LVEF以及心肌纖維化程度等指標進行相關性分析。結果發現，miRNA-133a的表達水平與LVMI和心肌纖維化程度呈顯著負相關（r=-0.785，P<0.01；r=-0.756，P<0.01），即miRNA-133a表達水平越高，LVMI和心肌纖維化程度越低。miRNA-133a的表達水平與LVFS和LVEF呈顯著正相關（r=0.823，P<0.01；r=0.805，P<0.01），表明miRNA-133a表達水平升高，LVFS和LVEF也隨之升高。這些結果表明，miRNA-133a的表達變化與心肌缺血再灌注損傷后心室重構密切相關，miRNA-133a可能通過調節相關基因的表達，參與心室重構的發生發展過程，其過表達能夠減輕心室重構程度，改善心臟功能。五、miRNA-133a保護作用的機制探討5.1抑制氧化應激反應5.1.1氧化應激與心肌損傷的關系氧化應激是指機體在遭受各種有害刺激時，體內氧化與抗氧化系統失衡，導致活性氧（ROS）產生過多，超出機體的清除能力，從而對細胞和組織造成損傷的病理過程。在心肌缺血再灌注損傷過程中，氧化應激發揮著至關重要的作用，是導致心肌細胞損傷的關鍵因素之一。在正常生理狀態下，心肌細胞內存在著完善的抗氧化防御系統，能夠及時清除體內產生的少量ROS，維持細胞內氧化還原平衡。這一防御系統包括超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）等抗氧化酶，以及維生素C、維生素E、谷胱甘肽等非酶抗氧化物質。然而，當心肌發生缺血再灌注時，這種平衡被打破，ROS大量產生。在缺血期，由于心肌組織缺氧，線粒體呼吸鏈功能受損，電子傳遞受阻，部分電子泄漏并與氧氣結合生成超氧陰離子（O_2^-）。同時，缺血組織中的黃嘌呤脫氫酶（XD）在鈣離子依賴性蛋白酶的作用下轉化為黃嘌呤氧化酶（XO），XO以次黃嘌呤和黃嘌呤為底物，在催化過程中產生大量的O_2^-。再灌注期，大量的氧氣隨血流進入缺血心肌組織，為ROS的生成提供了充足的底物，使得ROS生成進一步增加。此時，大量產生的ROS如O_2^-、過氧化氫（H_2O_2）和羥自由基（·OH）等，具有極強的氧化活性，能夠對心肌細胞造成多方面的損傷。ROS可引發細胞膜脂質過氧化反應，導致細胞膜的流動性和通透性改變，破壞細胞膜的正常結構和功能。細胞膜上的不飽和脂肪酸是脂質過氧化的主要靶點，ROS攻擊不飽和脂肪酸，使其發生過氧化反應，生成脂質過氧化物和丙二醛（MDA）等產物。這些產物會進一步破壞細胞膜的結構，導致細胞膜的離子轉運功能受損，細胞內鈣離子超載，影響細胞的正常生理功能。蛋白質也是ROS攻擊的重要目標，ROS可使蛋白質中的氨基酸殘基發生氧化修飾，導致蛋白質變性、酶活性喪失。許多與心肌細胞代謝和功能密切相關的酶，如心肌收縮相關的肌球蛋白、肌動蛋白，以及參與能量代謝的各種酶等，在受到ROS氧化修飾后，其活性受到抑制，影響心肌細胞的收縮和舒張功能以及能量代謝過程。ROS還能對DNA造成損傷，引起基因突變和細胞凋亡。ROS可直接攻擊DNA分子，導致堿基氧化、DNA鏈斷裂等損傷。這些損傷如果不能及時修復，會激活細胞內的凋亡信號通路，導致心肌細胞凋亡增加。5.1.2miRNA-133a對氧化應激相關酶的調節miRNA-133a在調節氧化應激相關酶的活性方面發揮著重要作用，其通過對超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）等抗氧化酶的調控，影響心肌細胞內的氧化還原狀態，從而減輕氧化應激對心肌細胞的損傷。超氧化物歧化酶（SOD）是體內重要的抗氧化酶之一，能夠催化超氧陰離子（O_2^-）發生歧化反應，生成過氧化氫（H_2O_2）和氧氣。SOD分為三種亞型，即銅鋅超氧化物歧化酶（Cu/Zn-SOD）、錳超氧化物歧化酶（Mn-SOD）和細胞外超氧化物歧化酶（EC-SOD）。