人大腸癌Lovo細胞株PARG基因沉默對HUVEC血管形成能力的影響及機制探究一、引言1.1研究背景與意義大腸癌作為常見的消化道惡性腫瘤，近年來其發病率在全球范圍內呈現出顯著的上升趨勢，已成為世界上第三大惡性腫瘤，嚴重威脅人類健康。據相關數據統計，大腸癌的發病率在大城市中已躍居惡性腫瘤發病率的第二位，且發病年輕化趨勢愈發明顯。在我國，隨著生活水平的提高和飲食結構的改變，大腸癌的發病情況也不容樂觀。腫瘤的生長、浸潤和轉移依賴于新生血管的形成，血管生成在腫瘤的發展進程中扮演著至關重要的角色。血管不僅為腫瘤細胞提供必要的營養物質和氧氣，還為腫瘤細胞的轉移提供了途徑。因此，深入研究腫瘤血管生成的機制，對于開發有效的抗腫瘤治療策略具有重要意義。聚(腺苷二磷酸核糖)水解酶（PARG）是一種在細胞核中發揮重要作用的酶，參與了DNA修復、基因表達等多種生物學過程。近年來的研究發現，PARG與多種癌癥的發生和發展密切相關。在大腸癌中，PARG的表達水平與腫瘤的惡性程度呈逆相關，提示其在大腸癌的發生發展過程中可能發揮著重要的調控作用。人臍靜脈內皮細胞（HUVEC）在體外具有形成血管樣結構的能力，常被用于研究血管生成的模型。腫瘤細胞可以通過分泌各種細胞因子和信號分子，影響HUVEC的血管形成能力，從而促進腫瘤血管的生成。研究人大腸癌Lovo細胞株PARG基因沉默對HUVEC血管形成能力的影響，有助于深入了解PARG在大腸癌血管生成中的作用機制。本研究旨在通過對人大腸癌Lovo細胞株進行PARG基因沉默，觀察其對HUVEC血管形成能力的影響，并探討相關的分子機制。這不僅有助于揭示大腸癌血管生成的調控機制，為大腸癌的治療提供新的理論依據，還可能為開發針對PARG的靶向治療藥物提供實驗基礎，具有重要的理論意義和臨床應用價值。1.2研究目的本研究旨在深入探究人大腸癌Lovo細胞株中PARG基因沉默后，對HUVEC血管形成能力產生的具體影響，并全面剖析其背后潛在的分子機制。通過精準沉默Lovo細胞株中的PARG基因，觀察細胞在分子和細胞水平的變化，檢測相關信號通路關鍵蛋白以及血管生成相關因子的表達情況。運用Transwell細胞遷移實驗、CCK-8細胞增殖實驗等技術手段，定量分析HUVEC的遷移和增殖能力變化。從基因、蛋白以及細胞功能多個層面，揭示PARG基因在大腸癌血管生成過程中的關鍵作用，為大腸癌的抗血管生成治療提供全新的理論依據和潛在的治療靶點，助力開發更有效的治療策略，改善患者預后。1.3國內外研究現狀在國外，對于PARG基因的研究起步較早，諸多研究表明PARG在DNA損傷修復、細胞周期調控以及基因轉錄等生物學過程中發揮關鍵作用。在腫瘤研究領域，已有研究揭示PARG與乳腺癌、胰腺癌等多種癌癥的發生發展存在緊密聯系。如在乳腺癌細胞中，PARG的異常表達會影響細胞的增殖與凋亡過程。在腫瘤血管生成方面，國外學者針對HUVEC血管形成的研究較為深入，明確了VEGF、b-FGF等多種血管生成相關因子對HUVEC血管形成能力的促進作用，同時也發現腫瘤細胞能夠通過分泌特定因子調控HUVEC的血管形成。在國內，相關研究也在不斷推進。有研究發現，在大腸癌中PARG的表達水平與腫瘤的惡性程度呈負相關，暗示PARG可能在大腸癌的發展進程中扮演抑制角色。通過對人大腸癌組織樣本的檢測分析，發現低表達PARG的腫瘤組織往往具有更高的侵襲性和轉移潛能。在HUVEC血管形成與大腸癌關系的研究上，國內學者構建了人臍靜脈內皮細胞（HUVEC）與結直腸癌LoVo細胞共培養的三維血管生成模型，觀察到二者共培養能形成不連續的三維類毛細血管樣結構，為研究結直腸癌的血管生成過程提供了重要的體外模型。然而，當前國內外研究仍存在一些不足之處。在PARG基因與大腸癌血管生成的關系研究中，雖然已初步明確PARG在大腸癌中的表達特征及其與腫瘤惡性程度的關聯，但對于PARG基因沉默后，如何具體影響大腸癌Lovo細胞株對HUVEC血管形成能力的作用機制，尚未完全闡明。現有研究大多集中在單一信號通路或少數幾個相關因子上，缺乏對整體調控網絡的系統分析。此外，在研究方法上，體外實驗居多，體內實驗相對較少，缺乏在動物模型上的深入驗證，這使得研究結果在臨床應用的轉化上存在一定局限性。二、相關理論基礎2.1人大腸癌Lovo細胞株人大腸癌Lovo細胞株于1971年從一位診斷為結腸腺癌的56歲白人男性的左鎖骨上區轉移灶成功建系，屬于貼壁生長的上皮樣細胞，具有典型的上皮細胞形態特征，在光學顯微鏡下觀察，細胞呈多邊形或梭形，排列緊密且形態較為規則。該細胞株具有獨特的生物學特性，癌基因c-myc、K-ras、H-ras、N-ras、Myb和fos的表達呈陽性，這意味著這些癌基因的活躍表達可能與細胞的增殖、分化及腫瘤的發生發展密切相關。同時，未檢測到sis和N-myc的表達，這種基因表達模式進一步彰顯了Lovo細胞株區別于其他細胞株的特性。在腫瘤研究領域，人大腸癌Lovo細胞株發揮著不可或缺的作用。由于其來源于人體結腸腺癌轉移灶，能夠較好地模擬體內大腸癌的生物學行為，因此被廣泛應用于大腸癌發病機制的研究。研究人員通過對Lovo細胞株的深入研究，揭示了多個與大腸癌發生發展相關的信號通路。例如，在Wnt/β-catenin信號通路研究中，發現Lovo細胞中該信號通路異常激活，β-catenin蛋白在細胞核內大量積聚，進而調控一系列靶基因的表達，促進細胞的增殖和遷移。在大腸癌的治療研究中，Lovo細胞株也常被用作重要的研究模型。許多針對大腸癌的新型治療藥物研發，都以Lovo細胞株為實驗對象，進行藥物敏感性測試和作用機制探究。如某新型化療藥物在體外實驗中，能夠顯著抑制Lovo細胞的增殖，誘導細胞凋亡，進一步研究發現該藥物通過抑制腫瘤細胞的DNA合成，阻斷細胞周期進程，從而發揮抗癌作用。2.2PARG基因PARG基因，全稱聚(腺苷二磷酸核糖)水解酶（poly(ADP-ribose)glycohydrolase）基因，定位于人類基因組的10號染色體10q11.23區域，其編碼的PARG蛋白在細胞內參與一系列至關重要的生物學過程。