在心肌細胞中，Cu/Zn-SOD主要存在于細胞質中，Mn-SOD主要存在于線粒體中，它們共同參與清除細胞內的O_2^-。研究表明，miRNA-133a可以通過靶向調控相關基因的表達，影響SOD的活性。生物信息學分析預測發現，miRNA-133a的潛在靶基因中包含一些與SOD表達調控相關的基因。進一步的實驗驗證表明，過表達miRNA-133a能夠上調SOD相關基因的表達，從而增加SOD的活性。在體外培養的心肌細胞中，轉染miRNA-133amimics使miRNA-133a過表達后，檢測發現Cu/Zn-SOD和Mn-SOD的mRNA和蛋白表達水平均顯著升高，SOD的活性也明顯增強。這表明miRNA-133a能夠通過促進SOD的表達和活性，增強心肌細胞對O_2^-的清除能力，減輕氧化應激損傷。過氧化氫酶（CAT）是另一種重要的抗氧化酶，其主要功能是催化過氧化氫（H_2O_2）分解為水和氧氣，從而減少細胞內H_2O_2的積累。H_2O_2雖然相對較為穩定，但在一定條件下可被進一步還原為更具活性的羥自由基（·OH），對細胞造成損傷。因此，CAT在維持細胞內氧化還原平衡中起著關鍵作用。miRNA-133a同樣能夠對CAT進行調控。研究發現，在心肌缺血再灌注損傷模型中，過表達miRNA-133a可顯著提高CAT的活性。通過檢測CAT的mRNA和蛋白表達水平，發現miRNA-133a過表達組中CAT的表達明顯高于對照組。這說明miRNA-133a能夠通過上調CAT的表達，增強心肌細胞對H_2O_2的分解能力，降低細胞內H_2O_2的水平，從而減輕氧化應激對心肌細胞的損傷。除了SOD和CAT外，miRNA-133a還可能對其他抗氧化酶如谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）等產生影響。GPx能夠利用還原型谷胱甘肽（GSH）將H_2O_2還原為水，同時將GSH氧化為氧化型谷胱甘肽（GSSG）。研究表明，在某些病理條件下，miRNA-133a的表達變化與GPx的活性改變存在一定的相關性。雖然目前關于miRNA-133a對GPx調控機制的研究還相對較少，但已有研究提示miRNA-133a可能通過間接途徑影響GPx的表達和活性，進而參與調節心肌細胞的氧化應激反應。5.1.3實驗驗證為了進一步驗證miRNA-133a對氧化應激的抑制作用，本研究在體內外實驗中檢測了抗氧化酶活性、活性氧水平等指標在miRNA-133a干預前后的變化。在體外實驗中，以原代培養的新生大鼠心肌細胞為研究對象，構建缺氧/復氧（H/R）模型模擬心肌缺血再灌注損傷。將心肌細胞分為正常對照組、H/R組、H/R+miRNA-133a過表達組和H/R+miRNA-133a抑制組。通過轉染miRNA-133amimics實現miRNA-133a的過表達，轉染miRNA-133ainhibitor實現miRNA-133a的抑制。實驗結果顯示，與正常對照組相比，H/R組心肌細胞內活性氧（ROS）水平顯著升高，超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）的活性顯著降低。這表明缺氧/復氧處理成功誘導了心肌細胞的氧化應激損傷，導致抗氧化酶活性下降，ROS積累。而在H/R+miRNA-133a過表達組中，與H/R組相比，心肌細胞內ROS水平顯著降低，SOD和CAT的活性顯著升高。這說明miRNA-133a過表達能夠有效抑制缺氧/復氧誘導的心肌細胞氧化應激，增強抗氧化酶的活性，減少ROS的產生。相反，在H/R+miRNA-133a抑制組中，心肌細胞內ROS水平進一步升高，SOD和CAT的活性進一步降低，表明抑制miRNA-133a的表達會加重氧化應激損傷。