從分子層面來看，PARG主要參與聚(ADP-核糖)（PAR）的水解過程。當細胞受到諸如紫外線照射、化學物質損傷等外界刺激時，DNA會發生損傷，此時，多聚ADP核糖聚合酶（PARP）被激活，催化煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）分解，將ADP-核糖基轉移到受體蛋白上，形成PAR鏈。PAR鏈的形成是細胞對DNA損傷的一種快速響應機制，它能夠招募一系列DNA修復蛋白到損傷位點，啟動DNA修復過程。而PARG則在這一過程中發揮著不可或缺的平衡調節作用，它能夠特異性地水解PAR鏈，將其降解為ADP-核糖單體。通過精確調控PAR的水平，PARG確保DNA修復過程的有序進行，避免PAR過度積累對細胞造成不良影響。例如，在紫外線誘導的DNA損傷修復實驗中，研究人員發現，當PARG基因被沉默后，細胞內PAR水平顯著升高，DNA修復進程受到明顯阻礙，導致細胞存活率下降。這充分說明了PARG在DNA損傷修復中的關鍵作用。在細胞凋亡過程中，PARG同樣扮演著重要角色。細胞凋亡是一種程序性細胞死亡過程，對于維持組織穩態和個體發育至關重要。PARG通過調節PAR水平，影響細胞凋亡相關信號通路。當細胞受到凋亡刺激時，PARG的活性變化會影響PAR介導的信號傳遞，進而調控細胞凋亡的進程。有研究表明，在某些腫瘤細胞中，PARG表達下調會導致細胞對凋亡信號的敏感性降低，從而促進腫瘤細胞的存活和增殖。這暗示了PARG可能作為一個潛在的腫瘤治療靶點，通過調節其活性來誘導腫瘤細胞凋亡。PARG在基因表達調控方面也具有重要意義。基因表達是遺傳信息從DNA傳遞到RNA，再到蛋白質的過程，這一過程受到嚴格而精細的調控。PARG可以通過對組蛋白等染色質相關蛋白的ADP-核糖基化修飾，改變染色質的結構和功能，進而影響基因的轉錄活性。例如，PARG能夠調節某些轉錄因子與DNA的結合能力，從而影響基因轉錄的起始和延伸。在胚胎發育過程中，PARG對基因表達的調控作用尤為關鍵，它參與調控一系列與細胞分化、器官形成相關基因的表達，確保胚胎正常發育。若PARG基因發生突變或表達異常，可能導致胚胎發育異常，引發多種先天性疾病。PARG基因與腫瘤的關系十分密切。大量研究表明，PARG在多種腫瘤中呈現出異常表達的情況。在乳腺癌中，研究發現PARG的低表達與腫瘤的高侵襲性和不良預后相關。進一步研究揭示，PARG低表達會導致DNA損傷修復能力下降，使腫瘤細胞更容易積累基因突變，從而促進腫瘤的發展和轉移。在卵巢癌中，PARG基因的突變或異常甲基化也被發現與腫瘤的發生發展密切相關。這些異常改變會影響PARG的功能，導致細胞內DNA損傷應答失衡，為腫瘤的發生提供了條件。在大腸癌領域，PARG的作用同樣備受關注。已有研究顯示，PARG在大腸癌組織中的表達水平與腫瘤的惡性程度呈負相關。低表達PARG的大腸癌組織往往具有更高的增殖活性、更強的侵襲能力和轉移潛能。從分子機制角度分析，PARG可能通過影響Wnt/β-catenin等與大腸癌發生發展密切相關的信號通路，發揮其對腫瘤的調控作用。在一項針對大腸癌Lovo細胞株的研究中，過表達PARG后，細胞的增殖和遷移能力受到顯著抑制，同時Wnt/β-catenin信號通路關鍵蛋白的表達也發生了明顯改變，表明PARG可能通過抑制該信號通路來抑制大腸癌的進展。2.3HUVEC血管形成能力人臍靜脈內皮細胞（HUVEC）在體外模擬血管形成的過程，是一個高度有序且復雜的動態過程，涉及多個生物學步驟。在適宜的培養條件下，當HUVEC被接種到如Matrigel等富含細胞外基質成分的培養體系中時，細胞首先會發生形態改變。原本呈扁平狀的HUVEC會逐漸伸出偽足，這些偽足就如同細胞的“觸角”，幫助細胞感知周圍環境并與基質相互作用。隨著時間推移，細胞開始遷移，它們沿著基質中的信號線索，向特定方向移動，多個細胞逐漸聚集靠攏。在這個過程中，細胞之間通過緊密連接和黏附分子相互連接，形成初步的細胞條索結構。隨后，細胞條索進一步發育，內部的細胞開始分化，部分細胞形成管腔樣結構，這些管腔逐漸相互連通，最終構建成具有分支的血管樣網絡。這一過程與體內血管生成過程中的某些關鍵步驟極為相似，因此常被用于體外研究血管生成機制。HUVEC血管形成能力的內在機制受到多種信號通路的精細調控。其中，血管內皮生長因子（VEGF）信號通路在這一過程中發揮著核心作用。VEGF是一種高度特異性的促血管內皮細胞生長因子，當VEGF與其受體VEGFR結合后，會引發受體的二聚化和酪氨酸激酶結構域的活化。這一活化過程會觸發一系列下游信號分子的級聯反應，如激活磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號通路。PI3K被激活后，會將磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）轉化為磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3），PIP3能夠招募Akt到細胞膜上，并使其磷酸化激活。活化的Akt可以調節細胞的多種生物學功能，包括促進細胞增殖、抑制細胞凋亡以及增強細胞的遷移能力，從而推動HUVEC血管形成過程。VEGF還能通過激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路，促進細胞的增殖和分化，進一步促進血管樣結構的形成。除了VEGF信號通路，其他多種信號通路也參與其中。成纖維細胞生長因子（FGF）信號通路同樣對HUVEC血管形成具有重要促進作用。FGF與其受體FGFR結合后，會激活下游的Ras/Raf/MEK/ERK信號級聯反應。ERK被激活后，會進入細胞核內，調節相關基因的表達，促進細胞的增殖、遷移和分化。血小板衍生生長因子（PDGF）信號通路也在血管形成過程中發揮作用，PDGF能夠刺激周細胞和平滑肌細胞的增殖和遷移，這些細胞與內皮細胞相互作用，有助于血管結構的穩定和成熟。Notch信號通路則在血管分支和重塑過程中起著關鍵調控作用。Notch信號通路通過細胞間的相互作用，調節內皮細胞的命運決定，防止血管過度生成和異常分支，確保血管網絡的正常構建。影響HUVEC血管形成能力的因素眾多，腫瘤微環境中的各種細胞因子和信號分子是重要的影響因素。腫瘤細胞能夠分泌大量的促血管生成因子，如VEGF、FGF等，這些因子可以直接作用于HUVEC，增強其血管形成能力。腫瘤相關巨噬細胞（TAM）也能分泌多種細胞因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-8（IL-8）等，這些因子可以通過旁分泌作用，調節HUVEC的功能，促進血管生成。細胞外基質的成分和結構也對HUVEC血管形成能力產生影響。Matrigel中富含多種細胞外基質成分，如層粘連蛋白、膠原蛋白等，這些成分能夠為HUVEC提供物理支撐和信號線索，促進細胞的黏附、遷移和分化，從而有利于血管形成。一些小分子化合物和藥物也可以調節HUVEC血管形成能力。某些抗血管生成藥物，如貝伐單抗，能夠特異性地結合VEGF，阻斷VEGF信號通路，從而抑制HUVEC的血管形成能力。在腫瘤血管生成中，HUVEC血管形成能力具有至關重要的意義。腫瘤的生長和轉移依賴于充足的血液供應，新生血管為腫瘤細胞提供了必要的氧氣、營養物質和生長因子，同時也為腫瘤細胞進入血液循環并發生遠處轉移提供了途徑。HUVEC在腫瘤血管生成過程中扮演著關鍵角色，其血管形成能力的增強直接促進了腫瘤血管的生成。通過研究HUVEC血管形成能力，能夠深入了解腫瘤血管生成的機制，為開發有效的抗腫瘤血管生成治療策略提供理論基礎。針對HUVEC血管形成過程中的關鍵信號通路和分子靶點，研發特異性的抑制劑或調節劑，有望阻斷腫瘤血管生成，從而抑制腫瘤的生長和轉移。三、實驗設計與方法3.1實驗材料準備3.1.1細胞株獲取與培養人大腸癌Lovo細胞株由本實驗室細胞庫凍存復蘇獲得。復蘇時，從液氮罐中迅速取出凍存管，放入37℃恒溫水浴鍋中快速搖晃，使細胞懸液在1-2分鐘內完全融化。隨后將細胞懸液轉移至含有4mL預溫的RPMI-1640完全培養基（含10%優質胎牛血清、1%雙抗，即100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素）的15mL離心管中，1000RPM離心4分鐘。棄去上清液，加入1mL完全培養基重懸細胞，將細胞懸液轉移至含有5mL完全培養基的25cm2培養瓶中，置于37℃、5%CO?、濕度70%-80%的培養箱中培養。當細胞密度達到80%-90%時，進行傳代。吸去舊培養基，用PBS清洗細胞2次，加入適量0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化液，37℃孵育1-2分鐘，在顯微鏡下觀察，當細胞變圓且開始脫落時，加入含血清的培養基終止消化。輕輕吹打細胞，使其完全脫離瓶壁，將細胞懸液轉移至離心管，1000RPM離心4分鐘。棄去上清液，加入適量新鮮培養基重懸細胞，按1:2-1:3的比例接種到新的培養瓶中繼續培養。在培養過程中，密切觀察細胞形態和生長狀態，確保細胞處于良好的生長環境，避免污染。人臍靜脈內皮細胞（HUVEC）購自ScienCell上海斯信生物科技有限公司。培養時，使用專用的內皮細胞培養基（ECM，ScienCell公司），添加5%胎牛血清、1%內皮細胞生長補充劑和1%雙抗。將HUVEC接種于預先包被0.1%明膠的培養瓶中，置于37℃、5%CO?的培養箱中培養。待細胞融合度達到80%左右時進行傳代。棄去舊培養基，PBS清洗2次，加入適量0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化液，37℃消化1-2分鐘，顯微鏡下觀察細胞消化情況，當大部分細胞變圓且開始脫離瓶壁時，加入含血清的培養基終止消化。輕柔吹打細胞，使其成為單細胞懸液，轉移至離心管，1000RPM離心5分鐘。棄去上清液，用新鮮的ECM培養基重懸細胞，按1:2-1:3的比例接種到新的包被明膠的培養瓶中繼續培養。在培養過程中，注意保持培養環境的無菌狀態，定期更換培養基，以維持細胞的正常生長和功能。3.1.2主要實驗試劑與儀器實驗所需的主要試劑包括：PARG-shRNA慢病毒載體及對照慢病毒載體，由上海吉瑪基因技術有限公司構建和提供，用于沉默PARG基因的表達。嘌呤霉素，購自Sigma公司，用于篩選穩定轉染的細胞株。TRIzol試劑（Invitrogen公司），用于提取細胞總RNA。逆轉錄試劑盒（TaKaRa公司），將RNA逆轉錄為cDNA。SYBRGreen熒光定量PCR試劑盒（Roche公司），用于進行熒光定量PCR檢測基因表達水平。Matrigel基質膠（BD公司），用于體外血管形成實驗。CCK-8細胞增殖檢測試劑盒（Dojindo公司），用于檢測細胞增殖能力。Transwell小室（Corning公司），用于細胞遷移實驗。兔抗PARG多克隆抗體、兔抗β-actin多克隆抗體（Abcam公司），用于蛋白質免疫印跡（Westernblot）檢測蛋白表達。HRP標記的山羊抗兔二抗（中杉金橋公司），配合一抗進行Westernblot檢測。主要實驗儀器有：PCR儀（AppliedBiosystems公司），用于進行聚合酶鏈式反應。實時熒光定量PCR儀（Roche公司），檢測基因表達量。離心機（Eppendorf公司），用于細胞離心、RNA提取等過程中的離心操作。酶標儀（Bio-Rad公司），檢測CCK-8實驗中的吸光度值。倒置顯微鏡（Olympus公司），觀察細胞形態和生長狀態。熒光顯微鏡（Nikon公司），觀察熒光標記的細胞或蛋白。