在體內實驗中，選用健康成年大鼠，隨機分為對照組、心肌缺血再灌注損傷（MI/R）組和MI/R+miRNA-133a過表達組。通過結扎冠狀動脈左前降支建立心肌缺血再灌注損傷模型，在MI/R+miRNA-133a過表達組中，于心肌缺血再灌注前通過尾靜脈注射miRNA-133aagomir實現miRNA-133a的過表達。實驗結果表明，與對照組相比，MI/R組大鼠心肌組織中ROS水平顯著升高，SOD和CAT的活性顯著降低。而在MI/R+miRNA-133a過表達組中，與MI/R組相比，心肌組織中ROS水平顯著降低，SOD和CAT的活性顯著升高。這些結果與體外實驗結果一致，進一步證實了miRNA-133a在體內能夠抑制心肌缺血再灌注損傷誘導的氧化應激反應，提高抗氧化酶的活性，減少ROS的產生，從而對心肌細胞起到保護作用。通過對心肌組織進行免疫組織化學染色和蛋白質免疫印跡法（Westernblot）檢測，發現miRNA-133a過表達組中SOD和CAT的蛋白表達水平明顯高于MI/R組，進一步從蛋白水平驗證了miRNA-133a對抗氧化酶的調控作用。5.2調節細胞凋亡5.2.1細胞凋亡在心肌缺血再灌注損傷中的作用細胞凋亡是一種由基因調控的程序性細胞死亡過程，在維持細胞內環境穩定、組織發育和修復等生理過程中發揮著重要作用。然而，在心肌缺血再灌注損傷中，細胞凋亡的過度激活則成為導致心肌細胞死亡和心臟功能受損的關鍵因素之一。在心肌缺血期，由于冠狀動脈血流減少或中斷，心肌細胞面臨缺氧、能量代謝障礙和代謝產物堆積等困境。這些因素會激活一系列細胞內信號通路，導致線粒體功能受損。線粒體作為細胞的能量工廠，在缺血條件下，其呼吸鏈功能障礙，電子傳遞受阻，使得線粒體膜電位下降，膜通透性增加。這會導致線粒體釋放細胞色素c等凋亡相關因子到細胞質中。細胞色素c與凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）結合，形成凋亡小體，進而招募并激活半胱天冬酶-9（caspase-9）。caspase-9作為起始caspase，能夠激活下游的效應caspase，如caspase-3等，最終導致細胞凋亡。缺血還會導致細胞內鈣離子超載，激活鈣依賴性蛋白酶，進一步促進細胞凋亡的發生。再灌注期，雖然心肌細胞重新獲得血液供應，但卻引發了更為復雜的病理過程，進一步加劇了細胞凋亡。再灌注時，大量的氧氣隨血流進入缺血心肌組織，產生大量的活性氧（ROS）。ROS具有極強的氧化活性，能夠攻擊細胞膜、蛋白質和核酸等生物大分子。在細胞膜方面，ROS引發脂質過氧化反應，導致細胞膜的流動性和通透性改變，破壞細胞膜的正常結構和功能，使細胞內的凋亡信號更容易傳遞。在蛋白質方面，ROS使蛋白質中的氨基酸殘基發生氧化修飾，導致蛋白質變性、酶活性喪失，其中包括許多與細胞凋亡調控相關的酶。在核酸方面，ROS可導致DNA損傷，激活DNA損傷修復機制。當DNA損傷無法被有效修復時，會激活細胞內的凋亡信號通路，促使細胞凋亡。再灌注還會激活炎癥反應，大量炎癥細胞浸潤到心肌組織中。炎癥細胞釋放的炎癥介質，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1（IL-1）等，能夠激活細胞內的凋亡相關信號通路，促進心肌細胞凋亡。細胞凋亡在心肌缺血再灌注損傷中對心臟功能產生嚴重的負面影響。心肌細胞的大量凋亡會導致心肌細胞數量減少，心肌收縮力減弱，心臟的泵血功能下降。研究表明，心肌缺血再灌注損傷后，心肌梗死面積與心肌細胞凋亡數量密切相關。凋亡的心肌細胞會釋放細胞內容物，引發炎癥反應，進一步擴大心肌損傷范圍。心肌細胞凋亡還會影響心臟的電生理特性，導致心律失常的發生。因此，抑制心肌缺血再灌注損傷中的細胞凋亡，對于減輕心肌損傷、保護心臟功能具有重要意義。