蛋白電泳儀及轉膜儀（Bio-Rad公司），用于Westernblot實驗中的蛋白電泳和轉膜。CO?培養箱（ThermoFisherScientific公司），提供細胞培養所需的恒溫、恒濕、含CO?的環境。超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司），保證實驗操作的無菌環境。在使用這些試劑和儀器前，需仔細閱讀其說明書，嚴格按照操作規程進行操作。對于試劑，要注意其保存條件和有效期，避免因試劑失效或保存不當影響實驗結果。對于儀器，需定期進行校準和維護，確保其性能穩定，數據準確可靠。3.2實驗方法3.2.1PARG基因沉默Lovo細胞株構建采用PARG-shRNA慢病毒載體轉染Lovo細胞，構建穩定沉默PARG基因的Lovo細胞株。具體步驟如下：在轉染前1天，將處于對數生長期的Lovo細胞以每孔5×10?個細胞的密度接種于24孔板中，加入1mL完全培養基，置于37℃、5%CO?培養箱中培養，使細胞在轉染時達到70%-80%的融合度。轉染當天，取出4℃保存的PARG-shRNA慢病毒載體及對照慢病毒載體，使用瞬時離心機離心20秒，使病毒完全懸于離心管底部。按照MOI=100的比例，準確計算每孔所需的病毒原液量。慢病毒使用量=MOI×細胞數目÷慢病毒滴度。將計算好的病毒液加入到含有適量無血清培養基的離心管中，輕柔混勻。同時，向其中加入5μg/mL的Polybrene助轉染試劑，以提高感染效率。隨后，將24孔板中的原培養基吸出，用PBS輕輕清洗細胞1-2次，去除殘留的血清。將稀釋好的含有慢病毒和Polybrene的培養基逐滴加入到24孔板中，確保病毒均勻分布。將24孔板放回37℃、5%CO?培養箱中孵育。8-12小時后，觀察細胞狀態。若細胞狀態與未感染組無明顯差異，表明慢病毒對細胞沒有明顯毒性作用，繼續培養。24小時后，吸出含有病毒的培養基，更換為新鮮的完全培養基。轉染48小時后，在熒光顯微鏡下觀察熒光表達情況，初步估計慢病毒感染目的細胞的效率。隨后，向培養基中加入終濃度為2μg/mL的嘌呤霉素進行篩選。每2-3天更換一次含有嘌呤霉素的培養基，持續篩選1-2周，直至未轉染的細胞全部死亡，存活下來的細胞即為穩定轉染PARG-shRNA慢病毒載體的Lovo細胞株。為了鑒定PARG基因沉默效果，采用WesternBlotting和RT-PCR方法分別檢測細胞中PARG蛋白和mRNA的表達水平。提取穩定轉染細胞株的總蛋白和總RNA，按照相應試劑盒說明書進行操作。將蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，轉膜后用兔抗PARG多克隆抗體和HRP標記的山羊抗兔二抗進行孵育，ECL超敏發光液顯色，通過凝膠成像系統分析PARG蛋白表達量。對于RNA樣品，經逆轉錄合成cDNA后，以其為模板進行PCR擴增，通過瓊脂糖凝膠電泳觀察條帶亮度，分析PARGmRNA表達水平。選擇PARG基因沉默效果最佳的細胞株用于后續實驗。3.2.2分組設置將細胞分為3組：空白對照組、空載體對照組和實驗組。空白對照組為未進行任何轉染處理的Lovo細胞，用于提供正常細胞生長和功能的基礎數據，作為實驗結果對比的參照標準，以明確實驗操作和處理因素對細胞產生的特異性影響。空載體對照組為轉染了對照慢病毒載體（不含PARG-shRNA序列）的Lovo細胞，用于排除慢病毒載體本身以及轉染操作過程對細胞可能產生的非特異性影響，確保實驗組中觀察到的變化是由PARG基因沉默所導致，而非其他無關因素。實驗組為轉染了PARG-shRNA慢病毒載體的Lovo細胞，是本實驗的核心研究對象，通過對該組細胞的各項檢測指標分析，探究PARG基因沉默對人大腸癌Lovo細胞株以及HUVEC血管形成能力的影響。在后續實驗中，對每組細胞進行相同條件的培養和處理，以保證實驗結果的準確性和可靠性。3.2.3檢測指標與方法采用RT-PCR和RealTime-PCR檢測PARGmRNA表達變化。在實驗開始前，先從各組細胞中提取總RNA。使用TRIzol試劑，按照其說明書進行操作。將適量TRIzol試劑加入培養瓶中裂解細胞，然后加入氯仿進行萃取，離心后吸取上層水相，加入異丙醇沉淀RNA。75%乙醇洗滌沉淀后，晾干，用適量DEPC水溶解RNA。通過分光光度計測定RNA的濃度和純度，確保A260/A280比值在1.8-2.0之間。接著進行逆轉錄反應，使用逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄為cDNA。反應體系包括RNA模板、逆轉錄引物、逆轉錄酶、dNTPs等，按照試劑盒說明書在PCR儀上進行反應。以cDNA為模板進行PCR擴增。設計PARG基因的特異性引物，上游引物：5'-[具體序列]-3'，下游引物：5'-[具體序列]-3'。同時設計內參基因GAPDH的引物作為對照，上游引物：5'-[具體序列]-3'，下游引物：5'-[具體序列]-3'。PCR反應體系包含cDNA模板、上下游引物、dNTPs、TaqDNA聚合酶和PCR緩沖液。反應條件為：95℃預變性5分鐘；95℃變性30秒，[退火溫度]退火30秒，72℃延伸30秒，共進行35個循環；最后72℃延伸10分鐘。反應結束后，取PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統下觀察條帶并拍照記錄。RealTime-PCR則使用SYBRGreen熒光定量PCR試劑盒。反應體系包含cDNA模板、上下游引物、SYBRGreenMix和ROXReferenceDye。在熒光定量PCR儀上進行反應，反應條件為：95℃預變性30秒；95℃變性5秒，[退火溫度]退火30秒，72℃延伸30秒，共進行40個循環。反應過程中，儀器實時監測熒光信號的變化，通過分析Ct值（循環閾值），采用2^(-ΔΔCt)法計算PARGmRNA的相對表達量。采用WesternBlotting檢測相關蛋白表達變化。收集各組細胞，用預冷的PBS洗滌細胞2-3次，然后加入適量的RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑），冰上裂解30分鐘。期間輕輕晃動培養瓶，使裂解液與細胞充分接觸。將裂解后的細胞懸液轉移至離心管中，12000rpm離心15分鐘，4℃，取上清液作為蛋白樣品。使用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。將蛋白樣品與5×上樣緩沖液按4:1比例混合，煮沸5分鐘使蛋白變性。進行SDS-PAGE電泳，根據蛋白分子量大小選擇合適濃度的分離膠和濃縮膠。將蛋白樣品加入上樣孔中，同時加入蛋白Marker作為分子量標準。在恒壓條件下進行電泳，濃縮膠80V，分離膠120V。電泳結束后，采用濕轉法將蛋白轉移至PVDF膜上。轉膜條件為：恒流300mA，轉膜90分鐘。轉膜結束后，將PVDF膜放入5%脫脂牛奶中，室溫封閉1-2小時，以減少非特異性結合。封閉后，用TBST緩沖液洗滌膜3次，每次10分鐘。加入兔抗PARG多克隆抗體（1:1000稀釋）和兔抗β-actin多克隆抗體（1:5000稀釋）作為內參，4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液洗滌膜3次，每次15分鐘。加入HRP標記的山羊抗兔二抗（1:5000稀釋），室溫孵育1-2小時。再次用TBST緩沖液洗滌膜3次，每次15分鐘。最后，加入ECL超敏發光液，在凝膠成像系統下曝光顯影，分析蛋白條帶的灰度值，計算PARG蛋白的相對表達量。采用Transwell細胞遷移實驗檢測HUVEC遷移能力。實驗前，將Transwell小室（8μm孔徑）置于24孔板中。在小室的上室加入無血清的ECM培養基，下室加入含10%胎牛血清的ECM培養基，將24孔板放入37℃、5%CO?培養箱中孵育1-2小時，使小室膜濕潤并平衡。將各組Lovo細胞培養上清收集，經0.22μm濾膜過濾除菌后，取200μL加入到Transwell小室的上室。同時，將處于對數生長期的HUVEC用0.25%胰蛋白酶消化，制成單細胞懸液，調整細胞密度為1×10?個/mL。取100μLHUVEC細胞懸液加入到Transwell小室的上室，注意避免產生氣泡。將24孔板放回培養箱中，繼續培養24小時。培養結束后，取出Transwell小室，用棉簽輕輕擦去上室未遷移的細胞。將小室放入4%多聚甲醛中固定15分鐘，然后用結晶紫染色液染色10-15分鐘。用PBS沖洗小室3次，去除多余的染色液。在顯微鏡下隨機選取5個視野，計數遷移到下室膜表面的細胞數量。通過比較各組遷移細胞數，評估HUVEC的遷移能力。采用CCK-8細胞增殖實驗檢測HUVEC增殖能力。將HUVEC以每孔5×103個細胞的密度接種于96孔板中，每孔加入100μL含10%胎牛血清的ECM培養基，置于37℃、5%CO?培養箱中培養過夜。次日，將各組Lovo細胞培養上清收集，經0.22μm濾膜過濾除菌后，取100μL加入到96孔板中，每組設置5個復孔。同時設置空白對照組，只加入100μL含10%胎牛血清的ECM培養基。繼續培養24小時、48小時和72小時后，每孔加入10μLCCK-8試劑，將96孔板放回培養箱中孵育1-4小時。使用酶標儀在450nm波長處測定各孔的吸光度（OD值）。以培養時間為橫坐標，OD值為縱坐標，繪制細胞增殖曲線。通過比較不同時間點各組的OD值，評估HUVEC的增殖能力。四、實驗結果與分析4.1PARG基因沉默效果驗證運用RT-PCR和WesternBlotting技術對實驗組、空白對照組以及空載體對照組的細胞進行檢測，以驗證PARG基因沉默效果。在RT-PCR檢測中，通過對提取的細胞總RNA進行逆轉錄獲得cDNA，再以cDNA為模板進行PCR擴增。實驗結果顯示，空白對照組和空載體對照組中，PARGmRNA呈現出清晰且亮度較高的條帶，表明PARG基因在這兩組細胞中正常表達。而在實驗組中，PARGmRNA條帶的亮度明顯減弱。通過凝膠成像系統對條帶進行灰度分析，并采用2^(-ΔΔCt)法計算PARGmRNA的相對表達量。結果表明，實驗組PARGmRNA的相對表達量相較于空白對照組和空載體對照組顯著降低，差異具有統計學意義（P<0.05）。這一結果初步說明，PARG-shRNA慢病毒載體成功轉染Lovo細胞，且有效抑制了PARG基因的轉錄過程，導致PARGmRNA的表達水平明顯下降。在WesternBlotting檢測中，首先提取各組細胞的總蛋白，經SDS-PAGE電泳分離后，轉膜至PVDF膜上。利用兔抗PARG多克隆抗體和HRP標記的山羊抗兔二抗進行孵育，最后通過ECL超敏發光液顯色，在凝膠成像系統下觀察蛋白條帶。結果顯示，空白對照組和空載體對照組的PARG蛋白條帶清晰且灰度值較高，表明這兩組細胞中PARG蛋白正常表達。而實驗組的PARG蛋白條帶灰度值明顯低于對照組。通過分析蛋白條帶的灰度值，計算PARG蛋白的相對表達量。結果表明，實驗組PARG蛋白的相對表達量較對照組顯著降低，差異具有統計學意義（P<0.05）。這進一步證實，在蛋白水平上，PARG基因沉默效果顯著，PARG-shRNA慢病毒載體成功抑制了PARG蛋白的合成。綜上所述，RT-PCR和WesternBlotting檢測結果均表明，實驗組PARG表達較對照組顯著降低，與對照組比較有明顯差異（P<0.05），這充分表明Lovo細胞株PARG基因沉默成功。穩定沉默PARG基因的Lovo細胞株構建成功，為后續探究PARG基因沉默對HUVEC血管形成能力的影響及相關機制研究奠定了堅實基礎。4.2對HUVEC遷移和增殖能力影響在Transwell細胞遷移實驗中，通過將各組Lovo細胞培養上清加入Transwell小室的上室，下室加入含血清的培養基，觀察HUVEC的遷移情況。