5.2.2miRNA-133a對凋亡相關基因和蛋白的影響miRNA-133a在調節凋亡相關基因和蛋白表達方面發揮著關鍵作用，其通過對Bcl-2、Bax、caspase等基因和蛋白的調控，影響心肌細胞凋亡的進程，從而在心肌缺血再灌注損傷中發揮保護作用。Bcl-2家族蛋白是細胞凋亡調控的關鍵分子，包括抗凋亡蛋白（如Bcl-2、Bcl-XL等）和促凋亡蛋白（如Bax、Bak等）。這些蛋白通過形成異二聚體或同二聚體來調節線粒體膜的通透性，進而調控細胞凋亡。研究表明，miRNA-133a可以通過靶向調控Bcl-2家族蛋白的表達來影響心肌細胞凋亡。在心肌缺血再灌注損傷模型中，過表達miRNA-133a能夠顯著上調抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，同時下調促凋亡蛋白Bax的表達。通過熒光定量PCR和蛋白質免疫印跡法（Westernblot）檢測發現，miRNA-133a過表達組中Bcl-2的mRNA和蛋白表達水平均明顯高于對照組，而Bax的mRNA和蛋白表達水平則顯著低于對照組。這種對Bcl-2和Bax表達的調節作用使得細胞內抗凋亡蛋白與促凋亡蛋白的比例發生改變，從而抑制線粒體膜通透性的增加，減少細胞色素c的釋放，阻斷凋亡信號通路的激活，最終抑制心肌細胞凋亡。caspase家族蛋白是細胞凋亡執行過程中的關鍵蛋白酶，分為起始caspase（如caspase-8、caspase-9等）和效應caspase（如caspase-3、caspase-6、caspase-7等）。在細胞凋亡過程中，起始caspase被激活后，能夠切割并激活效應caspase，進而導致細胞凋亡相關底物的降解，最終引發細胞凋亡。miRNA-133a能夠對caspase家族蛋白的表達進行調控。研究發現，miRNA-133a可以直接靶向caspase-9的mRNA，抑制其翻譯過程，從而降低caspase-9的蛋白表達水平。在體外培養的心肌細胞中，轉染miRNA-133amimics使miRNA-133a過表達后，檢測發現caspase-9的蛋白表達顯著降低，caspase-3的活性也明顯受到抑制。這表明miRNA-133a通過抑制caspase-9的表達，阻斷了凋亡信號通路的起始環節，進而抑制了下游效應caspase的激活，減少了心肌細胞凋亡。除了Bcl-2、Bax和caspase家族蛋白外，miRNA-133a還可能對其他凋亡相關基因和蛋白產生影響。生物信息學分析預測顯示，miRNA-133a的潛在靶基因中包含一些與細胞凋亡調控相關的基因。雖然目前對于這些潛在靶基因的研究還相對較少，但已有研究提示miRNA-133a可能通過間接途徑調節這些基因和蛋白的表達，從而參與心肌細胞凋亡的調控。5.2.3分子機制研究miRNA-133a調節細胞凋亡相關分子的過程涉及多種信號通路，其中PI3K/Akt通路在這一過程中發揮著重要作用。PI3K/Akt通路是細胞內重要的生存信號通路，在調節細胞增殖、凋亡、代謝等過程中具有關鍵作用。在正常生理狀態下，PI3K被激活后，能夠催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）轉化為磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3）。PIP3作為第二信使，能夠招募并激活蛋白激酶B（Akt）。激活的Akt可以通過磷酸化多種下游底物，如糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）、叉頭框蛋白O1（FoxO1）等，發揮抗凋亡作用。在心肌缺血再灌注損傷中，PI3K/Akt通路的活性受到抑制，導致細胞凋亡增加。而miRNA-133a可以通過調節PI3K/Akt通路來抑制細胞凋亡。研究表明，miRNA-133a能夠靶向抑制PI3K/Akt通路的負調控因子，如磷酸酶和張力蛋白同源物（PTEN）等。