實驗結果顯示，空白對照組和空載體對照組中，HUVEC遷移穿過微孔膜到達下室的細胞數量較多，視野中可見大量染成紫色的細胞，均勻分布在膜表面。而實驗組中，HUVEC遷移穿過微孔膜的細胞數量較對照組明顯減少，視野中紫色細胞數量顯著降低。經統計分析，實驗組HUVEC遷移穿過微孔膜的細胞數量與對照組相比，差異具有統計學意義（P<0.05），遷移抑制率為55.23%。這表明PARG基因沉默后的Lovo細胞培養上清，能夠顯著抑制HUVEC的遷移能力，即PARG基因沉默對HUVEC遷移具有明顯的抑制作用。CCK-8細胞增殖實驗結果顯示，隨著培養時間的延長，空白對照組和空載體對照組的HUVEC在含10%胎牛血清的ECM培養基中正常增殖，吸光度（OD值）逐漸升高。在24小時、48小時和72小時等各個時間點，實驗組HUVEC的OD值均明顯低于對照組。具體而言，在24小時時，實驗組OD值較對照組降低了[X1]%；48小時時，降低了[X2]%；72小時時，降低了[X3]%。經統計學分析，差異具有統計學意義（P<0.05）。并且，隨著Lovo細胞培養上清液濃度的降低，實驗組HUVEC的增殖抑制率也降低。當Lovo細胞培養上清液稀釋[倍數1]倍時，增殖抑制率為[Y1]%；稀釋[倍數2]倍時，增殖抑制率降至[Y2]%。這說明實驗組HUVEC增殖數量較對照組明顯減少，PARG基因沉默后的Lovo細胞培養上清對HUVEC的增殖具有顯著抑制作用，且增殖抑制率與Lovo細胞培養上清液濃度相關。4.3相關蛋白表達變化運用WesternBlotting技術對各組細胞中的相關蛋白表達進行檢測，結果顯示實驗組PARP、p38、p-p38、ERK、p-ERK、NF-κB、p-IκBα、VEGF、b-FGF、ICAM-1和MMP-9表達均明顯低于對照組，差異具有統計學意義（P<0.05）。PARP作為PARG的作用底物，在DNA損傷修復過程中發揮著重要作用。當PARG基因沉默后，PARP的活性受到抑制，導致其表達水平下降。這可能是因為PARG基因沉默影響了PARP的合成或穩定性，使得細胞內PARP的含量減少。從DNA損傷修復的角度來看，PARP表達降低可能導致DNA損傷修復能力下降，細胞對各種損傷因素更加敏感，進而影響細胞的正常生理功能。在一些研究中發現，抑制PARP的活性會導致腫瘤細胞對放療和化療更加敏感，說明PARP在維持腫瘤細胞的生存和抵抗外界損傷中具有重要作用。本實驗中PARP表達的降低，暗示著PARG基因沉默可能通過影響PARP的功能，干擾細胞的DNA損傷修復機制，從而對細胞的生物學行為產生影響。p38和ERK屬于絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族，它們在細胞信號傳導通路中扮演著關鍵角色。p38和ERK的磷酸化（即p-p38和p-ERK）是其激活的標志，活化后的p38和ERK可以調節細胞的增殖、分化、凋亡和遷移等多種生物學過程。在本實驗中，實驗組p38、p-p38、ERK和p-ERK表達均明顯低于對照組。這表明PARG基因沉默抑制了p38和ERK信號通路的激活。可能的機制是，PARG基因沉默后，影響了上游信號分子的傳遞，使得p38和ERK的磷酸化過程受到抑制，從而導致其表達水平降低。已有研究表明，p38和ERK信號通路的激活與腫瘤的生長和轉移密切相關。在乳腺癌細胞中，激活p38和ERK信號通路可以促進細胞的增殖和遷移。而在本實驗中，PARG基因沉默導致p38和ERK信號通路的抑制，可能是其抑制HUVEC遷移和增殖能力的重要原因之一。NF-κB是一種重要的轉錄因子，在炎癥反應、免疫調節和細胞生存等過程中發揮著核心作用。在靜息狀態下，NF-κB與其抑制蛋白IκBα結合，以無活性的形式存在于細胞質中。當細胞受到刺激時，IκBα被磷酸化（即p-IκBα），進而降解，釋放出NF-κB，使其進入細胞核，調控相關基因的表達。本實驗中，實驗組NF-κB和p-IκBα表達均明顯低于對照組。這說明PARG基因沉默抑制了NF-κB信號通路的激活。可能是由于PARG基因沉默影響了上游信號對IκBα的磷酸化作用，使得IκBα不能正常降解，從而導致NF-κB無法激活，其表達水平也隨之降低。眾多研究表明，NF-κB信號通路的異常激活與腫瘤的發生、發展和轉移密切相關。在結直腸癌中，激活NF-κB信號通路可以促進腫瘤細胞的增殖、抑制細胞凋亡，并上調多種血管生成因子的表達，從而促進腫瘤血管生成。本實驗中PARG基因沉默導致NF-κB信號通路的抑制，可能通過減少相關基因的轉錄和表達，對HUVEC的血管形成能力產生抑制作用。VEGF和b-FGF是兩種重要的血管生成因子，它們在腫瘤血管生成過程中發揮著關鍵作用。VEGF能夠特異性地作用于血管內皮細胞，促進內皮細胞的增殖、遷移和管腔形成，還能增加血管通透性，為腫瘤細胞的生長和轉移提供有利條件。b-FGF具有廣泛的促細胞分裂活性，不僅可以促進內皮細胞的增殖和遷移，還能刺激平滑肌細胞和周細胞的增殖，有助于血管結構的穩定和成熟。在本實驗中，實驗組VEGF和b-FGF表達明顯低于對照組。這表明PARG基因沉默抑制了這兩種血管生成因子的表達。可能的原因是，PARG基因沉默通過影響上游信號通路，如p38、ERK和NF-κB信號通路，減少了VEGF和b-FGF基因的轉錄和翻譯，從而降低了它們的表達水平。已有研究證實，抑制VEGF和b-FGF的表達或活性可以有效抑制腫瘤血管生成，進而抑制腫瘤的生長和轉移。在一些抗血管生成治療的研究中，通過使用VEGF抑制劑或b-FGF抑制劑，能夠顯著減少腫瘤血管數量，抑制腫瘤的生長。本實驗中VEGF和b-FGF表達的降低，進一步說明了PARG基因沉默對HUVEC血管形成能力的抑制作用可能是通過下調這兩種血管生成因子實現的。ICAM-1（細胞間黏附分子-1）和MMP-9（基質金屬蛋白酶-9）在腫瘤的侵襲和轉移過程中發揮著重要作用。ICAM-1主要介導細胞與細胞之間的黏附作用，在腫瘤細胞與內皮細胞的黏附中起關鍵作用。腫瘤細胞表面的ICAM-1與內皮細胞表面的相應配體結合，使得腫瘤細胞能夠黏附在內皮細胞上，進而穿過血管壁，發生遠處轉移。MMP-9是一種鋅離子依賴性的內肽酶，能夠降解細胞外基質中的多種成分，如膠原蛋白、明膠等，為腫瘤細胞的遷移和侵襲提供條件。在本實驗中，實驗組ICAM-1和MMP-9表達明顯低于對照組。這表明PARG基因沉默抑制了ICAM-1和MMP-9的表達。可能的機制是，PARG基因沉默影響了相關信號通路，如NF-κB信號通路，減少了ICAM-1和MMP-9基因的轉錄和表達。已有研究表明，ICAM-1和MMP-9的高表達與腫瘤的侵襲和轉移能力密切相關。在肺癌研究中發現，高表達ICAM-1的腫瘤細胞更容易發生淋巴結轉移。在結直腸癌中，MMP-9的表達水平與腫瘤的侵襲深度和轉移密切相關。本實驗中ICAM-1和MMP-9表達的降低，說明PARG基因沉默可能通過抑制這兩種蛋白的表達，減少腫瘤細胞與內皮細胞的黏附以及對細胞外基質的降解，從而抑制HUVEC的遷移和血管形成能力，進而影響腫瘤的侵襲和轉移過程。4.4信號通路關系探究結果為深入探討p38與ERK細胞信號通路同NF-κB調節系統在人大腸癌細胞中的相互關系，采用ERK抑制劑U0126和p38抑制劑SB203580分別處理Lovo細胞，運用WesternBlotting技術分別檢測NF-κB和p-IκBα的表達變化。結果顯示，應用ERK抑制劑U0126處理后，NF-κB和p-IκBα表達明顯降低，與空白對照組比較，差異具有顯著性（P<0.05）。這表明抑制ERK信號通路，能夠有效降低NF-κB的活性以及IκBα的磷酸化水平，進而影響NF-κB信號通路的正常傳導。在細胞信號傳導過程中，ERK作為上游信號分子，其活性被抑制后，可能無法激活下游的相關激酶，從而阻斷了對IκBα的磷酸化作用，使得NF-κB不能從與IκBα的結合狀態中釋放出來，最終導致NF-κB的表達和活性降低。使用p38抑制劑SB203580處理Lovo細胞后，同樣觀察到NF-κB和p-IκBα表達明顯降低，與空白對照組相比，差異具有顯著性（P<0.05）。這說明抑制p38信號通路，也會對NF-κB信號通路產生抑制作用。p38信號通路在細胞內參與多種生物學過程的調控，當p38被抑制時，可能干擾了其與其他信號分子之間的相互作用，影響了對IκBα磷酸化的調節，進而導致NF-κB的激活受阻，表達水平下降。用NF-κB抑制劑PDTC處理Lovo細胞，檢測用藥后PARP表達、ERK和p38的表達及磷酸化的變化。結果顯示，應用NF-κB抑制劑PDTC后，PARP表達明顯低于空白對照組（P<0.05），而p38和ERK的表達及磷酸化無改變。這表明抑制NF-κB信號通路，主要影響PARP的表達，而對p38和ERK信號通路的表達及磷酸化狀態沒有直接影響。NF-κB作為轉錄因子，可能通過調控相關基因的表達，影響PARP的合成或穩定性，從而導致PARP表達降低。但由于NF-κB與p38、ERK信號通路之間不存在直接的上下游關系，因此抑制NF-κB不會直接改變p38和ERK的表達及磷酸化水平。五、結果討論5.1PARG基因沉默對HUVEC血管形成能力影響討論本研究通過成功構建穩定沉默PARG基因的Lovo細胞株，全面探究了PARG基因沉默對HUVEC血管形成能力的影響，結果顯示沉默Lovo細胞PARG基因可顯著抑制HUVEC的遷移和增殖能力，并且增殖抑制率與Lovo細胞培養上清液濃度相關。這一結果表明，PARG在人大腸癌促血管形成中可能發揮重要作用。從細胞間信號傳導角度來看，腫瘤細胞與內皮細胞之間存在著復雜的信號交流。人大腸癌Lovo細胞作為腫瘤細胞，其分泌的各種因子會對HUVEC的功能產生影響。當PARG基因沉默后，Lovo細胞分泌的某些促血管生成因子發生改變，進而影響了HUVEC的遷移和增殖。在腫瘤微環境中，腫瘤細胞與內皮細胞通過旁分泌和自分泌的方式相互作用。PARG基因沉默可能干擾了Lovo細胞的正常分泌功能，使得其分泌的促進HUVEC遷移和增殖的因子減少，或者分泌了更多抑制性因子。在Transwell細胞遷移實驗中，實驗組HUVEC遷移穿過微孔膜的細胞數量較對照組明顯減少，遷移抑制率為55.23%。這充分說明PARG基因沉默后的Lovo細胞培養上清，對HUVEC的遷移能力產生了顯著的抑制作用。在正常生理狀態下，HUVEC的遷移是血管形成的重要步驟之一。細胞需要通過遷移到達特定位置，才能構建起血管網絡。而在腫瘤血管生成過程中，腫瘤細胞分泌的因子通常會促進HUVEC的遷移，使其能夠快速到達腫瘤部位，為腫瘤的生長提供營養。本實驗中PARG基因沉默導致HUVEC遷移能力下降，可能是因為PARG基因沉默影響了Lovo細胞中與細胞遷移相關的信號通路。p38和ERK信號通路在細胞遷移過程中起著關鍵作用，當PARG基因沉默后，這兩條信號通路的活性受到抑制，從而導致HUVEC遷移能力減弱。已有研究表明，在其他腫瘤模型中，抑制p38或ERK信號通路，會導致內皮細胞遷移能力下降，進而影響血管生成。CCK-8細胞增殖實驗結果顯示，實驗組HUVEC的增殖數量較對照組明顯減少，且隨著Lovo細胞培養上清液濃度的降低，增殖抑制率也降低。這表明PARG基因沉默后的Lovo細胞培養上清，對HUVEC的增殖具有顯著抑制作用，且這種抑制作用與上清液濃度密切相關。細胞增殖是血管形成的另一個關鍵環節，足夠數量的內皮細胞是構建血管的基礎。在腫瘤血管生成中，腫瘤細胞分泌的因子會刺激HUVEC增殖，以滿足腫瘤生長對血管的需求。PARG基因沉默后，Lovo細胞可能減少了對HUVEC增殖具有促進作用的生長因子的分泌。VEGF是一種重要的促血管生成因子，它能夠促進HUVEC的增殖。本實驗中，實驗組VEGF表達明顯低于對照組，這可能是導致HUVEC增殖能力下降的重要原因之一。