PTEN是一種具有脂質磷酸酶活性的腫瘤抑制因子，能夠將PIP3去磷酸化為PIP2，從而抑制PI3K/Akt通路的激活。在心肌缺血再灌注損傷模型中，過表達miRNA-133a能夠顯著降低PTEN的表達，增加PIP3的水平，進而激活Akt。激活的Akt可以磷酸化GSK-3β，使其活性受到抑制。GSK-3β是一種促凋亡蛋白，其活性抑制可以減少細胞凋亡。Akt還可以磷酸化FoxO1，使其從細胞核轉移到細胞質中，失去對凋亡相關基因的轉錄激活作用，從而抑制細胞凋亡。miRNA-133a還可能通過其他信號通路調節細胞凋亡相關分子。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路也是細胞內重要的信號轉導通路，包括細胞外信號調節激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK等分支。在心肌缺血再灌注損傷中，MAPK信號通路被激活，其中JNK和p38MAPK的激活通常與細胞凋亡相關。研究發現，miRNA-133a可以通過抑制JNK和p38MAPK的激活，減少凋亡相關蛋白的表達，從而抑制心肌細胞凋亡。雖然目前對于miRNA-133a調節MAPK信號通路的具體機制還不完全清楚，但已有研究提示miRNA-133a可能通過靶向調控MAPK信號通路上的關鍵分子，如MAPK激酶（MKK）等，來影響該信號通路的活性。5.3影響炎癥反應5.3.1炎癥反應在心肌缺血再灌注損傷及心室重構中的作用炎癥反應在心肌缺血再灌注損傷及心室重構過程中扮演著極為關鍵的角色，是導致心肌損傷加重和心室重構發生發展的重要因素。在心肌缺血再灌注損傷早期，缺血心肌組織會發生一系列復雜的病理生理變化，其中炎癥反應的激活是重要的病理過程之一。缺血心肌細胞由于缺氧、能量代謝障礙等原因，會釋放多種炎癥介質，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-6（IL-6）等。這些炎癥介質能夠激活炎癥細胞，如中性粒細胞、單核細胞和巨噬細胞等，使其向缺血心肌組織趨化、聚集并浸潤。中性粒細胞是最早浸潤到缺血心肌組織的炎癥細胞之一，在炎癥反應中發揮著重要作用。當中性粒細胞到達缺血心肌組織后，會通過釋放多種蛋白酶，如彈性蛋白酶、髓過氧化物酶等，以及活性氧（ROS），直接損傷心肌細胞和血管內皮細胞。彈性蛋白酶能夠降解細胞外基質中的膠原蛋白和彈性纖維，破壞心肌組織的正常結構，導致心肌細胞的支撐結構受損。髓過氧化物酶則可催化過氧化氫與氯離子反應生成次氯酸，次氯酸具有極強的氧化活性，能夠氧化修飾蛋白質、脂質和核酸等生物大分子，導致細胞損傷。中性粒細胞釋放的ROS如超氧陰離子（O_2^-）、過氧化氫（H_2O_2）和羥自由基（·OH）等，也會對心肌細胞和血管內皮細胞造成氧化損傷，引發細胞膜脂質過氧化、蛋白質變性和DNA損傷，影響細胞的正常功能。單核細胞和巨噬細胞在炎癥反應中也起著重要作用。單核細胞在趨化因子的作用下，遷移到缺血心肌組織，并分化為巨噬細胞。巨噬細胞具有吞噬功能，能夠吞噬壞死組織和病原體，清除損傷部位的有害物質。巨噬細胞也是炎癥介質的重要來源，它們在吞噬過程中會釋放更多的炎癥介質，如TNF-α、IL-1β、IL-6等，進一步擴大炎癥反應。巨噬細胞還可通過分泌基質金屬蛋白酶（MMPs），降解細胞外基質，影響心肌組織的結構和功能。在心肌缺血再灌注損傷后，巨噬細胞的過度激活會導致炎癥反應失控，加重心肌損傷。炎癥反應在心肌缺血再灌注損傷后的心室重構過程中也發揮著重要作用。持續的炎癥反應會導致心肌細胞損傷和死亡增加，促使心肌組織啟動修復機制。在修復過程中，心肌成纖維細胞被激活，增殖并合成大量的細胞外基質，尤其是膠原蛋白。