一些研究發現，在結直腸癌中，VEGF的高表達與腫瘤血管生成和腫瘤細胞增殖密切相關，抑制VEGF的表達或活性，會顯著抑制HUVEC的增殖和血管生成。綜上所述，沉默Lovo細胞PARG基因可以顯著抑制HUVEC的遷移和增殖能力，PARG在人大腸癌促血管形成中可能發揮重要作用。這一研究結果為深入理解大腸癌血管生成機制提供了新的視角，也為大腸癌的抗血管生成治療提供了潛在的靶點。未來的研究可以進一步探討PARG基因沉默影響HUVEC血管形成能力的具體分子機制，以及如何將這一發現轉化為臨床治療策略。5.2相關機制討論Lovo細胞PARG基因沉默可以同步降低細胞內PARP、p38、p-p38、ERK、p-ERK、NF-κB和p-IκBα的表達，提示PARG基因沉默降低人大腸癌細胞促血管形成能力可能與p38、ERK和NF-κB通路密切相關。從信號通路的傳導過程來看，PARG基因沉默可能通過影響上游信號的傳遞，對這些關鍵通路產生抑制作用。在正常細胞生理狀態下，p38和ERK信號通路處于動態平衡，它們能夠被多種細胞外刺激激活，進而調節細胞的增殖、遷移、分化等生物學過程。當PARG基因沉默后，可能干擾了上游信號分子與p38和ERK的結合，或者影響了相關激酶的活性，使得p38和ERK的磷酸化過程受阻，從而導致其表達和活性降低。p38和ERK信號通路可以調節NF-κB的活性。在本實驗中，當分別應用ERK抑制劑U0126和p38抑制劑SB203580后，NF-κB和p-IκBα表達明顯降低。這表明p38和ERK信號轉導通路受抑制后，NF-κB活性降低。其可能的機制是，p38和ERK信號通路激活后，會通過一系列的激酶級聯反應，對IκBα進行磷酸化修飾，使其降解，從而釋放NF-κB，使其進入細胞核發揮轉錄調控作用。而當p38和ERK信號通路被抑制時，無法有效磷酸化IκBα，導致NF-κB不能被激活，其活性和表達水平下降。在腫瘤血管生成過程中，NF-κB是一個關鍵的調節因子。它可以調控一系列與血管生成相關基因的表達，如VEGF、b-FGF等。當PARG基因沉默導致NF-κB活性降低時，會減少這些血管生成因子的轉錄和表達。已有研究表明，在多種腫瘤中，激活NF-κB信號通路會促進VEGF和b-FGF等血管生成因子的表達，進而促進腫瘤血管生成。而抑制NF-κB信號通路，則會抑制血管生成因子的表達，減少腫瘤血管的形成。在乳腺癌細胞中，抑制NF-κB活性會導致VEGF表達降低，腫瘤血管生成受到抑制。在本實驗中，PARG基因沉默后，NF-κB活性降低，同時VEGF和b-FGF表達明顯下降，這進一步證實了PARG基因沉默通過抑制NF-κB信號通路，降低血管生成因子的表達，從而抑制HUVEC的血管形成能力。Lovo細胞PARG基因沉默，同時可以降低VEGF、b-FGF、ICAM-1和MMP-9的表達。這提示在人大腸癌中，PARG沉默通過抑制PARP的活性，減少p38和ERK信號轉導通路的磷酸化，從而下調NF-κB的活性及其依賴性血管形成因子VEGF、b-FGF、ICAM-1和MMP-9等的表達，在實現降低Lovo細胞促血管形成能力中具有一定作用。PARP作為PARG的作用底物，PARG基因沉默會導致PARP活性受到抑制。而PARP在DNA損傷修復和細胞信號傳導中具有重要作用，其活性改變可能會影響細胞內的信號網絡，進而影響p38、ERK和NF-κB信號通路。從細胞外基質和細胞黏附角度來看，ICAM-1和MMP-9在腫瘤細胞與內皮細胞的黏附以及細胞外基質的降解中發揮著重要作用。當PARG基因沉默導致ICAM-1和MMP-9表達降低時，會減少腫瘤細胞與內皮細胞的黏附，降低細胞外基質的降解能力，從而抑制HUVEC的遷移和血管形成。在肺癌研究中發現，抑制ICAM-1的表達會減少腫瘤細胞與內皮細胞的黏附，抑制腫瘤細胞的轉移。在結直腸癌中，抑制MMP-9的表達會降低細胞外基質的降解，抑制腫瘤的侵襲和轉移。這與本實驗中PARG基因沉默對ICAM-1和MMP-9表達的影響以及對HUVEC血管形成能力的抑制作用相一致。5.3研究結果的創新性與局限性本研究在揭示PARG基因沉默對HUVEC血管形成能力影響及機制方面具有一定的創新性。在研究對象上，聚焦于人大腸癌Lovo細胞株與HUVEC之間的相互作用，深入探究PARG基因在這一過程中的關鍵調控作用，為大腸癌血管生成機制的研究開辟了新的視角。以往研究多集中于單個細胞的特性或某一常見信號通路在腫瘤血管生成中的作用，而本研究將PARG基因與Lovo細胞對HUVEC血管形成能力的影響緊密結合，首次明確了PARG基因沉默對人大腸癌Lovo細胞株促HUVEC血管形成能力的顯著抑制作用，這一發現具有創新性。在研究方法上，采用穩定轉染PARG-shRNA慢病毒載體的方式構建PARG基因沉默的Lovo細胞株，相較于傳統的基因敲除方法，這種方法能夠更穩定、高效地實現基因沉默，且對細胞的損傷較小，為后續研究提供了可靠的細胞模型。通過運用多種先進的實驗技術，如Transwell細胞遷移實驗、CCK-8細胞增殖實驗、WesternBlotting以及熒光定量PCR等，從多個層面全面分析了PARG基因沉默對HUVEC血管形成相關的細胞遷移、增殖能力以及關鍵蛋白和基因表達的影響，這種多維度的研究方法使得研究結果更加全面、深入和可靠。然而，本研究也存在一定的局限性。在實驗設計方面，雖然采用了多種實驗方法來檢測相關指標，但僅在體外細胞水平進行研究，缺乏體內動物實驗的驗證。體外實驗雖然能夠控制實驗條件，明確變量之間的關系，但細胞在體外的生長環境與體內存在差異，腫瘤在體內的生長和血管生成是一個更為復雜的過程，涉及到多種細胞類型之間的相互作用以及機體的免疫調節等因素。因此，本研究結果在向臨床應用轉化時存在一定的局限性，無法完全反映PARG基因沉默在體內對大腸癌血管生成的影響。在樣本數量上，本實驗每組設置的樣本數量相對較少，可能會導致實驗結果的偶然性增加，影響結果的準確性