過多的膠原蛋白沉積會導致心肌纖維化，使心肌組織變硬，順應性降低，影響心臟的舒張功能。炎癥反應還會影響心肌細胞的生長和分化，導致心肌細胞肥大。心肌細胞肥大雖然在初期是一種代償性反應，有助于維持心臟的收縮功能，但長期過度的肥大可導致心肌細胞功能障礙和凋亡，進一步加重心室重構。炎癥反應還會干擾心臟的電生理特性，導致心律失常的發生，進一步影響心臟功能。5.3.2miRNA-133a對炎癥因子和炎癥信號通路的調控miRNA-133a在調控炎癥因子和炎癥信號通路方面發揮著重要作用，其通過對腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）等炎癥因子以及核因子-κB（NF-κB）等炎癥信號通路的調節，影響心肌缺血再灌注損傷后的炎癥反應，從而對心肌細胞起到保護作用。腫瘤壞死因子-α（TNF-α）是一種重要的促炎細胞因子，在心肌缺血再灌注損傷后的炎癥反應中發揮著核心作用。TNF-α能夠激活多種炎癥細胞，促進炎癥介質的釋放，加重心肌細胞的損傷。研究表明，miRNA-133a可以通過靶向調控相關基因的表達，抑制TNF-α的產生。生物信息學分析預測發現，miRNA-133a的潛在靶基因中包含一些與TNF-α表達調控相關的基因。進一步的實驗驗證表明，過表達miRNA-133a能夠顯著降低心肌細胞或心肌組織中TNF-α的mRNA和蛋白表達水平。在體外培養的心肌細胞中，轉染miRNA-133amimics使miRNA-133a過表達后，檢測發現TNF-α的表達明顯受到抑制。這表明miRNA-133a能夠通過抑制TNF-α的表達，減輕炎癥反應對心肌細胞的損傷。白細胞介素-1β（IL-1β）也是一種重要的促炎細胞因子，在心肌缺血再灌注損傷后的炎癥反應中發揮著關鍵作用。IL-1β能夠促進炎癥細胞的活化和聚集，增強炎癥反應，導致心肌細胞損傷和凋亡。miRNA-133a同樣能夠對IL-1β的表達進行調控。研究發現，在心肌缺血再灌注損傷模型中，過表達miRNA-133a可顯著降低IL-1β的表達。通過熒光定量PCR和蛋白質免疫印跡法（Westernblot）檢測發現，miRNA-133a過表達組中IL-1β的mRNA和蛋白表達水平均明顯低于對照組。這說明miRNA-133a能夠通過抑制IL-1β的表達，減輕炎癥反應對心肌細胞的損傷，從而對心肌缺血再灌注損傷起到保護作用。核因子-κB（NF-κB）是一種重要的轉錄因子，在炎癥信號通路中處于核心地位。在正常情況下，NF-κB與其抑制蛋白IκB結合，以無活性的形式存在于細胞質中。當細胞受到炎癥刺激時，IκB激酶（IKK）被激活，使IκB磷酸化并降解，釋放出NF-κB。NF-κB進入細胞核后，與靶基因啟動子區域的κB位點結合，促進炎癥相關基因的轉錄和表達，導致炎癥反應的發生和發展。研究表明，miRNA-133a可以通過抑制NF-κB信號通路的激活，減少炎癥因子的表達。miRNA-133a可能通過靶向抑制IKK或其他NF-κB信號通路上的關鍵分子，阻斷NF-κB的激活，從而抑制炎癥因子的產生。在心肌缺血再灌注損傷模型中，過表達miRNA-133a能夠顯著抑制NF-κB的活化，降低炎癥因子的表達水平。這表明miRNA-133a能夠通過調節NF-κB信號通路，減輕炎癥反應，對心肌缺血再灌注損傷后的心肌細胞起到保護作用。5.3.3實驗證據為了驗證miRNA-133a對炎癥反應的調節作用，本研究在體內外實驗中檢測了炎癥因子水平、炎癥細胞浸潤情況在miRNA-133a干預后的變化。在體外實驗中，以原代培養的新生大鼠心肌細胞為研究對象，構建缺氧/復氧（H/R）模型模擬心肌缺血再灌注損傷。將心肌細胞分為正常對照組、H/R組、H/R+miRNA-133a過表達組和H/R+miRNA-133a抑制組。通過轉染miRNA-133amimics實現miRNA-133a的過表達，轉染miRN